La méthode de culture tridimensionnelle sans sérum pour les cellules souches de la glande lacrymale adulte (LG) est bien établie pour l’induction de la formation d’organoïdes LG et la différenciation en cellules acineuses ou canalaires.
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Article de méthode
Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale
Dans cet article
Résumé
Résumé
La thérapie à base de cellules souches de la glande lacrymale (LG) est une stratégie prometteuse pour les maladies de la glande lacrymale. Cependant, l’absence d’une méthode de culture fiable et sans sérum pour obtenir un nombre suffisant de cellules souches LG (LGSC) est un obstacle à la poursuite de la recherche et de l’application. La méthode de culture tridimensionnelle (3D) sans sérum pour les LGSC de souris adultes est bien établie et montrée ici. Les LGSC pourraient être continuellement passés et induits à se différencier en cellules acineuses ou canalaires.
Pour la culture primaire lgsc, les LG de souris âgées de 6 à 8 semaines ont été digérées avec de la dispase, de la collagénase I et de la trypsine-EDTA. Au total, 1 × 104 cellules uniques ont été ensemencées dans 80 μL de matrice gel-milieu de cellules souches de glande lacrymale (LGSCM) dans chaque puits d’une plaque de 24 puits, prélaquée avec 20 μL de matrice gel-matrice LGSCM. Le mélange a été solidifié après incubation pendant 20 min à 37 °C, et 600 μL de LGSCM ajoutés.
Pour l’entretien des LGSC, les LGSC cultivés pendant 7 jours ont été désagrégés en cellules individuelles par dispase et trypsine-EDTA. Les cellules individuelles ont été implantées et cultivées selon la méthode utilisée dans la culture primaire LGSC. Les LGSC pourraient être passés plus de 40 fois et exprimer en continu les marqueurs de cellules souches / progénitrices Krt14, Krt5, P63 et nestin. Les LGSC cultivés dans LGSCM ont une capacité d’auto-renouvellement et peuvent se différencier en cellules acineuses ou canalaires in vitro et in vivo.
Introduction
Les cellules souches des glandes lacrymales (LGSC) maintiennent le renouvellement cellulaire des glandes lacrymales (LG) et sont la source de cellules acineuses et canalaires. Par conséquent, la transplantation de LGSC est considérée comme une approche alternative pour traiter les lésions inflammatoires graves et la sécheresse oculaire aqueusement déficiente (ADD)1,2,3. Plusieurs méthodes de culture ont été appliquées pour enrichir les LGSC. Tiwari et al. ont séparé et cultivé des cellules LG primaires à l’aide de collagène I et de gel matriciel complété par plusieur....
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Protocole
Toutes les expériences de ce protocole ont suivi les directives de soins aux animaux du Comité d’éthique sur les essais sur les animaux de l’Université Sun Yat-sen. Toutes les opérations liées aux cellules doivent être effectuées sur l’établi ultrapropre dans la salle d’opération de la cellule. Toutes les opérations utilisant du xylène doivent être effectuées dans des hottes.
1. Culture primaire LGSC
- Isolation LG
- Obtenez une souris mâle BALB/c de 6 à 8 semaines et coupez la peau derrière l’oreille pour exposer le LG et le tissu conjonctif qui l’entoure. Décollez le tissu conjonctif par dissection contondan....
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Résultats
Établir un système de culture 3D sans sérum
Dans cette étude, lgSCM contenant EGF, Wnt3A, FGF10 et Y-27632 pour les LGSC de souris a été développé, et les LGSC ont été isolés et cultivés avec succès par une méthode de culture 3D (Figure 1A). Un système de culture 3D sans sérum de LGSC de souris C57BL/6, de souris NOD/ShiLtJ, de souris BALB/c et de souris ROSA26mT/mG a été établi à l’aide de cette méthode16. Pour une souris mâle, 1,5-2 × .......
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Discussion
Il existe des méthodes bien établies pour l’isolement et la culture in vitro de cellules souches lacrymales pour la culture de cellules souches lacrymales et la réparation des lésions LG. Shatos et al.17 et Ackermannet al. 6 cellules souches lacrymales cultivées et sous-cultivées avec succès de rats et de souris par des méthodes de culture 2D, respectivement, permettant de transplanter des cellules souches lacrymales pour le traitement de l’ADD. Des études.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 31871413) et deux programmes de science et technologie du Guangdong (2017B020230002 et 2016B030231001). Nous sommes vraiment reconnaissants aux chercheurs qui nous ont aidés pendant l’étude et aux membres du personnel travaillant dans le centre animalier pour leur soutien dans les soins aux animaux.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Animal(Souris) | |||
| Bal B/C | Centre de recherche sur les animaux modèles de l’Université | ||
| C57 BL/6J | Centre d’animaux de laboratoire de l’Université | ||
| NOD/ShiLtJ | Centre de recherche sur les animaux modèles de l’Université | ||
| ROSA26mT/mG | Modèle du Centre de Recherche Animale de l’Université | ||
| Equipement | |||
| Balance analytique | Sartorius | ||
| Déshydrateur automatique | Thermo | ||
| Chambre de comptage de sang | BLAU | ||
| Compteur de cellules | CountStar | ||
| Incubateur CO2 | Thermo | ||
| ECL Système d’imagerie gel | GE healthcare | ||
| Bain électrique pour bain-marie | Technologie Yiheng Appareil | ||
| d’électrophorèse | BioRad | ||
| Instrument de PCR quantitative à fluorescence | Roche | ||
| Trancheuse de tissus congelés | Lecia | ||
| Centrifugeuse horizontale | CENCE | ||
| Microscope à fluorescence inversée | Nikon | ||
| Microscope inversé | Olympus | ||
| Micrographie à balayage lamellaire laser | Carl Zeiss Réservoir d’azote | ||
| liquide | Thermo | ||
| Basse température élevée centrifugeuse rapide | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Four à micro-ondes | Panasonic | ||
| Spectrophotomètre ultraviolet Nanodrop Thermo | mesure Concentration | ||
| trancher la paraffine | Amplificateur Thermo | ||
| PCR | Eppendorf | ||
| Testeur de pH | Sartorius | ||
| 4 ° ; C Réfrigérateur | Haier | ||
| Oscillateur thermostatique de culture | ZHICHENG | ||
| Instrument d’encastrement de paraffine tissulaire | Thermo | ||
| ;-80° ; C Réfrigérateur à ultra-basse température | Thermo | ||
| ;-20° ; C Réfrigérateur à ultra-basse température | Système de | ||
| pure | ELGA | ||
| u>Réactif | |||
| Expérimentation animale | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Humain FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Gel matriciel) | BD | 356231 | |
| Tête murine | PeproTech | 250-38 | |
| Souris Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Souris EGF | Femelle PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| Spondine R 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Inhibiteur de la trypsine (TI) | Sigma | T6522 | Dérivé de Glycine max ; peut inhiber la trypsine, la chymotrypsine et la plasminase dans une moindre mesure. Un mg inhibera 1,0 à 3,0 mg de trypsine. |
| Trypsine | Sigma | ; T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049< | |
| strong>HE coloration & Immunomarquage | |||
| Alexa Fluor 488 âne anti-IgG souris Thermo | A-21202 | Dilution utilisée : IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 0,2 &mu ; g/mL | |
| Alexa Fluor 488 âne anti-Lapin IgG | Thermo | A-21206 | Dilution utilisée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL |
| Alexa Fluor 568 âne anti-Souris IgG | Thermo | A-10037 | Dilution utilisée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL |
| Alexa Fluor 568 âne anti-Lapin IgG | Thermo | A-10042 | Dilution usagée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 4 &mu ; g/mL |
| Anticorps anti-AQP5 de lapin | Abcam | ab104751 | Dilution utilisée : (IHC) 1 &mu ; g/mL, (IF) 0,1 &mu ; g/mL |
| Anti-E-cadhérine Anticorps anti-cadhérine de rat | Abcam | ab11512 | Dilution utilisée : (IF) ; 5 &mu ; g/mL |
| Anti-kératine14 anticorps de lapin | Abcam | ab181595 | Dilution utilisée : (IHC) 1 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Dilution utilisée : (IHC) 1 &mu ; g/mL, (IF) 1 &mu ; g/mL |
| Anticorps anti-mCherry souris | Abcam | ab125096 | Dilution utilisée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL |
| Anticorps anti-mCherry rabbit | Abcam | ab167453 | Dilution utilisée : (IF) ; 2 &mu ; g/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Acide citrique | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Montage fluorescent Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Anticorps IgG anti-souris de chèvre (HRP) | Abcam | ab6789 | Dilution utilisée : 2 &mu ; g/mL |
| Anticorps IgG anti-lapin de chèvre (HRP) | Abcam | ab6721 | Dilution utilisée : 2 &mu ; g/mL |
| Hématoxyline | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Hydrogel d’enrobage) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30 % H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| de peroxyde d’hydrogène à 30 | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Méthanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI | YIYANG YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffine | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldéhyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Citrate de sodium tribasique dihydraté | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylène | Guangzhou Chimie | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcool | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroforme | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Bromure d’éthidium | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Alcool isopropylique | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO-Taq | ||
| DNA polymérase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (acide nucléique colorant) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Transfection cellulaire | |||
| Agar | OXID-Ampicilline | ||
| Sigma | 69-52-3 | ||
| Chloramphénicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Kit d’extraction de plasmide sans endotoxines | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Plasmide Lipo3000 Kit de transfection | Thermo | L3000015 | |
| LR Kit de réaction | Thermo | 11791019 | |
| Kit d’extraction de plasmide | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5&alpha ; Cellule chimiquement compétente | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID-Yeast | ||
| Extrait | OXID- | ||
| Amorces et séquence | Company | ||
| Primer : AQP5 Sequence : F : CATGAACCCAGCCCGATCTT R : CTTCTGCTCCCCCCCCCC | Synbio Tech | ||
| Primer : &beta ;-actin Sequence : F : AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R : AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT | Synbio Tech | ||
| Primer : Epcam Sequence : F : CATTTGCTCCAAACTGGCGT R : TGTCCTTGTCGGTTTTCTTCGG | Synbio Tech | ||
| Primer : Krt5 Sequence : F : AGCAATGGCGTTCTGGAGG R : GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | Synbio Tech | ||
| Primer : Krt14 Sequence : F : CGGACCAAGTTTGAGACGGA R : GCCACCTCCTCGTGGTTC | Synbio Tech | ||
| Primer : Krt19 Sequence : F : TCTTTGAAAACACTGAACCCTG R : TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | Synbio Tech | ||
| Primer : Ltf Sequence : F : CACATGCTGTCGTATCCCGA R : CGATGCCCTGATGGACGA | Synbio Tech | ||
| Primer : Nestin Sequence : F : GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R : GACCTCTAGGGTCCGTCT | Synbio Tech | ||
| Primer : P63 Sequence : F : TCCTATCACGGGAAGGCAGA R : GTACCATCGCCGTTCTTTGC | Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus vecteur à charge | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratoire, Université |
Références
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
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Réimpressions et autorisations
