Article de méthode

Amplification d’Escherichia coli dans une puce microfluidique PCR à flux continu et sa détection à l’aide d’un système d’électrophorèse capillaire

DOI :

10.3791/63523

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21 novembre 2023

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1Shanghai Key Lab of Modern Optical System, University of Shanghai for Science and Technology, 2Graduate School of Engineering, Osaka University

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit comment construire un système de chaîne polymérase à flux continu basé sur une puce microfluidique et comment construire un système d’électrophorèse capillaire en laboratoire. Il présente une méthode simple pour l’analyse des acides nucléiques en laboratoire.

Résumé

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La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode traditionnelle utilisée pour l’amplification d’un gène cible qui a joué un rôle important dans le diagnostic biomoléculaire. Cependant, la PCR traditionnelle prend beaucoup de temps en raison de l’efficacité de la faible variation de température. Ce travail propose un système de PCR en flux continu (CF-PCR) basé sur une puce microfluidique. Le temps d’amplification peut être considérablement réduit en faisant passer la solution PCR dans un microcanal placé sur des réchauffeurs réglés à différentes températures. De plus, comme l’électrophorèse capillaire (EC) est un moyen idéal de différencier les produits de PCR positifs et faussement positifs, un système CE a été construit pour obtenir une séparation efficace des fragments d’ADN. Cet article décrit le processus d’amplification d’Escherichia coli (E. coli) par le système CF-PCR construit en interne et la détection des produits PCR par CE. Les résultats démontrent que le gène cible d’E. coli a été amplifié avec succès en 10 minutes, ce qui indique que ces deux systèmes peuvent être utilisés pour l’amplification et la détection rapides des acides nucléiques.

Introduction

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La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier des fragments d’ADN spécifiques, amplifiant ainsi des traces d’ADN des centaines de millions de fois. Il a été largement utilisé dans le diagnostic clinique, la recherche médicale, la sécurité alimentaire, l’identité médico-légale et d’autres domaines. Le processus de PCR se compose principalement de trois étapes : la dénaturation à 90-95 °C, le recuit à 50-60 °C et l’extension à 72-77 °C. Le cycle thermique est une partie importante du processus de PCR ; cependant, le thermocycleur PCR traditionnel est non seulement encombrant mais aussi inefficace, nécessita....

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Protocole

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REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Fabrication d’une puce microfluidique CF-PCR

  1. Chauffez la plaquette de silicone à 200 °C pendant 25 min pour éliminer l’humidité.
  2. Distribuer 1 mL de résine photosensible SU-8-2075 par pouce de plaquette. Essorez-le sur la plaquette de silicium à l’aide d’une machine à enrober à 500 tr/min pendant 5 à 10 s avec une accélération de 100 tr/min, puis à 2 000 tr/min pendant 30 s avec une accélération de 500 tr/min.
  3. Faites cuire la gaufrette en s....

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Résultats

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La figure 5 représente l’électrophérogramme des produits PCR et des marqueurs ADN. La trace (Figure 5A) est le résultat CE du produit amplifié par CF-PCR, la trace (Figure 5B) est le résultat CE du produit amplifié par cyclage thermique, et la trace (Figure 5C) est le résultat CE de l’échelle d’ADN de 100 pb. Nous avons d’abord amplifié le gène cible d’E. coli dans le système CF-PCR ; la soluti.......

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Discussion

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La PCR et l’EC sont deux biotechnologies populaires dans l’analyse des acides nucléiques. Cet article décrit l’amplification d’E. coli et la détection des produits PCR à l’aide des systèmes CF-PCR et CE, tous deux construits à l’interne. Le gène cible d’E. coli a été amplifié avec succès en 10 minutes en raison des taux de transfert de chaleur élevés. Les fragments d’ADN inférieurs à 1 500 pb ont été séparés en 8 minutes (Figure 5). Le grand avantage de ces deux techniques .......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai, en Chine (n° 19ZR1477500 et n° 18441900400). Nous remercions chaleureusement l’Université de Shanghai pour la science et la technologie (No.2017KJFZ049).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Échelle d’ADN de 100 pbTakara Bio Inc.3422A
10x Tampon Rapide ITakara Bio Inc.RR070A
10x TBEBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.de développement T1051
Alfa Aesar, États-UnisL15459
mélange dNTP (2.5 &mu ; M)Takara Bio Inc.RR070A
EC-FSangon Biotech, Shanghai, Chine
EC-RSangon Biotech, Shanghai, Chine
HEC, 1300KSigma-Aldrich, États-Unis9004-62-0
isopropanolAladdin, Shanghai, Chine67-63-0
microscope Olympus, JaponBX51
photolithographie et nbsp ;SUSS MicroTec, AllemagneMJB4
  ;Hamamatsu Photonics, JaponR928
photoresistMicroChem, États-UnisSU-8 2075
Régulateurs de température PID  ;Shanghai, ChineNettoyeur plasma XH-W2023
  ;Harrick PlasmaPDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)Aladdin, Shanghai, ChinePompe P110608
Harvard ApparatusPHD2000
tube en silicone  ;BIO-RAD, USA
relais statiquesKZLTD, ChineKS1-25LA
SpeedSTAR HS ADN POLYMÉRASE  ;Takara Bio Inc.RR070A
zhongxinqiheng,Suzhou,Chine
SYBR GREEN figure-materials-1Solarbio, Pékin, ChineSY1020
Technologie EasyShining, Chengdu, ChineTCM-M207
Modèle (E. coli)Takara Bio Inc.AK601
Tween 20Aladdin, Shanghai, ChineAlimentation T104863
tension  ;Medina, NY, ÉTATS-UNIS TREKMODÈLE 610E
Solution Tube photomultiplicateur 7318210 Aiguille en acier Capteurs de température

Références

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  1. Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
  2. Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.

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Mots-clés

Amplification d Escherichia colianalyse des acides nucl iquesmicrocanal PCRs paration de fragments d ADNd tection de produits PCRpr paration de solutions PCRd tection de pathog nes

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