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Article de méthode

Réalisation de myographie d’impédance électrique in vivo et ex vivo chez les rongeurs

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DOI :

10.3791/63513

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8 juin 2022

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1Department of Neurology, Harvard Medical School - Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Accelerating NeuroVentures, 3Charley's Fund

Dans cet article

Résumé

Cet article explique comment effectuer une myographie d’impédance électrique in vivo (à l’aide de réseaux d’électrodes de surface et à aiguilles) et ex vivo (à l’aide d’une cellule diélectrique) sur le muscle gastrocnémien du rongeur. Il démontrera la technique chez les souris et les rats et détaillera les modifications disponibles (c.-à-d. animaux obèses, petits).

Résumé

La myographie d’impédance électrique (MIE) est une technique pratique qui peut être utilisée dans les études précliniques et cliniques pour évaluer la santé et la maladie des tissus musculaires. L’EIM est obtenue en appliquant un courant électrique de faible intensité, focalisé directionnellement, à un muscle d’intérêt sur une gamme de fréquences (c.-à-d. de 1 kHz à 10 MHz) et en enregistrant les tensions résultantes. À partir de ceux-ci, plusieurs composants d’impédance standard, y compris la réactance, la résistance et la phase, sont obtenus. Lors de la réalisation de mesures ex vivo sur un muscle excisé, les propriétés électriques passives inhérentes du tissu, à savoir la conductivité et la permittivité relative, peuvent également être calculées. L’EIM a été largement utilisée chez les animaux et les humains pour diagnostiquer et suivre les altérations musculaires dans diverses maladies, en relation avec une simple atrophie de désuétude, ou comme mesure d’intervention thérapeutique. Sur le plan clinique, l’EIM offre la possibilité de suivre la progression de la maladie au fil du temps et d’évaluer l’impact des interventions thérapeutiques, offrant ainsi la possibilité de raccourcir la durée des essais cliniques et de réduire les exigences relatives à la taille des échantillons. Parce qu’il peut être réalisé de manière non invasive ou peu invasive dans des modèles animaux vivants ainsi que chez l’homme, EIM offre le potentiel de servir de nouvel outil translationnel permettant à la fois le développement préclinique et clinique. Cet article fournit des instructions étape par étape sur la façon d’effectuer des mesures EIM in vivo et ex vivo chez la souris et le rat, y compris des approches pour adapter les techniques à des conditions spécifiques, telles que l’utilisation chez les chiots ou les animaux obèses.

Introduction

La myographie d’impédance électrique (MIE) fournit une méthode puissante pour évaluer l’état musculaire, permettant potentiellement le diagnostic des troubles neuromusculaires, le suivi de la progression de la maladie et l’évaluation de la réponse au traitement 1,2,3. Il peut être appliqué de manière analogue aux modèles de maladies animales et aux humains, ce qui permet une traduction relativement transparente des études précliniques aux études cliniques. Les mesures EIM sont facilement obtenues à l’aide de quatre électrodes placées linéairement, les deux électrodes externes appliquant un courant électrique faible et indolore sur une gamme de fréquences (généralement entre 1 kHz et environ 2 MHz), et les deux électrodes internes enregistrant les tensions résultantes1. À partir de ces tensions, les caractéristiques d’impédance du tissu peuvent être obtenues, y compris la résistance (R), une mesure de la difficulté pour le courant de traverser le tissu, et la réactance (X) ou « chargeabilité » du tissu, une mesure liée à la capacité du tissu à stocker la charge (capacité). À partir de la réactance et de la résistance, l’angle de phase (θ) est calculé via l’équation suivante: figure-introduction-1, fournissant une seule mesure d’impédance sommative. De telles mesures peuvent être obtenues à l’aide de n’importe quel dispositif de bioimpédance multifréquence. Comme les myofibres sont essentiellement de longs cylindres, le tissu musculaire est également très anisotrope, le courant circulant plus facilement le long des fibres qu’à travers elles 4,5. Ainsi, l’EIM est souvent effectuée dans deux directions: avec le réseau placé le long des fibres de telle sorte que le courant leur soit parallèle, et à travers le muscle de telle sorte que le courant circule perpendiculairement à elles. De plus, dans les mesures ex vivo, où un volume connu de tissu est mesuré dans une cellule de mesure d’impédance, les propriétés électriques inhérentes du muscle (c’est-à-dire la conductivité et la permittivité relative) peuvent être déduites6.

Le terme « troubles neuromusculaires » définit un large éventail de maladies primaires et secondaires qui entraînent une altération et un dysfonctionnement musculaire structurel. Cela comprend la sclérose latérale amyotrophique et diverses formes de dystrophie musculaire, ainsi que des changements plus simples liés au vieillissement (p. ex. sarcopénie), à l’atrophie de la désuétude (p. ex. en raison d’un alitement prolongé ou de la microgravité) ou même à une blessure7. Bien que les causes soient nombreuses et puissent provenir du motoneurone, des nerfs, des jonctions neuromusculaires ou du muscle lui-même, l’EIM peut être utilisée pour détecter les altérations précoces du muscle dues à bon nombre de ces processus et pour suivre la progression ou la réponse au traitement. Par exemple, chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), il a été démontré que l’EIM détecte la progression de la maladie et la réponse aux corticostéroïdes8. Des travaux récents ont également montré que l’EIM est sensible à divers états de désuétude, y compris la gravité fractionnée9, comme ce serait le cas sur la Lune ou Mars, et les effets du vieillissement10,11. Enfin, en appliquant des algorithmes prédictifs et d’apprentissage automatique à l’ensemble de données obtenues à chaque mesure (données multifréquences et directionnellement dépendantes), il devient possible de déduire les aspects histologiques du tissu, y compris la taille des myofibres 12,13, les changements inflammatoires et l’œdème 14, et la teneur en tissu conjonctif et en graisse 15,16.

Plusieurs autres méthodes non invasives ou mini-invasives sont également utilisées pour évaluer la santé musculaire chez les humains et les animaux, y compris l’électromyographie à l’aiguille17 et les technologies d’imagerie telles que l’imagerie par résonance magnétique, la tomographie informatisée et l’échographie18,19. Cependant, EIM présente des avantages distincts par rapport à ces technologies. Par exemple, l’électromyographie enregistre uniquement les propriétés électriques actives des membranes myofibreuses et non les propriétés passives, et ne peut donc pas fournir une véritable évaluation de la composition ou de la structure musculaire. À certains égards, les méthodes d’imagerie sont plus étroitement liées à l’EIM, car elles fournissent également des informations sur la structure et la composition des tissus. Mais dans un certain sens, ils fournissent trop de données, nécessitant une segmentation détaillée des images et une analyse d’experts plutôt que de simplement fournir une sortie quantitative. De plus, compte tenu de leur complexité, les techniques d’imagerie sont également grandement influencées par les spécificités du matériel et des logiciels utilisés, ce qui nécessite idéalement l’utilisation de systèmes identiques afin que les ensembles de données puissent être comparés. En revanche, le fait que l’EIM soit beaucoup plus simple signifie qu’il est moins impacté par ces problèmes techniques et ne nécessite aucune forme de traitement d’image ou d’expertise.

Le protocole suivant montre comment effectuer une EIM in vivo chez le rat et la souris, en utilisant à la fois des techniques non invasives (réseau de surface) et mini-invasives (réseau d’aiguilles sous-cutanées), ainsi que des EIM ex vivo sur des muscles fraîchement excisés.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Beth Israel Deaconess Medical Center sous les numéros de protocole (031-2019; 025-2019). Portez un équipement de protection individuelle approprié pour manipuler les animaux et respectez les directives de l’IACUC pour tous les travaux sur les animaux.

1. EIM de surface in vivo

  1. Placez l’animal dans une boîte d’anesthésie pour induire l’anesthésie.
    NOTA : Pour les rats, 1,5 % à 3,5 % d’isoflurane et 2 O 2 L·min-1 ont été utilisés, et pour les souris, 2 % d’isoflurane et 1 O2 L·min-1 ont été utilisés.
  2. Une fois complètement anesthésié, comme indiqué par l’absence de réponse après avoir pincé le pied de l’animal, placez la souris sur le banc en position couchée et utilisez le cône nasal pour maintenir l’anesthésie en utilisant 1,5% d’isoflurane et un débit d’oxygène de 1 L·min-1.
  3. Placez la patte de l’animal à analyser à un angle de 45° avec l’articulation de la hanche (genou tendu) et fixez le pied avec du ruban médical.
  4. Utilisez une tondeuse à cheveux pour couper la fourrure recouvrant le muscle gastrocnémien.
  5. Appliquez une épaisse couche de crème dépilatoire sur la peau de l’animal et laissez-le reposer pendant 1 min. Ensuite, utilisez de la gaze saturée de solution saline pour éliminer l’agent dépilatoire. Répétez ce processus jusqu’à trois fois jusqu’à ce que toute la fourrure recouvrant le muscle gastrocnémien soit enlevée.
    REMARQUE: Placez un tampon de gaze imbibé de solution saline sur la peau lorsque les mesures ne sont pas acquises pour prévenir la déshydratation de la peau.
  6. Connectez le réseau de surface (Figure 1) au dispositif EIM et laissez les électrodes reposer sur un morceau de gaze imbibé d’une solution saline.
  7. Placez le réseau de surfaces directement sur la peau au-dessus du muscle gastrocnémien, orienté longitudinalement vers les fibres musculaires.
  8. Après avoir vérifié le contact approprié, qui est indiqué par toutes les barres apparaissant en vert sur le logiciel montrant la stabilité de la résistance, de la réactance et des valeurs de phase de 50 kHz, obtenez les mesures EIM.
    REMARQUE: Les courbes doivent être vérifiées en temps réel pour assurer une bonne acquisition des données.
  9. Faire pivoter la matrice de surface de 90° et la repositionner sur la peau au-dessus du gastrocnémien pour obtenir les mesures transversales (vérifier les barres vertes indiquant la stabilité).
  10. Répétez les étapes 1.7, 1.8 et 1.9 pour obtenir un total de quatre mesures par muscle: deux longitudinales et deux transversales.
    REMARQUE : N’utilisez pas d’agent dépilatoire plus d’une fois (c.-à-d. jusqu’à trois applications dans le même cas) toutes les deux semaines pour prévenir une irritation et une blessure cutanées excessives. Il est important d’effectuer les mesures dans les 5 à 10 minutes suivant le retrait de la crème dépilatoire, car le développement d’un œdème cutané localisé induit par l’agent dépilatoire peut avoir un impact sur les données d’impédance collectées. La récupération de l’animal est immédiate après l’arrêt de l’anesthésie à l’isoflurane et la procédure ne nécessite pas de traitement analgésique.

2. EIM in vivo du réseau d’aiguilles

  1. Anesthésier l’animal et préparer la cuisse en suivant la même procédure que celle décrite aux étapes 1.1 à 1.4. Cependant, il n’est pas nécessaire d’utiliser un agent dépilatoire lors de la réalisation d’EIM in vivo à l’aide d’un réseau d’aiguilles.
  2. Connectez le réseau d’aiguilles (Figure 2A-F) au dispositif EIM et laissez-le reposer dans un bateau de pesée contenant une solution saline. Vérifiez la connectivité et la stabilité du signal (indiquées par des barres vertes).
  3. Désinfectez la peau et les aiguilles avec de l’alcool. Placez le réseau d’aiguilles dans une position longitudinale par rapport aux myofibres et appuyez fermement dans la peau jusqu’à ce que toutes les aiguilles pénètrent dans la peau et le muscle sous-jacent jusqu’à la protection en plastique sur le réseau. Acquérir des données.
  4. Retirez doucement le tableau et réinsérez-le à travers la peau et dans le muscle à un angle de 90° par rapport à la première mesure, dans le sens transversal. Acquérir des données.
    REMARQUE: Lors de l’utilisation de réseaux d’aiguilles, les mesures ne doivent être acquises qu’une seule fois dans chaque direction pour réduire l’impact des électrodes d’aiguille sur la peau et le tissu musculaire. En cas de saignement, essuyez doucement le sang avant d’effectuer la deuxième mesure. La récupération de l’animal est immédiate après l’arrêt de l’anesthésie à l’isoflurane et la procédure ne nécessite pas de traitement analgésique.

3. EIM ex vivo

  1. Préparer la cellule diélectrique ex vivo (Figure 2G,H), ajouter une solution saline à la chambre et connecter la cellule au dispositif EIM pour obtenir les valeurs de référence.
    REMARQUE : Les valeurs de phase et de réactance de la solution saline doivent demeurer constantes à zéro ou près de zéro et les valeurs de résistance de la solution saline doivent demeurer constantes à environ 100 ± 25 Ω sur la gamme de fréquences de 1 kHz à 1 MHz.
  2. Euthanasier l’animal conformément aux directives respectives de l’IACUC.
  3. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez la peau près du tendon d’Achille. À l’aide d’une pince à épiler, tirez la peau dans un mouvement ascendant pour révéler les muscles sous-jacents et le fascia. Disséquez doucement le biceps fémoral recouvrant le muscle gastrocnémien et sectionnez le nerf sciatique.
  4. Coupez le tendon d’Achille pour libérer l’extrémité distale des muscles gastrocnémiens et soléaires et tirez doucement le tendon vers le haut tout en utilisant des ciseaux pour enlever les attaches. Une fois que tous les accessoires sont retirés, utilisez des ciseaux pour couper l’extrémité rostrale du muscle soléaire et l’enlever.
  5. Utilisez des ciseaux pour disséquer la tête du muscle gastrocnémien autour de la rotule.
    REMARQUE: Après l’ablation du muscle gastrocnémien, il est important de se rappeler l’orientation originale des myofibres.
  6. Placez le muscle gastrocnémien sur une feuille de cire dentaire et sectionnez-le à l’aide d’une lame de rasoir et d’une règle pour obtenir une section de 10 mm x 10 mm à partir du centre du muscle gastrocnémien.
    REMARQUE: La taille de la cellule diélectrique peut être personnalisée. Pour les rats, une cellule de 10 mm x 10 mm a été utilisée et pour les souris, une cellule de 5 mm x 5 mm a été utilisée.
  7. À l’aide d’une pince à épiler, placez doucement le gastrocnémien dans les cellules diélectriques, en vous assurant que les fibres sont orientées longitudinalement (c.-à-d. que les extrémités caudales et rostrales doivent toucher les électrodes). Assurez-vous que le muscle est complètement en contact avec les électrodes métalliques.
  8. Fixez la partie supérieure de la cellule diélectrique et insérez deux aiguilles monopolaires (26 G) dans les deux trous. Connectez les fils du dispositif EIM à la cellule ex vivo dans l’ordre suivant : (1 : I+, 2 : V+, 3 : V-, 4 : I-, où I représente les électrodes de courant et V représente les électrodes de tension). Acquérir la mesure longitudinale.
  9. Ouvrez la cellule diélectrique et réorientez le muscle dans le sens transversal en le faisant pivoter de 90°. Refixez le dessus de la cellule diélectrique. Acquérir la mesure transversale.

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Résultats

L’EIM peut être obtenue dans de nombreuses conditions, y compris les réseaux in vivo de surface (Figure 1), les réseaux in vivo à aiguilles (Figure 2A-F) et les cellules diélectriques ex vivo (Figure 2G,H).

EIM fournit un instantané quasi instantané de l’état musculaire basé sur les valeurs d’impédance mesurées. Les mesures sont...

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Discussion

Cet article fournit les méthodes de base pour effectuer l’EIM chez les rongeurs, à la fois in vivo et ex vivo. Pour acquérir des mesures fiables, il est essentiel d’effectuer une série d’étapes. Tout d’abord, il faut bien identifier le muscle d’intérêt, car chaque muscle aura des réponses différentes aux maladies, au traitement et à la pathologie. Il faut garder à l’esprit que les données acquises sur un muscle (par exemple, gastrocnémien) ne fourniront pas les mêmes informations que sur un autre muscle...

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Déclarations de divulgation

S. B. Rutkove détient une participation et agit à titre de consultant et de conseiller scientifique auprès de Myolex, Inc., une société qui conçoit des dispositifs d’impédance à des fins cliniques et de recherche, et du système mView utilisé ici. Il est également membre du conseil d’administration de la société. La société a également une option pour concéder sous licence une technologie d’impédance brevetée dont S. B. Rutkove est nommé comme inventeur. Les autres auteurs n’ont aucune autre affiliation ou implication financière pertinente avec une organisation ou une entité ayant un intérêt financier ou un conflit financier avec le sujet ou les documents discutés dans le manuscrit en dehors de ceux divulgués.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par Charley’s Fund et NIH R01NS055099.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Imprimante 3DFormlabs Inc.Form 2 Imprimante3D
Imprimante 3DShenzhen Creality 3D Technology Co. LTDCreality Ender 3 V2Imprimante 3D
Ruban chirurgical 3M MicroporeFisher19-027761 et 19-061655modèles 1530-0 et 1530-1
Ruban chirurgical 3M TRANSPOREFisher18-999-380 et 18-999-381modèles 1527-0 et 1527-1
En-tête de connecteur vertical 10 POS espacement de1 mmDigi-Key (solution de connecteur Sullins)S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)Entretoise en plastique Trous de 1 mm pour le réseau in vivo de rat représenté sur la figure 2A
Applicateurs à embout de cotonFisher22-363-172
Cire dentaireFisherNC9377103
Agent dépilatoireNAIRNALotion décapante à l’huile pour bébé adoucissante
Dumont #7b ForcepsFine Outils scientifiquesn° 11270-20Utilisé pour la dissection, Style : #7b, Forme de l’embout : Courbé, Pointes : Standard, Dimensions de l’embout : 0,17 mm x 0,1 mm, Alliage/Matériau : Inox, Longueur : 11 cm
Pied à coulisse numérique électroniqueFisher14-648-17Utilisé pour mesurer les dimensions du muscle gastrocnémien
Cartouche double adhésive époxy 4 min de vie de travailDevconsérie 14265, modèle 2217Colle utilisée dans le réseau in vivo de rat illustré à la figure 2A
Cellule d’impédance diélectrique ex vivoNA Lescellules diélectriques NA personnalisées ont été imprimées en 3D dans le laboratoire de Rutkove
Graefe ForcepsFine Science Toolsn° 11051-10Utilisé pour le muscle à placer et à ajuster, Longueur : 10 cm, Forme de l’embout : Courbé, Pointes : Dentelées, Largeur de l’embout : 0,8 mm, Dimensions de l’embout : 0,8 mm x 0,7 mm, alliage/matériau
Tondeuse à cheveuxAmazonNAWahl animal professionnel BravMini+
Impédance Dispositif animalMyolexEIM1103système mView - appareil de myographie d’impédance électrique expérimentale pour une utilisation dans la recherche animale
Réseaux d’aiguilles in vivo PersonnaliséNAMatrices personnalisées utilisant des aiguilles sous-cutanées 27 G d’Ambu. La construction a été finalisée à l’aide d’une imprimante 3D dans le laboratoire de Rutkove
surface in vivoNA personnaliséLe réseau de surface in vivo a été imprimé et assemblé dans le laboratoire de Rutkove
IsofluranePatterson Veterinary Supplies07-893-8441 (NDC : 46066-755-04)Pivetal - Bouteille de 250 mL
Gaze non tisséeFisher22-028-5592 x 2 pouces
Polystyrène Pesée PlatsFisherS67090ADimensions (L x l x H) : 88,9 mm x 88,9 mm x 25,4 mm
Lames de rasoirFisher12-640Utilisées pour couper les muscles aux bonnes dimensions, Lames en acier au carbone à un seul tranchant Ciseaux
fins pour étudiantsOutils scientifiquesfins n° 91460-11Utilisés pour la dissection, Pointes : Tranchantes-tranchantes, Alliage/Matériau : Acier inoxydable pour étudiants, Dentelées : Non, Forme de la pointe : Droite, Tranchant : 20 mm, Longueur : 11,5 cm, Caractéristique
 : Aiguilles sous-cutanées de qualité étudiante 27 G NeurolineAmbu745 12-50/24Aiguilles utilisées dans le réseau in vivo de rat présenté sur la figure 2A
Ciseaux chirurgicaux - Outilsscientifiques finstranchants n° 14002-13Utilisés pour couper la peau, Pointes : Sharp-Sharp, Alliage/Matériau : Acier inoxydable, Dentelé : Non, Forme de la pointe : Droit, Tranchant : 42 mm, Longueur : Électrodes
à aiguille monopolaires TECA ELITENatus902-DMG50-Sde 0,46 mm de diamètre (26 G). Blue hub
Teknova 0,9 % solution salineFisherS58151000 mL stérile
de bureau Réseau de de 13 cm

Références

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