Method Article

Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle nécessaire qui régule la fonction des protéines et dirige les résultats de la signalisation cellulaire. Les méthodes actuelles de mesure de la phosphorylation des protéines ne peuvent pas préserver l’hétérogénéité de la phosphorylation entre les protéines individuelles. Le test SiMPull (Single-Molecule Pull-Down) a été développé pour étudier la composition de complexes macromoléculaires par immunoprécipitation de protéines sur un couvercle en verre suivie d’une imagerie à molécule unique. La technique actuelle est une adaptation de SiMPull qui fournit une quantification robuste de l’état de phosphorylation des récepteurs membranaires pleine longueur au niveau de la molécule unique. L’imagerie de milliers de récepteurs individuels de cette manière permet de quantifier les modèles de phosphorylation des protéines. Le présent protocole détaille la procédure SiMPull optimisée, de la préparation de l’échantillon à l’imagerie. L’optimisation des protocoles de préparation du verre et de fixation des anticorps améliore encore la qualité des données. Le protocole actuel fournit un code pour l’analyse des données à molécule unique qui calcule la fraction des récepteurs phosphorylés dans un échantillon. Bien que ces travaux se concentrent sur la phosphorylation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), le protocole peut être généralisé à d’autres récepteurs membranaires et molécules de signalisation cytosoliques.

Introduction

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La signalisation associée à la membrane est réglée par une combinaison d’activation des récepteurs membranaires induits par les ligands et de recrutement de protéines accessoires en aval qui propagent le signal. La phosphorylation des tyrosines clés dans les queues cytoplasmiques des récepteurs est essentielle pour initier la formation de complexes de signalisation, ou signalosomes 1,2. Par conséquent, une question importante en biologie est de savoir comment les modèles de phosphorylation sont créés et maintenus pour recruter des partenaires de signalisation et dicter les résultats cellulaires. Cela comprend ....

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Protocol

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1. Préparation du couvercle

REMARQUE: Pour cette étape, il faut porter un équipement de protection individuelle (EPI), qui comprend une double couche de gants en nitrile, des lunettes de sécurité ou un écran facial, et une blouse de laboratoire.

  1. Effectuez une gravure au piranha pour éliminer les débris organiques du verre.
    ATTENTION: La solution de piranha est un agent oxydant puissant qui est corrosif et très réactif au contact de matières organiques. La réaction avec les débris organiques est exothermique et potentiellement explosive. Ainsi, la procédure doit être effectuée dans une hotte chimique avec le châ....

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Results

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Un dessin animé illustrant le processus SiMPull est illustré à la figure 1A. Les couvercles sont fonctionnalisés à l’aide de NeutrAvidin comme point d’ancrage pour les anticorps anti-EGFR biotinylés afin de capturer l’EGFR-GFP à partir de lysats de protéines totales. Après avoir éliminé les protéines non liées, les récepteurs phosphorylés sont marqués avec un anticorps anti-phosphotyrosine (anti-PY)15. La figure 1B montre une image du rés.......

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Discussion

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Le protocole décrit ici a été optimisé pour permettre des mesures quantitatives de la phosphorylation des récepteurs au niveau d’une seule protéine. Plusieurs modifications simples mais importantes du protocole SiMPull ont été développées pour améliorer la fiabilité de la mesure pour la détection de la phospho-tyrosine, y compris la réduction de l’autofluorescence avec le traitement NaBH4 et la postfixation de l’échantillon pour prévenir la dissociation des anticorps. L’utilisation du masque de canal vert pour.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 et R01CA248166 à DSL. EMB a été soutenu par le programme ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) et JAR par le programme UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Nous remercions l’utilisation de la ressource partagée de microscopie à fluorescence du Comprehensive Cancer Center de l’Université du Nouveau-Mexique, soutenue par NIH P30CA118100. Nous tenons à remercier les Drs Ankur Jain et Taekijip Ha, dont le développement original de SiMPull a inspiré ce travail.
ES-C adresse actuelle: Groupe immunodynamique, Laboratoire d’immunologie intégrative du cancer, Centre de recherche sur le cancer, Insti....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL Tubes à microcentrifugerMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Tampon
100 mm Boîte de culture tissulaireCELLTREAT229620Stockage du piranha verre dépoli/matrices
15 mL Tube
16 % Paraformaldéhyde Aqueux SolutionMicroscopie électronique Sciences15710
Dangereux TubeStockage en verre fonctionnalisé/ Réutilisation du KOH
50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mMlyse
60 mm Boîte de culture tissulaireCorning430166
8 % Glutaraldéhyde Solution aqueuseMicroscopie électronique Sciences16020Acétone dangereuse
(C3H6O)Millipore Sigma270725
Dangereuse Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Femelle humaine recombinante sans animauxPeprotechAF-100-15
EGFR anti-humain (domaine externe) &ndash ; BiotineLeinco Technologies, IncE101
Anticorps anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5 000
Albuminesérique bovineGold BiotechnologyA-420-1Composant tampon de Tyrode
Entonnoir
Bec
Chlorure de calcium (CaCl2)Millipore SigmaC4901Composant tampon de Tyrode
Racleur de cellulesBioworld30900017-1
Fiole filtrante coniqueFisher ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II Compteur de cellules automatiséThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Microscopie électronique Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Caméra emCCDAndor iXon
Sérum de veau fœtal, OptimaBio-TechneS12450H
Logiciel Fusion 360Autodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson Labs G030-5GM
Acide acétique glacial (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Dangereux
sérologiques en verre
d’agitation en verre
Glucose (D-(+)-Glucose)Millipore SigmaD9434Composant tampon de Tyrode
phosphotase et cocktail inhibiteur de protéase (100X)Thermo Fisher Scientific78446Composant tampon de lyse
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeComposant tampon de l’acide
chlorhydrique (HCl)VWRBDH7204-1
Peroxyde d’hydrogène dangereux (H2O2) (3 %)HX0645
Peroxyde d’hydrogène (H2O2) (30 %)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Tampon de lyse Composant
ImmEdge Barrière hydrophobe StyloVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F Huile d’immersionZeiss444960-0000-000
ligne
L-glutamine ThermoFisher Scientific25030-164
Chlorure de magnessium hexahydraté (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Composant tampon de Tyrode Boîte
MatlabMathworksCurve Fitting, Parallel Computing Toolbox et boîte à outils de statistiques et d’apprentissage automatique
Méthanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Eau
Milli-Q dangereuse
Mix-n-Stain CF Dye Kits de marquage d’anticorpsBiotium92245Kit de conjugaison suggéré
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidyl valerate, MW 5 000
N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilaneUCT United ChemicalA0700Nanogrille dangereuse
Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotine Protéine de liaisonThermo Fisher Scientific31000
Azote (gaz comprimé)
GPU NVIDIA avec CUDARecherchez la compatibilité sur https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
microscope Olympus iX71Olympus
Parafilm MThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Plaque chauffante analogiqueCorning6795-200
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Récepteur phospho-EGF (Tyr1068) (1H12) Technologiede signalisation cellulaire2236BF
Chlorure de potassium (KCl)Millipore Sigma529552Composant tampon de Tyrode Hydroxyde
de potassium (KOH)Millipore Sigma1050330500
Filament PLA Premium dangereux, 1,75 mm de diamètreRaise 3DPMS :2035U/RAL :3028Plage de température d’impression : 205-235 ° ;
Imprimante 3D C Pro2Raise 3D
Pyrex 1 L bécher
PYREX 100 mL bouteilles de stockageCorning1395-100CH3OH/C3H6O réutiliser
les
Bécher
Quad-view Image SéparateurPhotométrieModèle QV2
Centrifugeuse réfrigéréeEppendorfEP-5415R
Compteurs de cellules RevCount, Lames de comptage de cellules EVE VWR10027-446
Filtres d’émission Semrock : bleu (445/45 nm), vert (525/45 nm), rouge (600/37 nm), rouge lointain (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Contrôleur de pipette sérologique
Ensemble
d’analysehttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)Sigma AldrichS6014
Borohydrure de sodium dangereux (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Composant tampon
Chlorure de sodium (NaCl)Millipore SigmaS9625Activer par cycles successifs de chaleur et
de pH Hydroxyde de sodiumVWRBDH3247-1
Orthovanadate de sodium (Na3VO4)MilliporeSigmaS6508
Acide sulfurique dangereux (H2SO4)Millipore Sigma258105Microsphères
TetraSpeckThermo Fisher ScientificT7279perles multi-fluorescentes
Base Tris (Trizma)Millipore SigmaT1503
Trypan bleu, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsine-EDTA 0,05 %Thermo Fisher Scientific25300120
conique conique de 50 mL Composant tampon de NaCl de BuchnerBunsen inactivé par la chaleur Pipettes Tige Arrêt de la de vide interneà outils Film d’étanchéité mAb de souris béchers Pyrex 250 mLPyrex 4 L de molécule unique dangereuses

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

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Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

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