Article de méthode

Préparation et caractérisation de bio-encre d’hydrogel biohybride 3D à base de graphène pour la neuro-ingénierie périphérique

DOI :

10.3791/63622

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16 mai 2022

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1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce manuscrit, nous démontrons la préparation d’une bioencre d’hydrogel biohybride contenant du graphène pour une utilisation dans l’ingénierie tissulaire périphérique. À l’aide de ce matériau biohybride 3D, le protocole de différenciation neuronale des cellules souches est effectué. Cela peut être une étape importante dans l’introduction de biomatériaux similaires à la clinique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les neuropathies périphériques peuvent survenir à la suite de lésions axonales et parfois en raison de maladies démyélinisantes. Les lésions nerveuses périphériques sont un problème mondial qui survient chez 1,5 à 5 % des patients aux urgences et peut entraîner des pertes d’emplois importantes. Aujourd’hui, les approches basées sur l’ingénierie tissulaire, composées d’échafaudages, de lignées cellulaires appropriées et de biosignaux, sont devenues plus applicables avec le développement de technologies de bio-impression tridimensionnelle (3D). La combinaison de divers biomatériaux hydrogels avec des cellules souches, des exosomes ou des molécules de biosignalisation est fréquemment étudiée pour surmonter les problèmes existants dans la régénération des nerfs périphériques. En conséquence, la production de systèmes injectables, tels que les hydrogels, ou de structures de conduits implantables formées par diverses méthodes de bio-impression a pris de l’importance dans la neuro-ingénierie périphérique. Dans des conditions normales, les cellules souches sont les cellules régénératrices du corps, et leur nombre et leurs fonctions ne diminuent pas avec le temps pour protéger leurs populations; Ce ne sont pas des cellules spécialisées, mais elles peuvent se différencier par une stimulation appropriée en réponse à une blessure. Le système de cellules souches est sous l’influence de son microenvironnement, appelé niche des cellules souches. Dans les lésions nerveuses périphériques, en particulier dans la névrotémèse, ce microenvironnement ne peut pas être complètement sauvé même après avoir lié chirurgicalement les terminaisons nerveuses sectionnées ensemble. L’approche des biomatériaux composites et des thérapies cellulaires combinées augmente la fonctionnalité et l’applicabilité des matériaux en termes de propriétés diverses telles que la biodégradabilité, la biocompatibilité et la processabilité. En conséquence, cette étude vise à démontrer la préparation et l’utilisation de motifs d’hydrogel biohybrides à base de graphène et à examiner l’efficacité de différenciation des cellules souches en cellules nerveuses, ce qui peut être une solution efficace dans la régénération nerveuse.

Introduction

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Le système nerveux, qui est le mécanisme qui relie la structure interne de l’organisme et de l’environnement, est divisé en deux parties: le système nerveux central et périphérique. Les lésions nerveuses périphériques sont un problème global qui représente 1,5% à 5% des patients qui se présentent à l’urgence et se développent en raison de divers traumatismes, entraînant des pertes d’emploi importantes 1,2,3.

Aujourd’hui, les approches cellulaires de la neuro-ingénierie périphérique sont d’un grand intérêt. Les cellules souches viennent en premier parmi les cellules utilisées dans ces approches. Dans des conditions normales, les cellules souches sont les cellules régénératrices du corps, et leur nombre et leurs fonctions ne diminuent pas avec le temps pour protéger leurs populations; Ces cellules sont spécialisées mais peuvent se différencier sur une stimulation appropriée en réponse à une blessure 4,5. Selon l’hypothèse des cellules souches, le système de cellules souches est sous l’influence de son microenvironnement, appelé niche des cellules souches. La conservation et la différenciation des cellules souches sont impossibles sans la présence de leur microenvironnement6, qui peut être reconstitué par ingénierie tissulaire à l’aide de cellules et d’échafaudages7. Le génie tissulaire est un domaine multidisciplinaire qui comprend à la fois des principes d’ingénierie et de biologie. L’ingénierie tissulaire fournit des outils pour la création de tissus artificiels qui peuvent remplacer les tissus vivants et peuvent être utilisés dans la régénération de ces tissus en enlevant les tissus endommagés et en fournissant des tissus fonctionnels8. Les échafaudages tissulaires, l’une des trois pierres angulaires de l’ingénierie tissulaire, sont produits à l’aide de méthodes différentes à partir de matériaux naturels et synthétiques9. L’impression tridimensionnelle (3D) est une technologie émergente de fabrication additive largement utilisée pour remplacer ou restaurer les tissus défectueux grâce à sa production simple mais polyvalente de formes complexes à l’aide de diverses méthodes. La bio-impression est une méthode de fabrication additive qui permet la coexistence de cellules et de biomatériaux, appelée bioencres10. Compte tenu de l’interaction des cellules nerveuses entre elles, les études se sont orientées vers des biomatériaux candidats conducteurs tels que le graphène. Les nanoplaques de graphène, qui ont des propriétés telles que l’électronique flexible, les supercondensateurs, les batteries, l’optique, les capteurs électrochimiques et le stockage d’énergie, sont un biomatériau privilégié dans le domaine de l’ingénierie tissulaire11. Le graphène a été utilisé dans des études où la prolifération et la régénération de tissus et d’organes endommagés ont été effectuées12,13.

L’ingénierie tissulaire se compose de trois blocs de construction de base: l’échafaudage, les cellules et les molécules de biosignal. Il y a des lacunes dans les études sur les lésions nerveuses périphériques en termes de fourniture complète de ces trois structures. Divers problèmes ont été rencontrés dans les biomatériaux produits et utilisés dans les études, tels que le fait qu’ils ne contiennent que des cellules souches ou des molécules biosignales, l’absence d’une molécule bioactive permettant la différenciation des cellules souches, le manque de biocompatibilité du biomatériau utilisé et le faible effet sur la prolifération des cellules dans la niche tissulaire, et, par conséquent, la conduction nerveuse n’étant pas pleinement réalisée 2,13,14,15,16. Cela nécessite l’optimisation de la régénération nerveuse, la réduction de l’atrophie musculaire 17,18 et la création de la réponse nécessaire19 avec des facteurs de croissance contre de tels problèmes. À ce stade, la caractérisation et l’analyse de la neuroactivité d’un prototype de biomatériau chirurgical, à transférer à la clinique, sont très importantes.

En conséquence, cette étude de méthodes étudie la structuration d’hydrogel de bio-encre avec des nanoplaques de graphène formées par une bioimprimante 3D et son efficacité sur la différenciation neurogène des cellules souches qu’elle contient. En outre, les effets du graphène sur la formation et la différenciation des neurosphères sont étudiés.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Culture de cellules souches mésenchymateuses de gelée de Wharton

  1. Sortez les cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton (WJ-MSCs, de l’ATCC) d’un congélateur à -80 °C. Culture de CSM WJ-dans un milieu DMEM-F12 contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de Pen-Strep et 1 % de L-glutamine dans un flux laminaire stérile à température ambiante, comme décrit dans Yurie et coll.20.
  2. Cryoconserver certaines cellules à 1 x 106 cellules/mL avec un milieu de congélation contenant 35 % de FBS, 55 % de DMEMF-12 et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Pour cela, comptez 1 x 106 cellules sur une lame de comptage de cellules de Thoma et ajoutez la solution de congélation goutte à goutte. Transférez rapidement la lame dans un récipient d’azote liquide.
  3. Lorsque les cellules cultivées sont confluentes à 80 % dans le flacon, verser le milieu et laver avec 5 ml de PBS. Ajouter 5 mL de trypsine à 0,25 % et 2,21 mM d’EDTA-4Na. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min.
  4. Ajouter 10 mL de milieu DMEM-F12 avec 10% FBS aux cellules retirées de l’incubateur. Bien le suspendre, recueillir le fluide et transférer le fluide dans un tube à centrifuger.
  5. Centrifuger à une vitesse de rotation de 101 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et réensemencer les cellules dans de nouvelles fioles avec un milieu nutritif frais contenant 10% de FBS.
    REMARQUE: Les CSM-WJ commerciales marquées avec le gène GFP par la méthode de transduction peuvent être utilisées pour mieux visualiser les interactions biomatériau-cellule à produire21. Les groupes à utiliser dans cette méthode peuvent être créés comme indiqué dans le tableau 1.

Groupes créésRaisons de créerNombre de représentants
2D WJ-MSC (2D-C)Contrôle 2Dx 5
2D WJ-MSCs & graphène (2D-G)Détermination de la dose toxique de graphène en 2Dx 5 répétitions à chacune des différentes concentrations
Les WJ-MSC sont inclus dans les bio-encres (3D-B)Contrôle 3Dx 3
Les WJ-MSC et 0,1% de graphène sont inclus dans les bio-encres (3D-G)Groupe biohybride graphène-bioencre 3Dx 3
Les WJ-MSC sont sous forme sphéroïde sur les bio-encres (3D-BS)Contrôle 3D de la forme sphéroïdex 3
WJ-MSCs & 0,1% de graphène sont sous forme sphéroïde sur les bio-encres (groupe 3D-GS)Groupe biohybride graphène-bioencre 3D de forme sphéroïdex3
Goutte 3D BioinkIl est produit pour l’analyse de caractérisation SEM et FTIR.x5
Goutte de graphène 3DIl est produit pour l’analyse de caractérisation SEM et FTIR.x5
Bioink 3D avec GFP marqué WJ-MSCs & 0,1%Observation des mouvements des CML dans la bioencre contenant la dose appropriée de graphène.x3

Tableau 1. Groupes dans la méthode. Tous les groupes 2D et 3D de la méthode sont inclus.

2. Toxicité du graphène et imagerie 2D

  1. Préparation des concentrations de graphène et application aux cellules
    NOTE: Les nanoparticules de graphène brutes ont été achetées dans le commerce (type nanoplaques de graphène industrielles) et ont également été données. Les dimensions des particules étaient de 5 à 8 nm d’épaisseur, 5 μm de diamètre et 120 à 150 m2/g de surface.
    1. Peser le graphène pour créer une solution à 1% (mg / mL). Fabriquer une solution mère en ajoutant 10 ml de milieu DMEMF-12 avec 10% FBS aux 100 μg pesés de nanoparticules de graphène et étiqueter cette solution comme solution mère. Stériliser dans un autoclave à 121 °C sous une pression de 1,5 atm pendant 20 min.
      NOTE: Le mélange de graphène stérile est conservé au réfrigérateur à 4 ° C jusqu’à utilisation. Il peut ne pas convenir à une utilisation à long terme (maximum 1 mois). Dans ces cas, le mélange doit être reconstitué et stérilisé.
    2. Préparer un mélange de graphène milieu à différentes concentrations pour déterminer les doses non toxiques. Fixer les dilutions initiales à 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 % et 0,0001 % graphène/milieu.
    3. En commençant par la solution mère à 1 %, prélever 1 mL successivement de chaque concentration et la transférer dans un nouveau tube. Ajouter 9 mL de milieu DMEMF-12 avec 10% FBS à chaque tube, en faisant cinq échantillons progressivement dilués, et agiter et vorter les solutions pour obtenir une distribution égale. Utilisez seulement 10 mL de milieu DMEMF-12 avec 10% FBS comme témoin.
      NOTE: Les flocons lourds de graphène précipitent et, par conséquent, doivent être redistribués.
    4. Ensemencer les CSM WJ dans des plaques à 6 puits avec 2 mL de milieu frais contenant 10 % de FBS à 5 x 105 cellules par puits. Incuber pendant 1 jour à 37 °C. Ensuite, divisez les plaques en groupes de puits égaux et répétés. Faites cinq répétitions pour chaque concentration.
    5. Jeter le milieu, puis remplacer le milieu par des concentrations de milieu de graphène à 2 mL par puits. Utilisez uniquement le milieu pour le groupe témoin. Incuber les plaques à 37 °C pendant 24 h.
  2. Détermination des concentrations non toxiques de graphène avec MTT
    1. Jeter les médias avec du graphène après 24 h. Lavez bien chaque avec du PBS. Ajouter le milieu DMEMF-12 frais avec 10% FBS à 2 ml par puits.
      REMARQUE: Il est important de laver avec du PBS après l’application de concentrations de graphène sur la cellule, car les nanoparticules de graphène, qui ne sont pas introduites dans la cellule par endocytose, sont éliminées de l’environnement. Cela rend le test MTT plus efficace.
    2. Utiliser le protocole MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium) pour déterminer la valeur de CI50 indiquant une viabilité cellulaire de 50 %, comme décrit dans Kose et coll.22 et aux étapes 2.2.3.-2.2.6.
    3. Tout d’abord, peser 5 mg / mL de sel MTT et dissoudre dans du PBS. Stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 μm. Envelopper la solution MTT, fabriquée dans un tube à centrifuger de 15 mL, avec une feuille d’aluminium et conserver à 4 °C.
    4. Ajouter 10 μL de MTT à tous les puits et incuber la plaque pendant 4 h à 37 °C. Observez la formation de cristaux de formazan à un grossissement de 10x au microscope après incubation.
    5. Pour dissoudre les cristaux formés dans les cellules, ajoutez 100 μL de DMSO à chaque puits et mélangez par pipetage. Gardez la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques ELISA. Réglez une longueur d’onde de 570 nm à partir du programme de mesure de l’absorbance et faites-lui lire la plaque22.
      REMARQUE: En outre, alors que les particules de graphène seules sont lues à 270 nm23, la plage de lecture de 570 nm24 ici sera uniquement pour la lecture de la viabilité cellulaire.
    6. Effectuez une analyse statistique sur les résultats obtenus à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey dans un programme d’analyse statistique.
  3. Imagerie par point
    1. Pour examiner l’interaction de différentes concentrations de graphène avec les cellules, effectuez un time-lapse des cellules avec la méthode appelée imagerie par point de couture. Cette méthode crée une image accélérée à l’aide d’échantillons d’images prélevés à intervalles réguliers au microscope.
    2. Pour ce faire, allumez d’abord l’ordinateur. Allumez l’incubateur d’imagerie accéléré et réglez-le à 37 °C. Placez la plaque MTT dans la fente de l’incubateur time-lapse.
    3. Ouvrez le programme Stitch sur l’ordinateur. Spécifiez les puits à lire dans le système. Amenez le lecteur au premier puits et localisez et concentrez la zone à un grossissement de 10x en lumière blanche. Démarrez le programme.
      REMARQUE: Il s’agit d’un programme permettant de créer des collages de photos multiples de 4 lignes x 5 colonnes de haute qualité. Le programme combine des photos prises les unes après les autres en qualité HD. Lorsque vous appuyez sur le bouton de démarrage du système, les puits sont automatiquement lus, et il prend et assemble 4 lignes x 5 colonnes plusieurs photos.

3. Production d’hydrogel biohybride graphène - Bioink et différenciation WJ-MSCs

  1. Production de bio-encres
    NOTE: Les poudres lyophilisées d’alginate-gélatine (3:5) disponibles dans le commerce sont utilisées comme base de bio-encres. Le groupe bioencre graphène (3D-G; 3D-GS) et le groupe bioencre témoin sans graphène (3D-B; 3D-BS) sont préparés avec la même méthode (tableau 1).
    1. Utilisez des tubes coniques de 50 ml pour la préparation. Tout d’abord, peser 4,5 mg d’alginate et 1,5 mg de gélatine et transférer dans un tube à centrifuger. Ajouter le milieu DMEMF-12 contenant 10 % de FBS au mélange jusqu’à un volume total de 50 mL. C’est le groupe témoin (C) sans graphène.
    2. Répéter la pondération de 4,5 mg d’alginate et de 1,5 mg de gélatine et transférer dans un tube à centrifuger. Ensuite, prenez 50 μL du graphène préparé à 0,1% de l’étape 2.1.3. et ajoutez-le au tube. Ajouter DMEMF-12 avec 10% FBS à un volume total de 50 mL.
    3. Mélangez d’abord les bio-encres par pipetage, puis par vortex. Stériliser dans un autoclave à 121 °C sous une pression de 1,5 atm pendant 20 min. Sinon, effectuez la stérilisation au micro-ondes jusqu’au point d’ébullition.
    4. Après l’autoclavage des mélanges, centrifuger à 280 x g pendant 2 min à température ambiante pour éliminer les bulles formées. Conserver les bio-encres à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient préparées.
  2. Ajout de WJ-MSCs et bio-impression 3D
    1. Pour compter, laver les cellules lorsqu’il y a 80% de confluence avec environ 5 mL de PBS, et ajouter 5 mL de trypsine à 0,25% et 2,21 mM EDTA 4Na. Laisser agir 5 min à 37 °C.
    2. Ajouter 10 ml de milieu DMEM-F12 avec 10% FBS aux cellules après avoir retiré de l’incubateur. Bien suspendre, recueillir le milieu et le transférer dans un tube à centrifuger. Centrifuger à 101 x g pendant 5 min à température ambiante puis jeter le surnageant.
    3. Laisser environ 250 μL de milieu avec la pastille. Dissoudre à nouveau la pastille dans 1 mL de milieu frais. À 48 μL de milieu, ajouter 2 μL de suspension cellulaire et 50 μL de bleu de trypan (0,4 g de bleu de trypan/100 mL) dans un tube conique (1,5 mL) pour compter4. Pipette bien.
    4. Ajouter environ 10 mL de la suspension de cellules colorées préparée dans une chambre de comptage des cellules de Thoma. Calculez le nombre moyen de cellules tombant dans les carrés des deux côtés du microscope optique.
      Calculer le pourcentage de vitalité (%) = (cellules viables comptées/nombre total de cellules comptées) x 100
      NOTE: L’interaction cellule-bioencre est étudiée de deux manières: (1) Elle peut être imprimée en l’ajoutant dans les bio-encres (3D-B; 3D-G); (2) Les cellules sont ensemencées sur les bio-encres après avoir été pressées, et les cellules forment un sphéroïde (3D-BS; 3D-GS).
    5. Pour l’interaction cellule-bioencre, créez d’abord les groupes bioencre (Tableau 1). Le groupe 1 comprend les impressions 3D-B et 3D-G avec de la bio-encre pour la bio-impression. Le groupe 2 comprend les bio-encres 3D-BS et 3D-GS sur lesquelles des sphéroïdes ont été formés après la bio-impression.
    6. Compter les cellules du groupe 1 de sorte qu’il y ait environ 1 x 107 cellules dans 0,5 mL de milieu. Ajouter 4,5 mL de bio-encre pour porter le volume total à 5 mL. Transférez-le dans les cartouches de l’armoire stérile à l’aide de seringues. Installez les cartouches dans la section extrudeuse correspondante de la bio-imprimante.
    7. Pour le deuxième groupe, prélever 5 mL de chacun des groupes bioencre et les transférer dans des cartouches stériles à l’aide d’un injecteur.
    8. Utilisez la bio-imprimante avec deux têtes d’impression coaxiales et la technologie d’extrusion pneumatique. Définissez la résolution X/Y/Z par micro-pas à 1,25 μm, la largeur d’extrusion à 400 μm et la hauteur d’extrusion à 200 μm. Une grille de 20 mm x 20 mm x 5 mm est l’un des modèles 3D les plus utilisés pour le travail de bio-impression 3D.
    9. Créez les modèles 3D à l’aide de programmes de CAO Web open source. Avant la bio-impression, créez des modèles 3D simples avec l’une des plates-formes open source (par exemple, remplissage). Le modèle peut être linéaire (comme le modèle utilisé ici), en nid d’abeille ou en forme de grille. Exportez et téléchargez au format .stl après avoir créé un carré de 5 mm x 20 mm x 20 mm.
    10. Le logiciel de bio-imprimante utilise des fichiers .stl et les convertit au format .gcode imprimable à l’aide de modules de trancheur. Pour obtenir une forme de grille imprimable, désactivez la coque extérieure dans le module de segment. Essuyez l’appareil avec de l’éthanol à 70% avant le fonctionnement, puis stérilisez par stérilisation UV.
    11. Pour le processus de bio-impression, transférez les groupes bio-encre sur les cartouches à l’aide d’un injecteur. Installez les cartouches dans la section extrudeuse correspondante de la bio-imprimante.
    12. Réglez la pression moyenne de l’imprimante 3D à 7,5 psi et la température de la cartouche et du lit à 37 °C. Réglez la vitesse à 60% et effectuez un processus d’impression 3D standard.
      REMARQUE: La planification des modèles préparés avec des espaces (comme un modèle linéaire) permet de faire la culture cellulaire dans les espaces après la bio-impression.
    13. Mettez le système en position d’origine pendant la phase d’écriture. Positionnez automatiquement les axes (X, Y, Z), sélectionnez l’extrudeuse et réglez. Démarrez le processus d’impression. Après le processus de bio-impression, prélevez l’échantillon et placez-le sous une armoire à flux laminaire.
    14. Vaporiser les bioencres avec une solution de CaCl2 0,1 N après impression ou ajouter 1 mL de la solution avec une pipette à température ambiante. Attendez environ 10-20 s et lavez les motifs imprimés 2x avec du PBS contenant Ca 2+ et Mg2+.
    15. Ajouter 2 mL de DMEMF-12 avec 10% de milieu FBS sur chacun des groupes bioencres contenant des cellules. Incuber les plaques à 37 °C avec 5% de CO2. Ensuite, ajouter 2 mL de milieu de suspension contenant 1 x 106 cellules à chaque groupe pour la formation de sphéroïdes.
    16. Incuber les plaques à 37 °C avec 5% de CO2. Après 24 h d’incubation, observer la formation sphéroïde au microscope inversé.
  3. Différenciation des CMS WJ en cellules de type neurone
    1. Observer et photographier tous les lots de bio-encre après 24 h d’incubation. Ajouter 2 mL de milieu de différenciation neurogène par puits (sauf pour le groupe témoin) et actualiser tous les 2 jours. Suivre pendant 7 jours pour observer la différenciation neuronale.

4. Caractérisation de l’hydrogel biohybride graphène-bioencre

NOTE: L’imagerie accélérée, la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT / IR) et les analyses de microscopie électronique à balayage (MEB) sont effectuées pour la caractérisation de l’hydrogel biohybride graphène-bioencre. Les échantillons sont créés à partir de groupes de bio-encre 3D-B et 3D-G par la méthode goutte à goutte pour l’analyse FT/IR et SEM.

  1. Analyse FT/IR
    NOTE: FT/IR est une méthode analytique chimique basée sur la transformée de Fourier mathématique, indispensable pour la caractérisation des matériaux. Utiliser un dispositif FT/IR basé sur les principes de l’interféromètre Michelson à 28 °C, avec une lampe halogène, une source lumineuse au mercure refroidie à l’eau, un rapport d’aspect du signal de 4 cm−1, mesuré pendant 1 min, à 2 200 cm−1.
    1. Préparez le microscope FT/IR et assurez-vous que l’optique de l’instrument est alignée. Calibrez l’appareil.
    2. Puisque l’échantillon est en goutte, prenez un morceau d’hydrogel de 1-2 mm d’épaisseur et placez-le avec une pince sur la partie de l’échantillon. Concentrez-vous sur l’échantillon et soulevez-le jusqu’à ce qu’un contact étroit soit établi. Collectez le spectre de l’échantillon en démarrant le processus à partir du système.
  2. Analyse par microscopie électronique à balayage (MEB)
    REMARQUE: La morphologie de surface, la structure interne, la distribution cellulaire et les interactions bio-encre-cellule peuvent être examinées par analyse MEB dans différentes dimensions.
    1. Déposer l’hydrogel dans des plaques à 6 puits contenant 1 mL de réticulation CaCl2 en utilisant la méthode des gouttelettes d’extrémité de pipette (voir Figure 1).
    2. Laver les plaques 2x avec environ 1 mL de PBS pour libérer la solution de sels. Ensuite, mettez ces gouttes dans un tube de faucon contenant 5 mL de paraformaldéhyde à 5% à l’aide de forceps.
    3. Faites des sections minces à partir des bio-encres gouttes à l’aide d’un scalpel. Collez les échantillons du côté collant sur la plaque métallique. Insérez dans le dispositif de revêtement où le palladium d’or, qui passe dans la phase plasma en remplaçant l’air par du gaz argon, recouvre l’échantillon.
    4. Mettez-le au microscope électronique (MEB). Ouvrez le programme de microscope auquel le MEB est connecté. Effectuez la mise à l’échelle et prenez des images de différentes parties de l’échantillon. Pour ce protocole, des échelles de 5 μm, 10 μm et 200 μm ont été utilisées. Au total, 40 images ont été prises pour les groupes 3D-B et 3D-G.
  3. Imagerie accélérée
    REMARQUE: Pendant l’imagerie accélérée, non seulement des échantillons de bio-encre contenant des cellules transformées en gène GFP ont été utilisés, mais aussi des bio-encres avec des sphéroïdes sont imagées pendant 16 h. L’imagerie accélérée est réalisée pour examiner les effets du graphène sur les cellules souches et pour surveiller les interactions cellulaires au sein de la bio-encre.
    1. Ajouter 1 x 107 CSM marquées GFP disponibles dans le commerce dans 5 ml de bio-encre et de bioimpression comme à l’étape 3.2.11. Ajouter 1 mL de réticulant, maintenir pendant 20-30 s et laver 2x avec du PBS.
    2. Allumez le moniteur time-lapse et ouvrez le programme sur l’ordinateur. Réglez environ 16 h en mode Time-Lapse et réglez la température à 37 °C. Appuyez sur le bouton Démarrer . Des vidéos sous forme d’échantillons vidéo time-lapse de 40 s sont enregistrées par le système.
    3. Faites la mise au point du microscope à un grossissement de 10x toutes les 2 h. Visualisez également les sphéroïdes créés en suivant les mêmes étapes.

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Figure 1 : Groupes de bioencres 3D-B et 3D-G produits sous forme de gouttes pour la caractérisation. (A) Échantillons de bioencre (image de pré-caractérisation) sur une plaque avec un agent de réticulation. (B) Image de goutte 3D-B de bio-encre. (C) Image de goutte de bio-encre 3D-G. Le biomatériau à caractériser et les cellules qu’il contient peuvent plus facilement passer par des processus tels que le placage d’or, l’échantillonnage, etc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Détermination de la différenciation neurogène par la méthode d’immunomarquage

  1. Recueillir les sphéroïdes, sans interrompre les formes sphériques, et réensemencer dans de nouvelles plaques pour les colorer avec une méthode plus facile, au lieu de les incorporer dans de la paraffine pour la section des tissus.
  2. Couvrir les plaques de 48 puits d’environ 20 ml de solution de gélatine à 0,1 % pré-autoclavée et conserver dans un incubateur pendant au moins 1 h. Pipeter environ 500 μL de gélatine préparée à 0,1 % dans des plaques à 48 puits. Laissez les plaques gélatineuses dans l’incubateur pendant 10 min.
    REMARQUE: Cela permettra à la gélatine de gonfler légèrement, couvrant la surface et créant un meilleur environnement pour les sphéroïdes collectés.
  3. Recueillir les sphéroïdes par pipetage, répartir les sphéroïdes collectés de l’incubateur dans les puits de la plaque de 48 puits et ajouter un milieu frais. Ensuite, incuber pendant 12-24 h.
    NOTE: Il est assez difficile de distribuer les sphéroïdes en comptant. Recueillir les sphéroïdes dans un seul tube et répartir uniformément le volume total dans les puits. Pour cette étude, chaque puits contenait environ 4 à 6 sphéroïdes.
    REMARQUE: Pour les échantillons 2D, le lavage avant tache est suffisant et aucun remplacement de support n’est requis.
  4. Retirez le milieu et lavez lentement les cellules avec du PBS car les sphéroïdes seront au sommet. Fixer dans 4% de paraformaldéhyde pendant 2 h.
  5. Lavez à nouveau les échantillons avec du PBS et bloquez avec environ 10 ml de BSA à 2 % et de TritonX à 0,1 % pendant 30 min. Ensuite, lavez avec PBS 3x.
  6. Diluer les anticorps primeurs sélectionnés (N-cadhérine-lapin et tubuline-souris β-III) dans un rapport de 1:100 avec une solution de réactif diluant d’anticorps. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps à chacun des échantillons et incuber pendant une nuit à 4 °C.
  7. Lavez les échantillons 3x avec du PBS. Incuber avec des anticorps secondaires anti-souris IgG-FTIC-lapin pour la tubuline β-III et un anticorps secondaire anti-souris IgG-SC2781-chèvre pour N-Cad dilué à 1:200 à température ambiante pendant 30 min. Effectuez toutes les opérations dans l’obscurité.
    REMARQUE : Quelle que soit la souche utilisée comme anticorps primaire (p. ex. souris) dans la double coloration, une souche différente (p. ex. chèvre ou lapin) doit être utilisée pour l’anticorps secondaire.
  8. Laver l’anticorps secondaire avec PBS 3x, puis égoutter la solution DAPI (1:1) dans chacun des échantillons. Attendez 15-20 min. Effectuer l’imagerie par immunofluorescence.

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Résultats

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Toxicité du graphène et imagerie 2D
L’analyse statistique des résultats MTT obtenus a été effectuée avec une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey dans un logiciel d’analyse statistique, et le graphique obtenu est illustré à la figure 2. Le pourcentage de graphène par rapport au témoin n’a montré une diminution significative que pour la concentration de graphène de 0,001% (**p < 0,01). Il n’y avait pas de différences significatives entre les autres groupes et l...

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Discussion

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Les avantages des traitements appliqués avec des échafaudages 3D d’ingénierie par rapport aux méthodes 2D conventionnelles deviennent de plus en plus perceptibles chaque jour. Les cellules souches utilisées seules dans ces thérapies ou avec des échafaudages produits à partir de divers biomatériaux à faible biocompatibilité et biodégradabilité sont généralement inadéquates dans la régénération des nerfs périphériques. Les cellules souches mésenchymateuses de gelée de Wharton (WJ-MSCs) semblent être une lignée cellulaire c...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts. Le projet a été réalisé en collaboration avec HD Bioink, développeur de la technologie de bio-impression 3D.

Remerciements

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Le graphène utilisé dans cette étude a été développé à l’Université Kirklareli, Département de génie mécanique. Il a été donné par le Dr Karabeyoğlu. Le test de toxicité du graphène a été financé par le projet intitulé « Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks » (No de demande: 1139B411802273) réalisé dans le cadre du programme de soutien aux thèses de premier cycle TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support. L’autre partie de l’étude a été financée par le fonds de recherche fourni par Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Les cellules souches mésenchymateuses avec GFP utilisées dans la phase d’imagerie time-lapse ont été données par Virostem Biotechnology. Les auteurs remercient Darıcı LAB et l’équipe YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB pour leurs discussions productives.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires

Centrifuge		HitachiUtilisé dans la culture cellulaire et les biomatériaux étape
0.1N CaCl2HD BioinkUtilisé pour réticulant
0.22 & micro ; m filtre à membraneA&iota ; s&iota ; moUtilisé pour la stérilisation
0,45 & micro ; m filtre à seringueA&iota ; s&iota ; moUtilisé pour la stérilisation
Tube conique de 1,5 mlEppendorfaUtilisé pour la goutte
Tube Falcon de 15 mlNestUtilisé dans l’étape de culture cellulaire
Flacons de culture cellulaire de 25 cm2 (Falcon, fioles de culture tissulaire TPPNestUtilisé pour la culture cellulaire
Bio-impression 3DAxolotl Biosystems Bio A2 (Turquie)Étape
de bio-impression50 mL Tube FalconNestUtilisé dans la culture cellulaire étape
6/24/48/96 plaques de puits (Falcon, microplaques TPP)Merck MilliporeUtilisé dans la culture cellulaire étape
75 cm2 flacons de culture cellulaire (Falcon, TPP flacons de culture tissulaireNestUtilisé pour la culture cellulaire
Anti souris IgG-FTIC-lapinSanta Cruz BiotechnologyJ1514Anticorps Seconder, utilisé pour
colorantAnti souris IgG-SC2781-chèvreSanta Cruz BiotechnologyC3109Anticorps Seconder, utilisé pour le dispositif de revêtement Au du colorant
EM ACE600Leicapour le placage d’or de la section du biomatériau avant l’imagerie MEB
AutoclaveNUVE-OT 90LUtilisé pour le processus de stérilisation.
AutoclaveNUVE-OT 90LUtilisé pour le processus de stérilisation.
Cell Cultre CabineHera Safe KSUtilisé pour le processus de culture cellulaire
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249Utilisé comme milieu de culture cellulaire
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450pour SEM
Sérum de veau fœtal-FBSCapricornFBS-16AIl a été utilisé en ajoutant au milieu de culture cellulaire.
Congélateur -80° ; CPanasonicMDF-U5386S-PENous avons été utilisés pour stocker des cellules et les exosomes résultants Poudre
bioencre gélatine-alginateHD BioinkUtilisé pour l’étape de bioencre produite
GFP labelled-WJ-MSCsVirostemUtilisé pour l’imagerie de l’interaction cellule-bioink
Nanoplaquettes de graphène (Graphene-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Utilisé pour la production 3D-G
bioink Anticorps d’immunofluorescence (N-CAD ; &beta ;-III Tubuline)Signalisation cellulaire et Santa CruzUtilisé pour le colorant
JASCO 6600Tetrapour FTIR
MTT AssaySigma Test deviabilité
Péniciline/Streptomycine SolutionCapricornPB-SIl a été ajouté au milieu pour éviter la contamination en culture cellulaire.
LameThoma IsolabUtilisé pour le comptage des cellules Système d’imagerie
Time-LapseZeiss Axio.Observer.Z1Imagerie
Tripsin-EDTAMulticellLe flacon a été utilisé pour retirer les cellules recouvrant la surface.
VorteksBiobasePour l’étape de bioencre produite
WJ-MSCsATCCUtilisé pour le processus de culture cellulaire
de bioencre de

Références

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