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Article de méthode

Inactivation d’agents pathogènes par photolyse en lumière visible de la riboflavine-5′-phosphate

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DOI :

10.3791/63531

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6 avril 2022

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1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour inactiver les bactéries pathogènes avec des espèces réactives de l’oxygène produites lors de la photolyse de flavine mononucléotide (FMN) sous irradiation en lumière bleue et violette de faible intensité. La photolyse FMN s’est avérée être une méthode simple et sûre pour les processus sanitaires.

Résumé

Riboflavine-5'-phosphate (ou flavine mononucléotide; FMN) est sensible à la lumière visible. Divers composés, y compris les espèces réactives de l’oxygène (ROS), peuvent être générés par photolyse FMN lors de l’irradiation avec la lumière visible. Les ROS générés par la photolyse FMN sont nocifs pour les micro-organismes, y compris les bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus (S. aureus). Cet article présente un protocole de désactivation de S. aureus, à titre d’exemple, par des réactions photochimiques impliquant du FMN sous irradiation en lumière visible. L’anion radical superoxyde () généré lors de la photolyse FMN est évalué par réduction du tétrazolium bleu nitro (figure-abstract-1NBT). La viabilité microbienne de S. aureus attribuée aux espèces réactives figure-abstract-2 a été utilisée pour déterminer l’efficacité du processus. Le taux d’inactivation bactérienne est proportionnel à la concentration de FMN. La lumière violette est plus efficace pour inactiver S. aureus que l’irradiation par lumière bleue, tandis que la lumière rouge ou verte ne conduit pas la photolyse FMN. Le présent article démontre que la photolyse FMN est une méthode simple et sûre pour les processus sanitaires.

Introduction

La riboflavine-5′-phosphate (FMN) est formée par phosphorylation à la position riboflavine 5′ de la chaîne latérale ribityle et est requise par toutes les flavoprotéines pour que de nombreux processus cellulaires génèrent de l’énergie. Il joue également le rôle de vitamine pour certaines fonctions dans le corps humain1. La FMN est environ 200 fois plus soluble dans l’eau que la riboflavine2.

L’inactivation photodynamique antibactérienne (aPDI) des bactéries est un moyen efficace de contrôler la résistance aux bactéries 3,4 car elle ne dépend pas du mode de résistance bactérienne. Cliniquement, l’aPDI est utilisé pour traiter les infections des tissus mous afin de diminuer l’infection de la peau nosocomiale due aux bactéries multirésistantes 5,6,7,8,9. aPDI produit également la mort cellulaire en générant des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les ROS, tels que les radicaux superoxydes (), l’oxygène singulet, les radicaux hydroxyles (figure-introduction-1•OH) et les radicaux peroxyles, sont des radicaux libres ou des molécules qui contiennent de l’oxygène réactif 10,11,12 et sont normalement réactifs 13. Semblable aux dommages à l’ADN causés par les ROS, la peroxydation membranaire et la destruction des cellules endothéliales sont également des réactions biochimiques indésirables attribuées aux ROS dans les cellules12.

L’utilisation de l’aPDI pour les bactéries pathogènes implique une source de lumière visible ou UV pour inactiver les microorganismes en présence de composés chimiques, tels que le chlorure de méthylthioninium 14, le conjuguéPEI-c e6 15, la porphyrine 16, le dioxyde de titane 17, le bleu de toluidine O 18 et les nanoparticules d’oxyde de zinc 19. Le bleu de toluidine O et le bleu de méthylène sont des colorants phénothiazinium et le bleu de méthylène a des propriétés toxiques. Les nanoparticules d’oxyde de zinc et l’irradiation UV sont liées à des effets néfastes sur la santé et l’environnement. En tant que telle, l’exploitation d’un photosensibilisateur fiable, sécurisé et simple par photolyse sous irradiation visible mérite une étude plus approfondie.

Le micronutriment, la riboflavine ou FMN, n’est pas toxique et est effectivement utilisé pour la fabrication ou l’alimentation des aliments20. La FMN et la riboflavine sont très sensibles à l’irradiation lumineuse2. Sous UV 1,2,21,22,23 et irradiation en lumière bleue 10,24, ces deux composés atteignent un état excité. La riboflavine ou FMN activée qui est produite par photolyse est promue à son état triplet et les ROS sont générés simultanément 2,25. Kumar et coll. ont signalé que la riboflavine activée par la lumière UV provoque sélectivement des lésions accrues de la fraction guanine de l’ADN dans les microorganismes pathogènes26. Sous irradiation par la lumière UV, il est démontré que la riboflavine activée par photodynamique favorise la génération de 8-OH-dG, qui est un biomarqueur du stress oxydatif, dans l’ADN double brin27. Il est rapporté que S. aureus et E. coli sont désactivés par ROS pendant la riboflavine ou la photolyse FMN10,24,28. Une étude antérieure des auteurs a montré que les réactions photolytiques impliquant la riboflavine et la FMN réduisent le cristal violet, un colorant triarylméthane et un agent antibactérien qui génère figure-introduction-2et élimine la majeure partie de la capacité antimicrobienne du cristal28. Lorsque la flavine adénine dinucléotide ou FMN est irradiée par la lumière bleue, les ROS résultants produisent une apoptose dans les cellules HeLa pour leur empoisonnement in vitro29. En utilisant un traitement photochimique en présence de riboflavine, Cui et al. lymphocytes inactivés en inhibant leur prolifération et la production de cytokines30.

La photolyse de la riboflavine est utilisée pour l’inactivation de l’agent pathogène du sang par UV 10,24, mais les composants sanguins peuvent être altérés sous irradiation à la lumière UV30. Il est également rapporté que les plaquettes exposées aux UV améliorent progressivement la performance des marqueurs d’activation P-sélectine et LIMP-CD63 sur leurs membranes. La cytotoxicité des UV et de l’irradiation à haute intensité doit être étudiée et un photosensibilisateur simple et sûr lors d’une photoréaction FMN impliquant la lumière visible serait d’une grande utilité.

La lumière de longueurs d’onde plus courtes a plus d’énergie et est beaucoup plus susceptible de causer de graves dommages aux cellules. Cependant, en présence d’un photosensibilisant approprié, l’irradiation avec une lumière violette de faible intensité peut inhiber les micro-organismes pathogènes. La photosensibilisation et la génération de FMN lorsqu’ils sont irradiés avec de la lumière violette sont donc importantes à étudier, afin de déterminer la voie par laquelle les ROS de la photolyse FMN augmentent l’inactivation figure-introduction-3 des bactéries.

Le contrôle antimicrobien est un problème courant et la mise au point de nouveaux antibiotiques prend souvent des décennies. Après irradiation à la lumière violette, la photoinactivation intermédiée par la FMN peut annihiler les bactéries pathogènes environnementales. Cette étude présente un protocole antimicrobien efficace in vitro utilisant la lumière violette pour conduire la photolyse FMN et ainsi générer figure-introduction-4 pour une PDI. La viabilité microbienne de S. aureus est utilisée pour déterminer la faisabilité d’une IPa induite par la FMN.

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Protocole

1. Configuration du système de photolyse

  1. Monter six diodes électroluminescentes (DEL) (DC 12 V) à l’intérieur d’un gobelet en plastique opaque (8 cm x 7 cm) comme le montre la figure 1 pour établir un système de photolyse31.
  2. Ajouter des réactifs (voir ci-dessous) dans les tubes à essai en verre (13 mm de diamètre et 100 mm de hauteur) et fixer les tubes en haut de la coupelle comme indiqué à la figure 1. Placer l’installation expérimentale dans une pièce à température constante de 25 ± 3 °C.
  3. Surveiller et enregistrer la température des unités d’essai tout au long des réactions photolytiques à l’aide d’un thermomètre infrarouge.
    REMARQUE : La figure 2 montre les spectres d’émission pour les lumières bleue, verte, rouge et violette, tels qu’enregistrés à l’aide d’un spectromètre optique UV-Vis étalonné. Les longueurs d’onde correspondant à l’absorbance maximale pour les lumières LED bleues, vertes, rouges et violettes utilisées dans l’étude sont respectivement de 465, 529, 632 et 405 nm. Les puces LED peuvent chauffer l’appareil pendant les expériences d’irradiation. L’ensemble du système de photoréaction de chaque expérience a donc été placé dans une pièce où la température a été maintenue constante à 25 ± 3 °C.

2. L’effet de la longueur d’onde lumineuse sur la photolyse de FMN (Figure 3)

  1. Préparer une solution FMN 0,1 mM dans un tampon phosphate de potassium (PB) de 100 mM (pH 7,8). Exposer les échantillons FMN (3 mL chacun) à une lumière bleue, verte, rouge ou violette à une intensité de 10 W/m2 pendant 5 min. Conserver 3 mL de solution FMN dans l’obscurité comme témoin.
  2. Enregistrer l’absorbance des échantillons FMN irradiés dans la plage de 250 à 750 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible.

3. Méthode de réduction du tétrazolium bleu nitro (NBT) à détecter figure-protocol-1 (figure 4).

NOTE: La méthode de réduction NBT utilisée ici a été légèrement modifiée par rapport au test de photoréaction de la riboflavine. La méthode de réduction NBT est utilisée pour évaluer le niveau de figure-protocol-2 généré par la photolyse FMN. Le FMN photochimiquement excité est d’abord réduit par la L-méthionine en une semiquinone, qui donne ensuite un électron à l’oxygène donnant naissance à figure-protocol-331. Le tel que généré figure-protocol-4 réduit NBT en formazan, qui a une absorbance caractéristique à 560 nm32.

  1. Ajouter 109,3 mg de L-méthionine à 73,3 mL de PB (100 mM; pH 7,8). Vortex la solution pour dissoudre la L-méthionine.
  2. Une fois la L-méthionine complètement dissoute, ajouter 10 mg de poudre NBT et 1,53 mL de 0,117 mM FMN à la solution. Pour chaque 1 mL de la solution réactionnelle (c.-à-d. un mélange de FMN, de L-méthionine et de NBT) appliqué, les concentrations finales de FMN, de méthionine et de NBT sont de 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M et 1,6 x 10-4 M, respectivement.
  3. Exposer la solution réactionnelle (1 mL) à une irradiation à la lumière LED bleue ou violette à 10 W/m2 pendant 1 à 5 min.
  4. Détecter les figure-protocol-5 espèces (à partir de l’absorbance à 560 nm) produites par la réaction photochimique, qui réduit la NBT et produit du formazan.

4. Viabilité de S. aureus après photolyse FMN (figure 5)

  1. Transmettez une colonie de S. aureus (BCRC 10451) d’une plaque cultivée à 10 mL de bouillon de lysogénie prélevé dans un tube à essai à bouchon vissé de 15 mL. Culture dans un shaker à 37 °C pendant 16 h.
  2. Transférer 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Ajouter de l’eau stérilisée dans le tube à centrifuger pour diluer la culture à une densité optique de 0,5 à 600 nm (OD600) (~6 x 107 UFC/mL).
  3. Transvaser 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant pour obtenir une pastille cellulaire.
  4. Ajouter 1 mL de solution tamponnée FMN (30, 60 et 120 μM FMN en PB) aux pastilles cellulaires obtenues comme à l’étape 4.3, et vortex. Pour le contrôle irradié, ajouter 1 mL de PB seul.
  5. Transférer 1 mL chacune de solutions cellulaires bactériennes viables contenant 30 μM de FMN et de PB seuls dans des tubes de verre et les irradier avec une lumière violette à 10 W/m2 pendant 30 min.
  6. Transvaser 1 mL chacune de solutions cellulaires bactériennes viables contenant 30, 60 et 120 μM de FMN et de PB seuls dans des tubes de verre et les irradier avec de la lumière bleue à 20 W/m2 pendant 120 min. Mettre en place un autre tube de verre avec 1 mL de solution cellulaire bactérienne viable contenant 120 μM FMN et l’irradier avec de la lumière bleue à 20 W/m2 pendant 60 min.
  7. Installer les tubes à essai comme décrit aux étapes 4.5 et 4.6 et les recouvrir de feuilles d’aluminium épaisses. Ces tubes servent de commandes sombres.
  8. Conserver la chambre d’irradiation (ainsi que les témoins sombres) dans une chambre froide à 9 ± 1 °C pendant la période d’irradiation de 30 à 120 minutes.
    REMARQUE: La chaleur dégagée par les lumières LED ne peut pas être ignorée car les puces LED placées à l’intérieur de la tasse peuvent chauffer le système de photoréaction pendant les expériences d’irradiation. Les expériences ont donc été menées dans une chambre froide maintenue à 9 ± 1 °C.
  9. Après irradiation, transférer 0,2 mL de chacune des solutions réactionnelles sur une plaque de gélose Luria (LA). Étaler les bactéries sur la plaque à l’aide d’une tige de verre en forme de L et incuber pendant une nuit à 37 °C.
  10. Calculer la numération sur plaque viable et les taux d’inactivation de S. aureus après une croissance nocturne.
    NOTE: Le taux d’inactivation de S. aureus est calculé comme le pourcentage de réduction, qui est égal à [1 -I / D] ×100%, où I et D désignent, respectivement, le nombre d’UFC dans l’échantillon irradié et le témoin foncé. Le pourcentage de réduction est défini comme une valeur négative du taux d’inactivation.

5. Détection de figure-protocol-6chez S. aureus (figure 6) 

  1. Préparez les échantillons de S. aureus comme décrit à l’étape 4.
  2. Diluer la densité bactérienne des échantillons avec de l’eau stérilisée à une densité optique de 0,5 à 600 nm (DO600, ~6 x 106 UFC/mL). Transférer 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant pour obtenir une pastille de cellule.
  3. Ajouter 0,1093 g de L-méthionine, 0,1 g de NBT et 25 mL de FMN (400, 240 ou 120 μM) à 75 mL de PB. Pour chaque 1 mL du réactif appliqué, les concentrations finales de FMN, de méthionine et de NBT sont de 100 (60 ou 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M et 1,2 x 10-3 M, respectivement.
  4. Ajouter 1 mL de chaque solution réactive (c.-à-d. avec des concentrations variables de FMN) aux pastilles de cellules obtenues comme à l’étape 5.2. Irradier les solutions par lumière violette à 10 W/m2 pendant 10 min.
  5. Centrifuger le mélange à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour extraire le NBT réduit. Détecter les espèces produites figure-protocol-7 à partir de l’absorbance à 560 nm.

6. Analyse statistique

  1. Exprimer les données sous forme de moyenne ±écart type (ET) de trois essais indépendants.
  2. Appliquer un test t homoscédastique à deux échantillons pour évaluer si deux mesures sont différentes. Les valeurs de p < 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives.

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Résultats

Effet de la longueur d’onde lumineuse sur FMN
Les spectres d’absorbance de 0,1 mM FMN irradiés à l’aide de LED bleues, vertes, rouges et violettes sont illustrés à la figure 3. Il y a deux pics pour FMN (372 nm et 444 nm) pour le contrôle de l’obscurité. La lumière verte et la lumière rouge n’ont aucun effet car les changements dans les spectres sont insignifiants. D’autre part, l’absorbance respective de FMN à 444 nm est réduite d’environ 19% et 34%, respectivement, aprè...

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Discussion

Un photosensibilisant augmente la réaction photochimique des composés chimiques pour générer des ROS. Les microorganismes pathogènes peuvent être inactivés par irradiation lumineuse en présence de photosensibilisants. Cette étude détermine l’aPDI de S. aureus due aux ROS générés par l’irradiation en lumière violette d’un photosensibilisateur exogène, FMN.

Comme le montre la figure 3, pour la FMN, l’absorbance à 444 nm est réduite de manière significative ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants au Dr Tak-Wah Wong et à M. Zong-Jhe Hsieh pour leur soutien dans les expériences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lumières LED bleues, vertes et rougesVita LED Technologies Co., Tainan, TaiwanDC 12 V 5050
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich, St. Louis, MO190186
Thermomètre infrarougeRaytek Co. Santa Cruz, CAMT4
LB bouillonDifco Co., NJ
L-MethionineSigma-Aldrich, St. Louis, MO1.05707
NBTBio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Alimentation électriqueChina tech Co., New Taipei City, TaïwanYP30-3-2
Riboflavine 5&prime ;-phosphateSigma-Aldrich, St. Louis, MOR7774
RNaseNew England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Compteur d’énergie solaireTenmars Electronics Co., Taipei, TaïwanTM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureusCentre de collecte et de recherche sur les bioressources (BCRC), Hsinchu, Taïwan10451
Spectromètre optique UV-VisOcean Optics, Dunedin, FLUSB4000
Spectrophotomètre UV-VisHitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, JaponU-2900
Violet LEDLong-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Chine

Références

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