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Article de méthode

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/63658

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2 mars 2022

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) réside à l’arrière de l’œil et remplit des fonctions essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité des tissus rétiniens et vasculaires adjacents. À l’heure actuelle, la capacité réparatrice limitée de l’EPR des mammifères, qui se limite aux petites blessures, a entravé les progrès dans la compréhension des processus de régénération de l’EPR in vivo . Ici, une méthodologie détaillée est fournie pour faciliter l’étude de la réparation in vivo de l’EPR à l’aide du poisson-zèbre, un modèle de vertébré capable d’une régénération tissulaire robuste. Ce protocole décrit un paradigme de lésion transgénique médié par la nitroréductase / métronidazole (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP), qui entraîne l’ablation des deux tiers centraux de l’EPR après un traitement de 24 heures par MTZ, avec récupération tissulaire ultérieure. L’accent est mis sur les ablations de l’EPR chez les larves de poisson-zèbre et les méthodes de test des effets des composés pharmacologiques sur la régénération de l’EPR sont également décrites. La génération et la validation de RpEGEN, un script MATLAB créé pour automatiser la quantification de la régénération RPE basée sur la pigmentation, sont également abordées. Au-delà des mécanismes actifs de réparation de l’EPR, ce protocole peut être étendu aux études de la dégénérescence de l’EPR et des réponses aux blessures, ainsi que des effets des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents, entre autres processus cellulaires et moléculaires. Ce système de poisson-zèbre est très prometteur dans l’identification des gènes, des réseaux et des processus qui stimulent la régénération de l’EPR et les mécanismes liés à la maladie de l’EPR, dans le but à long terme d’appliquer ces connaissances aux systèmes mammifères et, en fin de compte, au développement thérapeutique.

Introduction

La méthodologie décrite ici détaille un protocole pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide de larves de poisson-zèbre. L’EPR s’étend sur l’arrière de l’œil et réside entre les couches stratifiées de la rétine neurale et la couche de vascularisation constituant la choroïde. Le soutien trophique, l’absorption de la lumière phototoxique et le maintien des protéines du cycle visuel ne sont que quelques-unes des fonctions critiques de l’EPR qui sont essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité de ces tissus adjacents1. Les dommages causés à l’EPR chez les mammifères sont réparables lorsque les lésions sont petites2; cependant, les dommages subis par des blessures plus importantes ou une maladie dégénérative progressive sont irréversibles. Chez l’homme, les maladies dégénératives de l’EPR (p. ex., la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la maladie de Stargardt) entraînent une perte de vision permanente et, avec peu d’options de traitement disponibles, une diminution de la qualité de vie des patients. La capacité limitée des RPE des mammifères à s’auto-réparer a créé un manque de connaissances dans le domaine des processus de régénération des EPR. Compte tenu de la capacité de régénération robuste du poisson-zèbre dans de nombreux types de tissus différents, ce protocole a été développé pour établir un système de vertébrés in vivo afin de faciliter les études sur l’EPR à régénération intrinsèque et de découvrir les mécanismes qui déterminent cette réponse. En utilisant le paradigme d’ablation décrit ici, la voie de signalisation canonique Wnt3, la voie mTOR4 et les réponses immunitaires5 ont été identifiées comme des médiateurs critiques de la régénération de l’EPR, probablement avec des fonctions qui se chevauchent.

Dans ce paradigme d’ablation génétique, le poisson-zèbre Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 exprime le gène6 de la nitroréductase dérivée de bactéries (NTR/nfsB) fusionné à l’eGFP sous le contrôle de l’élément amplificateur RPE, rpe65a7. L’ablation est obtenue en ajoutant le promédicament, le métronidazole (MTZ), à l’eau du système abritant le poisson-zèbre. L’activation intracellulaire de MTZ par la nitroréductase entraîne la réticulation de l’ADN et l’apoptose dans les cellules exprimant NTR/nfsB 8,9. Cette technologie a été largement utilisée chez le poisson-zèbre pour ablation des cellules de la rétine 10,11,12,13 et d’autres tissus 8. Ensemble, ces éléments permettent l’expression ciblée (rpe65a) d’une méthodologie d’ablation cellulaire inductible (NTR/MTZ)8,9 et d’un marqueur fluorescent (eGFP) pour la visualisation.

Il existe également d’autres modèles in vivo intéressants qui peuvent être utilisés pour étudier le potentiel de régénération de l’EPR14. Ceux-ci sont larges et comprennent la transdifférenciation de l’EPR à la rétine après la rétinbectomie chez les amphibiens, dans laquelle les cellules d’EPR perdues par la repousse rétinienne sont remplacées15,16; Restauration de l’EPR après une blessure chez la souris LMR/MpJ « super cicatrisante »17; et stimulation exogène de la prolifération de l’EPR chez un modèle de rat d’EPR spontanée et de dégénérescence rétinienne18, entre autres. Des modèles in vitro, tels que les cellules souches EPR humaines adultes (CSP)19 ont également été mis au point. Ces modèles sont tous des outils précieux qui permettent de découvrir les processus cellulaires liés à la régénération de l’EPR (p. ex., prolifération, différenciation, etc.); cependant, le poisson-zèbre est unique dans sa capacité de réparation intrinsèque de l’EPR après l’ablation.

Bien que la méthodologie ici soit écrite pour se concentrer sur la compréhension des mécanismes à l’origine de la régénération de l’EPR, la lignée Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) et ce protocole d’ablation génétique pourraient être utilisés pour étudier d’autres processus cellulaires tels que l’apoptose de l’EPR, la dégénérescence de l’EPR et l’effet des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents. Le protocole d’ablation peut également être modifié pour inclure la manipulation pharmacologique, qui est une stratégie préliminaire pratique pour dépister les voies de signalisation d’intérêt. Par exemple, il a été démontré que le blocage de la voie Wnt canonique à l’aide de l’inhibiteur de la réponse Wnt-1 (IWR-1)20 altère la régénération del’EPR 3. Cela a été répété ici pour guider les utilisateurs à travers une expérience de manipulation pharmacologique et servir de preuve de concept pour valider un script MATLAB (RpEGEN) créé pour quantifier la régénération RPE basée sur la récupération de la pigmentation. Comme la lignée transgénique et le protocole d’ablation, les scripts RpEGEN sont adaptables et pourraient être utilisés pour quantifier d’autres marqueurs / processus cellulaires au sein de l’EPR.

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Protocole

Toutes les méthodologies décrites dans le présent document sont conformes à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Pittsburgh.

1. Préparation avant la collecte d’embryons de poisson zèbre

  1. Réglez l’incubateur d’embryons à 28,5 °C.
  2. Préparer une solution mère 25x de l’inhibiteur de la mélanogenèse, la N-phénylthiourée (PTU)21,22. Cette solution mère est mise à l’échelle à partir d’une recette commune22 et 1x est égale à 0,003% de poids par volume (% p / v) (par exemple, 0,003 g de poudre de PTU dans 100 mL de solvant liquide).
    1. Pour obtenir une grande solution mère de PTU 25x, ajouter 0,75 g de poudre de PTU à 1 L d’eau désionisée purifiée (ci-après dénommée dH2O) et bien mélanger à température ambiante (~25 °C) à l’aide d’un agitateur et d’une plaque à agiter. Conserver à 4°C jusqu’à 3 mois à l’abri de la lumière.
      REMARQUE: Il est difficile d’obtenir PTU pour aller dans la solution aqueuse et une agitation prolongée pendant la nuit peut être nécessaire.
      ATTENTION : La PTU est dangereuse et des précautions doivent être prises pour prévenir l’ingestion, l’inhalation et/ou le contact avec la peau ou les yeux. La poudre de PTU et tous les dérivés liquides de PTU décrits dans le présent document peuvent devoir être éliminés en tant que déchets chimiques en fonction des réglementations étatiques et institutionnelles. La confirmation des méthodes appropriées d’élimination des déchets de PTU, le cas échéant, est recommandée avant utilisation.
    2. Pour obtenir une solution de travail 1,5x PTU (ci-après dénommée 1,5x PTU), ajouter 60 mL de solution mère 25x PTU à 940 mL d’eau d’installation de logement de poisson zèbre (ci-après dénommée eau de système). Des paramètres optimaux de qualité de l’eau pour le poisson-zèbre ont été décrits23 et les installations aquatiques devraient avoir des procédures normalisées de surveillance de l’eau. Conservez 1,5x PTU à 28,5 °C pendant 1 à 2 semaines à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Ce protocole est exécuté régulièrement à l’aide des concentrations de PTU, des solvants et des paramètres de stockage décrits à l’étape 1.2. Par mesure de précaution, les embryons / larves doivent être observés tous les 1-2 jours pendant qu’ils sont dans la PTU pour valider l’efficacité et confirmer une dépigmentation soutenue. Les conditions de dissolution et/ou de stockage doivent être optimisées si l’on soupçonne une diminution de la solubilité et de l’efficacité de la PTU.
  3. Préparer une solution mère de 0,05 % p/v de bleu de méthylène, un inhibiteur de croissance fongique, en ajoutant 0,05 g de poudre de bleu de méthylène à 100 mL de dH2O. Mélanger soigneusement à l’aide d’un agitateur et d’une plaque à remuer. Conserver à 4°C.
  4. Préparer les pipettes pour la manipulation des embryons et des larves (p. ex., déplacement d’embryons ou de larves entre les boîtes de Pétri, séparation des larves pendant le dépistage par fluorescence, collecte des larves euthanasiées dans des tubes de microcentrifugation pour les fixer, etc.) en coupant l’extrémité effilée d’une pipette Pasteur en verre à l’aide d’un stylo à pointe de diamant. Gravez autour de la circonférence de la pipette avec le stylo diamant et tirez doucement ou enclenchez l’extrémité pour faire une pause nette.
    REMARQUE: La bouche de la pipette doit être lisse et assez large pour prendre facilement un embryon encore à l’intérieur du chorion sans cisaillement. Utilisez une pipette de transfert de tirage d’ampoule comme alternative. Les pipettes préparées peuvent également être utilisées pour éliminer le liquide lors des changements d’eau (plutôt que de verser) afin de minimiser la perte d’embryons / larves.
  5. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (p. ex., ajouter 10 mL de PFA à 16 % à 4 mL de 10x PBS et 26 mL de dH2O). Conserver à 4°C jusqu’à 4 semaines à l’abri de la lumière.
    ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un produit chimique dangereux et doit être manipulé dans une hotte chimique et éliminé correctement. Des précautions doivent être prises et un équipement de protection individuelle (EPI) doit être porté pour éviter l’ingestion, l’inhalation et/ou le contact avec la peau ou les yeux.

2. Collecte et entretien des embryons de poisson-zèbre avant l’ablation génétique (0 à 5 jours après la fécondation)

  1. Maintenir le poisson-zèbre adulte comme décrit précédemment 3,4,5. L’après-midi et la soirée précédant la collecte des embryons, séparez les poissons-zèbres adultes dans des bassins d’élevage pour le frai.
  2. Le lendemain matin (0 jour après la fécondation (dpf)), prélever les embryons dans des boîtes de Petri de 10 cm de diamètre dans de l’eau du système et retirer tous les ovules non viables ou non fécondés, qui apparaîtront opaques et/ou présenteront un cytoplasme irrégulier et un clivage raté24.
    REMARQUE: Des événements normaux de clivage et de stadification du développement seront apparents chez les embryons sains tels que décrits25. Les boîtes de Petri doivent être maintenues pleines aux trois quarts (~30 mL pour une boîte de 10 cm de diamètre) tout au long du protocole.
    1. Ajouter deux gouttes de 0,05 % p/v de bleu de méthylène dans chaque boîte de Pétri, mélanger doucement et conserver les embryons à 28,5 °C pour le reste du protocole.
  3. Environ 6 h après la fécondation (hpf)4,5,26, remplacez l’eau du système dans les boîtes de Petri embryonnaires par 1,5x PTU (solution de travail faite à l’étape 1.2.2) et reconstituez le bleu de méthylène.
    REMARQUE: La PTU doit être ajoutée aux embryons avant le début de la pigmentation (c.-à-d. avant 24 hpf)25 car les tissus déjà pigmentés ne se dépigmenteront pas lors de l’ajout de PTU21. Il convient toutefois de noter qu’une réduction de la taille des yeux, des déficits oculaires et craniofaciaux et une perturbation de certaines voies de signalisation (par exemple, la signalisation thyroïdienne) ont été rapportés chez le poisson-zèbre traité par PTU 27,28,29. La toxicité de la PTU pour le développement semble dépendre de la concentration et du moment de l’ajout de PTU27,29. Comme mentionné ci-dessus pour valider l’efficacité de la PTU (étape 1.2), les signes de toxicité de la PTU doivent également être surveillés attentivement et, en cas de suspicion, la concentration de travail et / ou le temps d’ajout de PTU doivent être optimisés.
  4. Sur 2-3 dpf, déséchorionater les embryons à l’aide d’une solution de pronase fraîchement préparée.
    1. Dissoudre la pronase dans 1,5x PTU à une concentration de 2 mg/mL par vortex.
      ATTENTION: La pronase est emballée sous forme de poudre très fine et est irritante. Prendre des mesures pour éviter l’inhalation et/ou le contact avec la peau, les yeux, etc.
    2. Séparez les embryons éclos des embryons non éclos et ne traitez que les embryons non éclos.
    3. Remplacer 1,5x PTU par une solution de pronase de 2 mg/mL faite à l’étape 2.4.1 et laisser sur des embryons non éclos pendant 4-5 min avec une agitation douce (par exemple, sur un rotateur/agitateur de table ou par tourbillon manuel).
    4. Versez la solution de pronase et rincez immédiatement avec 1,5x PTU frais. Triturer délicatement 1,5x PTU rincer sur les embryons avec une pipette de transfert à tirage d’ampoule.
    5. Répétez un deuxième rinçage PTU 1,5x pour éliminer tous les débris de chorion, puis reconstituez 1,5x PTU pour l’entretien.
      REMARQUE: Les embryons peuvent également être déconionnés manuellement à l’aide de pinces à pointe fine. Dans ce cas, les débris de chorion doivent être enlevés et 1,5x PTU réapprovisionné après la déschorionation manuelle.
  5. Surveillez la santé des embryons / larves et reconstituez 1,5 fois la PTU tous les 1 à 2 jours. Les embryons/larves sont conservés dans 1,5x PTU jusqu’à l’ablation à 5 dpf.
    REMARQUE : L’importance des étapes 2.3 et 2.4 est abordée plus en détail dans la section Discussion.

3. Dépistage des larves de poisson zèbre pour rpe65a:nfsB-eGFP et ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (5-6 jours après la fécondation)

  1. Faire une solution fraîche de métronidazole (MTZ) de 10 mM sur 5 dpf (jour d’ablation). Ce processus prend 2 h à compléter.
    1. Ajouter la poudre de MTZ à l’eau du système sans PTU et bien mélanger en agitant vigoureusement (par exemple, 250 rotations par min) pendant 1 h à 37 °C.
    2. Refroidir la solution MTZ de 10 mM pendant 1 h supplémentaire à température ambiante sur un rotateur/agitateur de table et assurer une dissolution complète avant d’ajouter aux boîtes de Pétri avec des larves.
      REMARQUE: Le criblage par fluorescence et la séparation des larves d’eGFP+ (étape 3.2) peuvent être effectués pendant les incubations à 37 °C et à température ambiante.
      ATTENTION : La MTZ est dangereuse et des précautions doivent être prises pour prévenir l’ingestion, l’inhalation et/ou le contact avec la peau ou les yeux. La poudre de MTZ et tous les dérivés liquides décrits dans le présent document peuvent devoir être éliminés en tant que déchets chimiques en fonction des réglementations étatiques et institutionnelles. La confirmation des méthodes appropriées d’élimination des déchets MTZ, le cas échéant, est recommandée avant utilisation.
  2. Filtrer les larves de poisson zèbre pour le transgène rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Anesthésier les larves avec 0,168 g/L de tricaïne (MS-222) et séparer les larves transgéniques (eGFP+) (Figure 1) des larves non transgéniques (eGFP-) à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence avec un laser/filtre à excitation de 488 nm.
      REMARQUE: La tricaïne doit être ajoutée à 1,5x PTU et / ou à des solutions de composés pharmacologiques, car les larves doivent rester immergées dans le traitement pendant le dépistage de l’eGFP. Incuber les larves dans la tricaïne uniquement pendant la durée du dépistage (p. ex., ≤10 min pour une seule boîte de Pétri de 10 cm contenant 50 larves).
    2. Réveillez immédiatement les larves filtrées en pipetant directement dans une boîte de Pétri avec 1,5x PTU frais sans tricaïne.
    3. Une fois le dépistage terminé, séparez davantage les larves d’eGFP+ en deux groupes de boîtes de Pétri : un groupe pour recevoir un traitement MTZ (ablation/MTZ+) et un groupe pour être le témoin non atténué (MTZ-).
  3. Ablation de l’épithélium pigmentaire rétinien.
    1. Retirez 1,5 fois le PTU des plats de contrôle non atténués (MTZ-) et ajoutez de l’eau fraîche du système sans PTU.
    2. Retirer 1,5x PTU des plats de traitement ablés (MTZ+) et ajouter la solution de MTZ 10 mM fraîchement préparée (étape 3.1.).
    3. Retirez la solution MTZ de 10 mM après exactement 24 h (désigné 1 jour après la blessure (dpi)) et ajoutez de l’eau douce du système sans PTU. Changez l’eau fraîche du système sans PTU sur le(s) plat(x) MTZ. Les larves ne seront plus exposées à la PTU pour le reste du protocole.
      REMARQUE: Il peut être difficile de pipeter ou de verser tous les 1,5x PTU (étapes 3.3.1 et 3.3.2) ou 10 mM MTZ (étape 3.3.3) entre les échanges de solution sans perte larvaire car les animaux nagent activement. Dans ce cas, un lavage de l’eau du système sans PTU peut être ajouté pour assurer un échange de solution réussi.

4. Entretien larvaire post-ablation génétique (6+ jours après la fécondation)

  1. Vérifiez les larves et reconstituez l’eau du système sans UTP tous les jours jusqu’à l’euthanasie (étape 5.6) ou retournez à l’installation d’hébergement du poisson-zèbre.
  2. Surveiller le succès et l’étendue de l’ablation in vivo sur 2 dpi (7 dpf) à l’aide de l’éclairage lumineux transmis sur un stéréomicroscope (Figure 2).

5. Intégration d’un traitement pharmacologique dans le protocole d’ablation de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

REMARQUE: Comme effectué précédemment3, le traitement avec un IWR-1 de 15 μM ou un contrôle de véhicule de diméthylsulfoxyde de méthyle (DMSO) apparié en fonction du volume à partir de 4 dpf est décrit ici à titre d’exemple d’expérience pour tester RpEGEN. Les concentrations et les délais peuvent varier selon les différents composés pharmacologiques et les recommandations pour la validation dose-réponse, la durée du traitement, le dépistage et d’autres aspects de la conception expérimentale pour les études de manipulation pharmacologique sont abordées dans la section Discussion. Suivez les étapes 6 et 7 si une analyse d’image est requise.

  1. Prélever et conserver les embryons comme décrit à l’étape 2. Déséchorionates embryons sur 2 dpf.
  2. Dépister les larves eGFP+ sur 4 dpf comme décrit à l’étape 3.2. Plutôt que des boîtes de Pétri, placez les larves d’eGFP+ dans des plaques de 6 puits à une densité de n ≤ 10 larves par 6 puits pour un traitement pharmacologique. Désignez des plaques séparées de 6 puits pour les larves qui seront non abrées (MTZ-) et les larves qui seront ablées (MTZ+).
    REMARQUE: Le signal eGFP est visible sur 4 dpf mais apparaît plus faible que l’intensité du signal sur 5 dpf.
  3. Prétraitez 4 larves dpf eGFP+ avec 15 μM d’IWR-1 ou un contrôle de véhicule DMSO en fonction du volume pendant exactement 24 h avant l’ablation génétique avec une solution de MTZ de 10 mM.
    REMARQUE: Souvent, très peu de composé est nécessaire pour les expériences de traitement pharmacologique. Pour éviter de peser de petites quantités de poudre d’IWR-1, ce composé pharmacologique est acheté déjà en solution de DMSO, à une concentration de 25 mM, et alicité en plus petits volumes à l’arrivée pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
    1. Déterminer le volume des traitements pharmacologiques et de contrôle du véhicule nécessaires et aliquote 1,5x PTU dans les tubes coniques en conséquence. Un volume de 5 mL/puits d’une plaque de 6 puits est recommandé.
    2. Ajouter la souche IWR-1 à 1,5x PTU pour une concentration finale de 15 μM IWR-1 (p. ex., 3 μL de 25 mM IWR-1 par 5 mL de 1,5x PTU). Ajoutez un volume correspondant de stock de DMSO à 1,5x PTU (par exemple, 3 μL ≥ 99,7% de DMSO par 5 mL de 1,5x PTU). Ici, cela finira par donner une concentration finale de 0,06% volume / volume (% v / v) DMSO. Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés.
      ATTENTION: Le DMSO, l’IWR-1 et d’autres composés et solvants pharmacologiques peuvent devoir être éliminés en tant que déchets chimiques en fonction des réglementations étatiques et institutionnelles. La confirmation de la niveau de danger et des méthodes appropriées d’élimination des déchets pour ces composés, le cas échéant, est recommandée avant utilisation.
    3. Retirer 1,5x PTU des larves eGFP+ dans des plaques à 6 puits et ajouter 5 mL/puits de traitements DMSO à 0,06 % v/v fraîchement préparés ou 15 μM iWR-1 à partir de l’étape 5.3.2.
  4. Sur 5 dpf, ablation du RPE. En plus du prétraitement de 24 heures (étape 5.3), les larves resteront immergées dans des traitements pharmacologiques et de contrôle des véhicules pendant 24 heures d’ablation génétique avec 10 mM de MTZ et pendant la récupération post-ablation, jusqu’à la fixation (par exemple, de 4 à 9 dpf).
    1. Faire une solution de MTZ de 10 mM 2 h avant d’effectuer une ablation génétique (étape 3.1).
    2. Déterminer le volume des traitements pharmacologiques et de contrôle du véhicule nécessaires pour les plaques de 6 puits non agglomérées (MTZ-) et ablées (MTZ+) et aliquoter les volumes appropriés d’eau douce du système sans PTU (MTZ-) ou de solution de MTZ de 10 mM (MTZ+) dans des tubes coniques. Cela donnera quatre conditions de traitement: 1) 0,06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06 % v/v DMSO, MTZ+; et 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Ajouter des solutions mères IWR-1 et DMSO aux tubes coniques respectifs comme indiqué à l’étape 5.3.2. Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés.
    4. Retirer 0,06 % v/v de DMSO et 15 μM d’IWR-1 dans 1,5x PTU (étape 5.3.2) des plaques désignées à 6 puits non ablées (MTZ-) et ablées (MTZ+) et reconstituer avec les traitements appropriés effectués à l’étape 5.4.3.
    5. Retirer 0,06 % v/v de DMSO et 15 μM d’IWR-1 dans une solution de MTZ de 10 mM après exactement 24 h et reconstituer avec des traitements dans de l’eau douce du système sans PTU. Reconstituer les traitements DMSO à 0,06 % v/v et IWR-1 de 15 μM dans de l’eau douce du système sans PTU sur la ou les plaques non agglomérées (MTZ-) à 6 puits.
  5. Suivez l’entretien larvaire après l’ablation comme indiqué à l’étape 4 et reconstituez quotidiennement les traitements de 0,06 % v/v de DMSO ou d’IWR-1 de 15 μM dans l’eau du système sans UTP.
  6. Euthanasier les larves sur 9 dpf (4 dpi pour les frères et sœurs traités par MTZ appariés à l’âge) en immergeant les animaux dans une solution de tricaïne à 0,3 g/L (surdosage mortel) couplé à un refroidissement rapide (par exemple, placer des boîtes de Petri sur de la glace) pendant au moins 20 min30. Vérifiez que les larves ne répondent pas au toucher et fixez-les à 4 % de PFA (étape 1.5) pendant 3 h à température ambiante ou à 4 °C pendant la nuit.
  7. Traiter le tissu larvaire post-fixation pour l’acquisition d’images z-stack sur un microscope confocal comme décrit précédemment 5,31 et ici dans la section Résultats représentatifs. L’analyse des étapes 6 et 7 nécessitera, au minimum, l’acquisition d’images de marqueurs nucléaires (p. ex., DAPI) et d’images z-stack en champ clair.

6. Prétraitement d’images z-stack au microscope confocal dans FIJI (ImageJ)

  1. Importez et formatez des images z-stack de microscope confocal à l’aide de FIJI32.
    1. Ouvrez des images de microscope à l’aide des options d’importation des bioformats définies sur Afficher la pile avec : Hyperstack et mode Couleur : Niveaux de gris.
    2. Générez une projection d’intensité maximale de l’image de microscope importée en choisissant Image | Piles | Projet Z. Dans la fenêtre ZProjection , définissez Start Slice et Stop Slice pour inclure toutes les tranches de cette image. Par exemple, définissez Start Slice: 1 et Stop Slice: 18 pour une pile z qui a un total de 18 tranches. Choisissez Type de projection: Intensité maximale et cliquez sur OK.
    3. Convertissez le fichier de projection d’intensité maximale en une image 8 bits (si ce n’est pas déjà fait) en choisissant Image | Type | 8 bits.
    4. Réorientez l’image de sorte que la face dorsale soit vers le haut et que la partie distale (c’est-à-dire l’objectif) soit laissée en choisissant Image | Transformez | Inverser horizontalement (pour la dernière commande, choisissez l’option qui convient le mieux à la directionnalité nécessaire pour cette image). Pour une image multicanal, cliquez sur Oui dans la pile de processus? pour réorienter tous les canaux.
      REMARQUE: Cette étape est critique, mais pas nécessaire si l’image est déjà dans l’orientation gauche dorsale vers le haut, distale. Reportez-vous à la Figure 3A-D et à la Figure 4 pour les images avec des yeux dans la directionnalité correcte pour le traitement.
    5. Enregistrez la projection d’intensité maximale 8 bits en tant que fichier TIF (Tagged Image File Format) en choisissant Fichier | Enregistrer sous | Tiff....
  2. Générez la région d’intérêt (ROI) RPE à l’aide de FIJI.
    1. Ouvrez une image TIF 8 bits générée comme décrit à l’étape 6.1. Démarrez le gestionnaire de retour sur investissement en choisissant Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement.
    2. Utiliser l’image | Zoomez et basculez entre les canaux DAPI et Brightfield pour identifier le ou les points auxquels le côté apical du RPE est adjacent à l’extrémité de la membrane limitante externe (OLM) (Figure 3B', B », D', D »; pointes de flèche bleues). Utilisez ce repère anatomique comme point de départ du retour sur investissement.
    3. Créez le retour sur investissement RPE à l’aide de l’outil Sélections de polygones (dans la barre d’outils FIJI) à l’aide des couches d’image DAPI et de champ clair et de la fonction de zoom (Image | Zoom) pour identifier les limites apicales et basales de l’EPR. Amenez les extrémités dorsale et ventrale du ROI (c’est-à-dire où le ROI passe du côté apical au côté basal de l’EPR) à un point pointu plutôt que de l’émousser ou de l’arrondir (Figure 3B', B », D', D »; lignes magenta).
      REMARQUE : La création d’une fin de retour sur investissement pointue est une étape critique pour optimiser la détection des points de terminaison à l’aide de RpEGEN et est abordée dans la section Discussion.
    4. Ajoutez le ROI en cliquant sur Ajouter dans le Gestionnaire de ROI. Ajustez le retour sur investissement si nécessaire et cliquez sur Mettre à jour dans le gestionnaire de retour sur investissement.
    5. Enregistrez le fichier ROI en choisissant Plus>> | Sauvegarder... dans le gestionnaire de retour sur investissement. Utilisez des noms identiques pour les fichiers image ROI et TIF correspondants (par exemple, [nom du fichier].tif et [nom du fichier].roi).
  3. Combinez les fichiers TIF et ROI 8 bits pour chaque condition dans un seul dossier. Par exemple, le dossier, DMSO_9dpf, contiendra tous les fichiers TIF et ROI correspondants pour le groupe larvaire traité DMSO à 9 dpf non abrégé (MTZ-) à 0,06 % v/v.

7. Quantification et visualisation de la régénération RPE à l’aide de scripts RpEGEN

  1. Installez et préparez des scripts RpEGEN.
    1. Téléchargez les derniers scripts RpEGEN depuis le référentiel GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) en cliquant sur Code | Télécharger ZIP.
    2. Décompressez le dossier et placez-le dans l’emplacement d’espace de travail souhaité (par exemple, Bureau).
    3. Ouvrez MATLAB.
    4. Accédez au dossier RpEGEN dans le volet Dossier actif (généralement sur le côté gauche).
    5. Faites un clic droit sur le dossier RpEGEN et choisissez Ajouter au chemin d’accès | Dossiers et sous-dossiers sélectionnés. Cela ajoute le dossier au chemin MATLAB afin qu’il puisse automatiquement rechercher et exécuter tous les scripts du dossier.
    6. Double-cliquez sur le dossier RpEGEN dans le volet Dossier actuel pour afficher tous les sous-dossiers et les fichiers M.
    7. Double-cliquez sur le fichier RpEGEN.m pour l’ouvrir dans le volet Éditeur .
    8. Dans la section VARIABLES DÉFINIES PAR L’UTILISATEUR du fichier RpEGEN.m, entrez les emplacements des répertoires des dossiers contenant les fichiers ROI (.roi), les fichiers image (.tif) et l’emplacement d’enregistrement des fichiers de sortie. Entrez le nom du groupe pour le fichier .mat à exporter (par exemple, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, etc.) et l’emplacement du canal de fond clair dans la pile d’images TIF (par exemple, 3, si le champ lumineux est le troisième canal d’une pile d’images). Si le fichier image ne contient que l’image en fond clair, celle-ci doit être égale à 1.
  2. Exécutez le script RpEGEN.m et validez les résultats.
    REMARQUE : RpEGEN nécessite que la boîte à outils de traitement d’image, la boîte à outils d’ajustement de courbe et la boîte à outils de statistiques et d’apprentissage automatique soient activées sur la licence MATLAB de l’utilisateur pour pouvoir s’exécuter. En outre, la boîte à outils ReadImageJROI33 disponible gratuitement est nécessaire pour importer des retours sur investissement FIJI dans MATLAB ; cependant, il est fourni dans le dossier RpEGEN avec d’autres fichiers de fonction M qui ne nécessitent aucune activation.
    1. Exécutez le script en cliquant sur le bouton Exécuter dans le menu Éditeur en haut de MATLAB.
      REMARQUE: Une fois lancée, la fenêtre Commande fournira une sortie détaillée indiquant la progression du script. Après avoir enregistré le fichier MAT contenant les données extraites, une figure à trois panneaux apparaîtra et sera enregistrée au format PDF dans le répertoire de sortie pour chaque exécution d’image. Ce sont des chiffres de contrôle de la qualité (QC) pour s’assurer que tout a fonctionné correctement et comprennent: 1) l’image en fond clair superposée par le retour sur investissement (Figure 4A); 2) le retour sur investissement avec le trait d’axe et la distance angulaire associée (degrés) (Figure 4G); et 3) le retour sur investissement avec les valeurs d’intensité médiane de l’axe médian (0-255, échelle de couleurs 8 bits) (Figure 4H). Attendez que les FICHIERS PDF QC aient été enregistrés dans le dossier de sortie et que le dernier chiffre ait disparu avant de passer à l’étape suivante.
    2. Ouvrez les fichiers PDF individuels exportés vers le dossier de sortie dans n’importe quelle visionneuse PDF et vérifiez que tous les rois correspondent aux images en champ clair, que les valeurs de ligne médiane sont des approximations raisonnables du centre des rois et que les valeurs d’intensité médiane sont correctement remplies avec des données (c’est-à-dire pas toutes la même valeur sur l’ensemble du trait d’ordre).
      REMARQUE : Une description détaillée et la structure de chaque variable enregistrée dans le fichier MAT par RpEGEN.m se trouvent dans le tableau 1.
  3. Exécutez le script RpEGEN_PermPlot.m.
    REMARQUE: Le script RpEGEN_PermPlot.m utilise la sortie de RpEGEN.m pour exécuter des comparaisons statistiques à l’aide d’une simulation de permutation des médianes de deux groupes et fournit également le code pour reproduire les graphiques de ce document à l’aide de la boîte à outils GRAMM34 disponible gratuitement, qui a également été incluse dans le dossier RpEGEN.
    1. Double-cliquez sur le fichier RpEGEN_PermPlot.m pour l’ouvrir dans un nouvel onglet Éditeur .
    2. Sous SECTION 1 - VARIABLES DÉFINIES PAR L’UTILISATEUR dans le fichier RpEGEN_PermPlot.m, entrez l’emplacement du répertoire du dossier de sortie contenant les fichiers MAT de l’exécution de RpEGEN.m et entrez chaque nom de fichier MAT à charger (par exemple, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu Éditeur en haut de MATLAB.
    4. Dans la section 2, entrez les noms des deux groupes pour la comparaison statistique dans les data_A et data_B variables (ce sont les groupes à partir desquels les médianes seront dérivées à l’aide de la simulation de permutation). Dans la variable bin_sz , entrez le nombre de degrés sur lesquels intégrer les valeurs d’intensité médiane des jeux de données (la valeur par défaut est des bacs à 1 degré).
      REMARQUE : La variable reps indique le nombre de permutations à utiliser pour créer une distribution de probabilité et peut être définie sur n’importe quel nombre (la valeur par défaut est 20 000). En général, un nombre plus élevé de répétitions sera plus robuste statistiquement, mais augmentera le temps de traitement.
    5. Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu Éditeur en haut de MATLAB. Cette section peut prendre un certain temps en fonction du nombre de répétitions spécifiées, mais fournit une mise à jour continue de l’état dans la fenêtre de commande.
    6. Exécutez les sections FIGURE DE CARTE THERMIQUE et RÉSULTATS DU GROUPE ET VALEURS P indépendamment à l’aide du bouton Exécuter la section . Modifiez les variables de données dans toutes les sections commentées avec « ENTREZ LES DONNÉES ICI ». Les PDF de ces figures sont automatiquement enregistrés pour chacune et peuvent être facilement modifiés dans n’importe quel logiciel vectoriel de post-traitement.
      REMARQUE : Les tracés générés dans le fichier RpEGEN_PermPlot.m sont ad hoc et nécessiteront probablement des modifications en fonction des besoins spécifiques de chaque utilisateur en matière de données et de visualisation. Cependant, les chiffres fournissent une base solide qui peut être facilement individualisée à l’aide des sites Web MATLAB et GRAMM.

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Résultats

L’inhibition de la voie canonique de signalisation Wnt est connue pour nuire de manière significative à la régénération de l’EPR du poisson-zèbre en utilisant le paradigme d’ablation génétique (rpe65a:nfsB-eGFP) et la méthodologie de manipulation pharmacologique (IWR-1) décrite dans le protocole3. Cette expérience a été répétée ici pour valider une méthode automatisée de quantification de la régénération RPE du poisson-zèbre basée sur la pigmentation. Les résultats résumés ci-dessous engl...

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Discussion

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’EPR et étudie les mécanismes de dégénérescence et de régénération chez les poissons-zèbres d’âge larvaire. Ce protocole a également été réalisé avec succès chez le poisson-zèbre adulte3, mais avec une caractérisation moins étendue, c’est pourquoi les larves sont au centre de l’attention ici. Les aspects critiques de cette partie du protocole (étapes 1 à 4) comprennent: 1) l’ajout de 1,5x PTU aux embryons avant le début de la mélanoge...

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Déclarations de divulgation

L.L.L. est le co-inventeur du brevet américain n° 9 458 428, qui décrit une méthode accélérée pour dériver l’épithélium pigmentaire rétinien à partir de cellules souches pluripotentes humaines; cela n’a aucun rapport avec le contenu des présentes. J.M.G. et G.B.F. n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les travaux décrits ici ont été soutenus par les National Institutes of Health (RO1-EY29410 à J.M.G, et NIH CORE Grant P30-EY08098 au Département d’ophtalmologie); le Centre de transplantation immunitaire et de thérapie upMC (à L.L.L. et J.M.G.); et la Chaire E. Ronald Salvitti en recherche en ophtalmologie (à J.M.G.). Un soutien supplémentaire a été reçu de la bourse Wiegand en ophtalmologie (à L.L.L), de la Fondation Eye & Ear de Pittsburgh et d’une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, New York, NY. Les auteurs tiennent également à remercier Amanda Platt pour son aide technique et le Dr Hugh Hammer et le personnel aquatique pour l’excellent soutien en matière de soins aux animaux.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lab Matériel/Équipement
-(4-Amidinophényl)-6-chlorhydrate d’indolecarbamidine (DAPI)Millipore SigmaD9542
Plaques à 6 puitsFisher Scientific07-200-83
Tubes à centrifuger coniques en polypropylèneFisher Scientific05-539-13Le numéro de catalogue est pour les tubes de 50 mL
Stylo de traçage à pointe de diamantFisher Scientific50-254-51Fabriqué par Electron Microscopy Sciences, les articles similaires à ce numéro de pièce sont adéquats
Diméthylsulfoxyde (DMSO) &ge ; 99.7 %Fisher ScientificBP231Vérifier les exigences d’élimination des déchets chimiques de l’institut
Incubateur d’embryons (grand)Fisher Scientific3720A
Incubateur d’embryons (mini/de table)LabnetI5110A
Stéréomicroscope à fluorescenceZeissAxio Zoom.V16Ou similaire, avec laser/filtre d’excitation 488 nm
Pipette Pasteur en verreFisher Scientific13-678-4Fabriqué par Corning, InSolution
Wnt Antagonist I non stérile, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Fabriqué par Calbiochem ; 25 mM dans DMSO ; vérifier les exigences d’élimination des déchets chimiques internes
Bleu de méthylène (poudre)Fisher ScientificBP117-100Également disponible en tant que solution
aqeuous préfabriquéeMétronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Vérifier les exigences institutionnelles en matière d’élimination des déchets chimiques
N-phénylthiourée (PTU)Millipore SigmaP7629Vérifier les exigences internationales en matière d’élimination des déchets chimiques
Paraformaldéhyde (16 % p/v) Sans méthanolFisher ScientificAA433689MDéchets chimiques, élimination appropriée requise
Boîtes de PétriFisher ScientificFB0875712
saline tamponnée au phosphate de 10 cm de diamètre (sachets de poudre)Millipore SigmaP3813Utilisé pour fabriquer 10 X stock PBS
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Incubateur à secoussesBenchmarkH2010Utilisé pour l’incubation de MTZ pendant 1 heure à 37 degrés Celsius
StéréomicroscopeLeicaS9iOu similaire, avec lumière transmise Pince
d’éclairage Student Dumont #5Outils de science fine91150-20Pince à pointe fine pour la déchorisation manuelle
Rotateur/agitateur de tableScilogexSK-D1807-E
Pipette de transfertMillipore SigmaZ1350033,2 mL à tirage d’ampoule, non stérile
Méthanesulfonate de tricaïne (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Également disponible auprès de Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium avec DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version : 2.0.0-rc-69/1.52p ; Construction : 269a0ad53f ; Plugin nécessaire : Bio-Formats
GRAMM exemples et tutorielsMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes nécessaires à l’exécution de RpEGEN : Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB prend en chargeMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html
2 solution

Références

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R g n ration de l EPR du poisson z breablation par la nitroreductase et le m tronidazoleplateforme MATLAB RpEGENmod le de l sion de l EPRpoissons z bres transg niquescriblage pharmacologiquequantification de la pigmentation de l EPRst r omicroscopie fluorescentevoie de signalisation Wnt
Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre
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