Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile

Résumé

Nous présentons un protocole pour caractériser électrophysiologiquement les photopigments bi-stables : (i) exploiter les déplacements de charge au sein des molécules de photopigment suite à l’absorption des photons et leur énorme quantité dans les photorécepteurs, et (ii) exploiter les différences de spectres d’absorption des états photopigment rhodopsine et métarhodopsine. Ces protocoles sont utiles pour dépister les mutations affectant les systèmes de photopigments stables.

Résumé

La rhodopsine (R) couplée à la photopigment G-protéine de la drosophile est composée d’une protéine (opsine) et d’un chromophore. Le processus d’activation de la rhodopsine est initié par l’isomérisation du chromophore induisant l’absorption des photons, favorisant les changements conformationnels de l’opsine et entraînant un deuxième état photopigment stable et sombre (métarhodopsine, M). L’étude de ce photopigment bi-stable utilisant la mutagénèse aléatoire nécessite des méthodes simples et robustes pour le dépistage des mouches mutantes. Par conséquent, plusieurs méthodes de mesure des réductions des niveaux de photopigment fonctionnel ont été conçues. L’une de ces méthodes exploite les déplacements de charge dans le photopigment après l’absorption des photons et les énormes quantités de molécules de photopigment exprimées dans les photorécepteurs. Ce signal électrique, appelé potentiel récepteur précoce (ou courant récepteur précoce), est mesuré par diverses méthodes électrophysiologiques (par exemple, électrorétinogramme et enregistrements de cellules entières) et est linéairement proportionnel aux niveaux de photopigment fonctionnels. Les avantages de cette méthode sont le rapport signal/bruit élevé, la mesure linéaire directe des niveaux de photopigment et l’indépendance des mécanismes de phototransduction en aval de l’activation de la rhodopsine ou de la métarhodopsine. Une méthode électrophysiologique supplémentaire appelée postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite la bi-stabilité du photopigment de la drosophile et les différences spectrales d’absorption des états pigmentaires R et M des mouches. Le PDA est induit par une lumière bleue intense, convertissant des quantités saturées de rhodopsine en métarhodopsine, ce qui entraîne l’échec de la terminaison de la réponse lumineuse pendant une période prolongée dans l’obscurité, mais il peut être terminé par la conversion de la métarhodopsine en rhodopsine en utilisant une lumière orange intense. Étant donné que le PDA est un signal robuste qui nécessite une conversion massive du photopigment, même de petits défauts dans la biogenèse du photopigment conduisent à un PDA anormal facilement détecté. En effet, des mutants PDA défectueux ont conduit à l’identification de nouvelles protéines de signalisation importantes pour la phototransduction.

Introduction

La rhodopsine (R) activée par la lumière, qui est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG), est composée d’une protéine transmembranaire 7 (opsine) et d’un chromophore. Chez Drosophila melanogaster (mouche des fruits), l’absorption des photons induit l’isomérisation du chromophore rétinien 11-cis-3-OH en tout-trans-3-OH-rétinien¹, favorisant le changement conformationnel de la rhodopsine en métarhodopsine (M, Figure 1A). Contrairement à la rhodopsine vertébrée, la fraction prédominante du chromophore invertébré ne se dissocie pas de l’opsine, ce qui entraîne l’état pigmentaire ....

Protocole

1. Mesure de la relation intensité-réponse, de l’après-potentiel dépolarisant prolongé (PDA) et du potentiel récepteur précoce (ERP) à l’aide de l’électrorétinogramme

1. Conditions d’élevage appropriées pour la préparation de D. melanogaster
   1. Élever les mouches D. melanogaster dans des bouteilles contenant du maïs jaune standard contenant de la nourriture dans un incubateur maintenu à une température de 24 ° C et dans un cycle sombre / clair de 12 h
   2. Gardez les bouteilles de mouches dans l’obscurité au moins 24 heures avant l’expérience.
2. Configuration générale
   1. Préparer les pipette....

Résultats

La figure 2 illustre la robustesse et la facilité d’utilisation de la technique ERG. Il est robuste car il est enregistré dans la mouche pratiquement intacte par une technique simple d’enregistrements de tension extracellulaire qui nécessitent une configuration électrophysiologique simple. La robustesse se manifeste par l’obtention d’enregistrements de réponses lumineuses avec des amplitudes relativement grandes (de l’ordre du millivolt) même lorsque les mutations réduisent fortement ou défo.......

Discussion

Le principal avantage de l’utilisation de la préparation de photorécepteurs de drosophile est son accessibilité, la facilité et la précision de la stimulation lumineuse et, surtout, la capacité d’appliquer la puissance de la génétique moléculaire⁷. Des études génétiques approfondies ont établi la drosophile comme un système modèle extrêmement utile pour la dissection génétique de processus biologiques complexes⁷. La structure relativement simple du génome .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 mL avec embout			Figure 6M
1 pince à épiler rugueuse		Dumont #5, Standard	0,1 mm x 0,06 mm, longueur 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 lentilles
Convertisseur A/N	Dispositif moléculaire	Digidata 1200	Remplacement possible : tout digidata des dispositifs moléculaires (par exemple 1440A) -Figure 7C
Amplificateur	Électronique		Remplacement possible : Instruments Warner - IE251A ou IE-210 (livré avec étage de tête)- Figure 7D
Table antivibratoire	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaires	Harvard Appareil Harvard	Capillaires en verre borosilicaté	1 mm x 0,58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Source de lumière froide	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Essuie-glaces délicats	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Porte-électrode			Convient pour le diamètre extérieur capillaire 1 mm (Figure 6N, Figure 7N et Figure 7P)
Cage de Faraday	Fabrication		Blindage contre le bruit électromagnétique et rideau avant noir (Figure 7K)
Filtre (couleur)	Schott	OG590, Filtre de bord	Figure 7S
Filtre (couleur)	Schott	BP450/40 nm	Figure
7S Filtre (couleur)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filtre (couleur) pour source de lumière froide	Schott	RG630	Figure 6C
Filtre (chaleur)	Schott	KG3	Figure 7S
Filtres (neutre) filtre de densité)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Système de lampe flash	Honeywell		Figure 7U
Système de dormeur de mouche avec injecteur	Inject + matic		Figure 6A-B
Alimentation de la lampe	PTI	LPS-220	Figure 7W
Détecteur de lumière	fait		(Figure 7O)
Guide de lumière			3 mm de diamètre, 1,3 m de long (Figure 7L,M)
Source			Lampe au xénon haute pression sans ozone de 75 W (fonctionnant sur 50 W), remplacement possible : Recherche Cairn - OptoLED (Figure 7R)
Cire fondante à basse température	Fait		Composé d’un mélange de cire d’abeille (Tm&asymp ; 62 ° ; C) et de la paraffine à ~3:1 pour atteindre une température de fusion de ~55&ndash ; 56 ° ; C (Figure 6J)
Support magnétique pour mouches	Fabrication		Figure 6I et Figure 7Q
Système de préamplificateur à microélectrodes avec étage de tête	Électronique		Testeur d’impédance (Figure 7G)
Micromanipulateur (mécanique grossier)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulateur (mécanique fine)	Leitz	Microsystems Leitz Micromanipulateur mécanique	Figure 7F
pCLAMP	Dispositif moléculaire
Logiciel Boîte de Pétri			60 mm
Générateur d’impulsions	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux crème pour électrocardiographie	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crè ; me
Tournevis d’obturateur	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Uni-stable monocanal	Figure 7V
Système d’obturateur	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable	Shutters Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25&ndash ; 1 mm de diamètre, doit être chlorurisé
Fer à souder composé d’un filament			0,25 mm de diamètre (Figure 6F)
Zoom stéréoscopique Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Zoom stéréoscopique	Microscope Wild	Wild M5	Avec 6, 12, 25 et 50 réglages de grossissement (Figure 7E)
Filtres à seringue	Millex		22 µ ; m Filtre PVDF
Extracteur de pipette vertical	Sutter/ Narishige	Modèle P-97/PP-830	Utiliser un extracteur vertical ou horizontal, selon vos préférences (Figure 6L)
Chauffage à filament de cire	Fait		Voir figure S1 (Figure 6E-G)
Système de lampe flash au xénon	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X

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