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Article de méthode

Criblage de la mécanique d’ensemble de la myosine dans des faisceaux de filaments d’actine à l’aide de pincettes optiques

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DOI :

10.3791/63672

⸱

4 mai 2022

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1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of Biomedical Engineering, University of Mississippi

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La formation de faisceaux d’actomyosine in vitro et la mesure de la génération de force d’ensemble de myosine à l’aide de pinces optiques sont présentées et discutées.

Résumé

Les myosines sont des protéines motrices qui hydrolysent l’ATP pour marcher le long des traces de filament d’actine (FA) et sont essentielles dans les processus cellulaires tels que la motilité et la contraction musculaire. Pour comprendre leurs mécanismes générateurs de force, la myosine II a été étudiée à la fois au niveau de la molécule unique (SM) et en tant qu’équipes de moteurs in vitro en utilisant des méthodes biophysiques telles que le piégeage optique.

Ces études ont montré que le comportement générateur de force de myosine peut différer considérablement lorsqu’il passe du niveau d’une seule molécule dans un arrangement à trois billes à des groupes de moteurs travaillant ensemble sur une surface rigide de bille ou de glissement de couverture dans un arrangement de glissement. Cependant, ces constructions de dosage ne permettent pas d’évaluer la dynamique de groupe de la myosine dans la hiérarchie structurelle viscoélastique comme elles le feraient dans une cellule. Nous avons développé une méthode utilisant des pincettes optiques pour étudier la mécanique de la génération de force par les ensembles de myosine interagissant avec plusieurs filaments d’actine.

Ces faisceaux d’actomyosine facilitent l’investigation dans un environnement hiérarchique et conforme qui capture la communication motrice et la sortie de force d’ensemble. La nature personnalisable du test permet de modifier les conditions expérimentales pour comprendre comment les modifications apportées à l’ensemble de myosine, au faisceau de filaments d’actine ou à l’environnement environnant entraînent des sorties de force différentes.

Introduction

Les protéines motrices sont essentielles à la vie, convertissant l’énergie chimique en travail mécanique 1,2,3. Les moteurs de myosine interagissent avec les filaments d’actine en faisant des pas le long des filaments comme une piste, et la dynamique des réseaux actine-myosine effectue la contraction musculaire, la motilité cellulaire, l’anneau contractile pendant la cytocinèse et le mouvement de la cargaison à l’intérieur de la cellule, entre autres tâches essentielles 3,4,5,6,7,8 . Étant donné que les myosines ont tant de rôles essentiels, une défaillance de la fonctionnalité du réseau myosine-actine peut entraîner le développement de maladies, telles que des mutations dans la chaîne lourde de myosine qui provoquent une hypercontractilité cardiaque dans la cardiomyopathie hypertrophique (CMH)9,10,11,12,13,14 . Dans la contraction musculaire, les moteurs individuels de la myosine coopèrent les uns avec les autres en travaillant comme un ensemble pour fournir l’énergie mécanique requise qui effectue le glissement relatif des AF 4,15,16,17,18. Les moteurs de myosine forment des ponts croisés entre les FA et utilisent les changements conformationnels dus à son cycle mécanochimique pour se déplacer collectivement vers l’extrémité barbelée des filaments alignés 17,18,19,20,21.

La mise au point d’essais quantitatifs de motilité in vitro au niveau SM à l’aide de techniques telles que le piégeage optique a facilité la collecte de détails sans précédent sur le fonctionnement des moteurs individuels de la myosine, y compris la mesure de la génération de force SM et de la taille des pas 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. ont mis au point le test de piégeage optique « à trois billes » ou « haltères » pour sonder la mécanique de génération de force des moteurs à myosine II simples23,31. Comme la myosine musculaire II fonctionne en équipe pour contracter les FA mais n’est pas processive au niveau SM, l’orientation du test de piégeage optique a dû être réorganisée à partir de l’approche classique des perles liées au moteur32. Pour former le test d’haltères, deux pièges optiques ont été utilisés pour maintenir une mise au point automatique au-dessus d’un moteur de myosine lié à une perle fixée par un couvercle, et la force de sortie par le moteur unique a été mesurée par les mouvements de la mise au point automatique à l’intérieur du piège23.

Cependant, les forces SM et l’utilisation d’une orientation d’essai à un seul moteur/filament unique ne donnent pas une image complète de la génération de force au niveau du système, car de nombreuses protéines motrices, y compris la myosine II, ne fonctionnent pas isolément et ne fonctionnent souvent pas comme une somme de leurs parties 15,16,17,32,33,34,35,36 . Des structures plus complexes comprenant plus d’un moteur interagissant avec plus d’un filament sont nécessaires pour mieux comprendre la synergie des réseaux de myosine et d’actine 15,32. L’orientation du test d’haltères a été exploitée pour étudier la génération de force de petit ensemble en ayant plusieurs myosines attachées à une bille ou en utilisant un filament épais de myosine attaché à une surface et en permettant aux moteurs d’interagir avec la suspension AF 4,23,34,37,38,39,40.

D’autres essais de petit ensemble comprennent un essai de glissement filamentaire in vitro dans lequel les moteurs de myosine sont recouverts sur une surface de glissement de couverture, et une perle liée à une AF est utilisée pour sonder la force générée par l’équipe de moteurs 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . Dans ces deux cas, les myosines sont liées à une surface rigide – perle ou lamelle de couverture – et utilisent une AF. Dans ces cas, les moteurs ne sont pas capables de se déplacer librement ou de communiquer entre eux, et le fait d’avoir des myosines rigidement liées ne reflète pas l’environnement hiérarchique conforme dans lequel les moteurs travailleraient ensemble dans le sarcomère32. Des études antérieures ont suggéré que la myosine II peut détecter son environnement et s’adapter en conséquence aux conditions changeantes de concentration viscoélastique ou motrice en modifiant des caractéristiques telles que la génération de force et le rapport de service41,44,45. Il est donc nécessaire de mettre au point un test de piégeage optique qui favorise et capture la communication motrice et la conformité du système afin de brosser un tableau plus réaliste des fondements mécanistes de la génération de force d’ensemble de la myosine II.

Ici, nous avons développé une méthode pour coupler la structure hiérarchique in vitro avec le piégeage optique en formant des faisceaux d’actomyosine ou des sandwichs constitués de plusieurs moteurs de myosine interagissant entre deux filaments d’actine. Cette géométrie de dosage modulaire a la capacité de sonder directement comment les facteurs moléculaires et environnementaux influencent la génération de la force de myosine d’ensemble. De plus, l’étude des mécanismes de génération de force à travers ces ensembles actine-myosine a le potentiel d’aider à modéliser et à comprendre comment les tâches cellulaires à grande échelle, telles que la contraction musculaire, se propagent à partir du niveau moléculaire 9,10,13.

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Protocole

1. Graver les lamelles de couverture

  1. Dissoudre 100 g de KOH dans 300 mL d’éthanol à 100 % dans un bécher de 1 000 mL. Remuer avec une barre d’agitation jusqu’à ce que la majorité du KOH soit dissoute.
    ATTENTION: La solution concentrée de KOH peut causer des brûlures et endommager les vêtements. Portez des gants, une protection oculaire et une blouse de laboratoire.
  2. Placez les lamelles de couverture individuellement dans des supports de nettoyage de lames de couverture.
    REMARQUE: Les racks sont conçus avec des fentes qui maintiennent des lamelles de recouvrement simples espacées pour permettre la gravure et le rinçage sur chaque face de la lamelle de couverture, des trous de vidange dans le fond et faites d’un matériau pouvant résister aux conditions de gravure difficiles. Ils peuvent être fabriqués sur mesure ou achetés dans le commerce.
  3. Préparez et étiquetez trois béchers de 1 000 ml : un avec 300 ml d’éthanol et deux béchers avec 300 ml d’eau osmosée (osmose).
    REMARQUE: Ici, l’eau osmosée provient d’un purificateur d’eau de laboratoire, mais elle peut également être achetée dans le commerce si un purificateur local n’est pas disponible.
  4. Placez chacun des quatre béchers dans un sonicateur de bain pour dégazer pendant 5 min.
  5. Immerger un rack de lamelles de couverture dans le bécher de KOH et d’éthanol et soniquer pendant 5 min.
  6. Transférer le rack de lamelles de couverture du bécher KOH/éthanol au bécher contenant uniquement de l’éthanol. Trempez la grille de haut en bas dans le bécher jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de perlage.
    REMARQUE: Veillez à ne pas déranger les lamelles de couverture ou à ne pas laisser tomber de force le rack dans le bécher. Cela entraînera la sortie des lamelles de recouvrement du rack ou provoquera des éclaboussures chimiques.
  7. Transférez délicatement le rack de lamelles de couverture du bécher à éthanol dans un bécher d’eau, en plongeant de haut en bas jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de perlage.
  8. Plongez le rack de lamelles de couverture dans le bécher d’eau qui n’a pas encore été utilisé et soniquez à nouveau pendant 5 min.
  9. Utilisez une bouteille pour asperger le rack de lamelles de couverture avec de l’eau jusqu’à ce qu’elle s’écoule doucement des lamelles de couverture. Répétez avec l’éthanol.
  10. Placer les grilles à sécher dans un four à 90 °C pendant 20 min. Entreposer les étagères des lamelles de recouvrement gravées à température ambiante dans des contenants fermés pour éviter toute contamination avant utilisation.

2. Polymérisation du filament d’actine

  1. Créer une solution T
    1. Dans un tube conique de 50 mL, ajouter 3,94 g de Tris-HCl et 0,147 g de CaCl2. Ajouter de l’eau osmosée pour obtenir un volume total de 50 ml et bien mélanger.
      NOTA: Les concentrations finales de la solution Tsont respectivement de 500 mM de Tris-HCl et de 20 mM de CaCl2.
    2. Étiqueter le tube Solution T et le conserver à 4 °C.
  2. Créer un tampon TC
    1. Mélanger 40 mL d’eau d’osmose inverse et 1,5 mL de solution T dans un tube conique de 50 mL. Changez le pH à 8,0 en ajoutant de petites quantités de KOH concentré. Ajouter de l’eau pour obtenir 50 ml de la solution et vérifier le pH. Ajustez le pH si nécessaire.
      REMARQUE : Le tampon TC final contient 5 mM de Tris-HCl et 0,2 mM de CaCl2à pH 8.
    2. Étiqueter le tube TC et le conserver à 4 °C.
  3. Créer un tampon FC
    1. Ajouter 85 mL d’eau d’OI, 10 mL de Solution T, 3,73 g de KCl et 0,041 g de MgCl2 dans un flacon tampon de 100 mL. Modifier le pH à 7,5 en ajoutant de petits volumes de KOH concentré. Ajouter de l’eau pour obtenir un volume final de 100 mL et vérifier le pH.
      REMARQUE : Le tampon FC final contient 500 mM de Tris-HCl, 500 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2 et 2 mM de CaCl2 à pH 7,5.
    2. Étiqueter le tube FC et le conserver à 4 °C.
  4. Préparer le tampon général d’actine (GAB).
    1. Mélanger 485 μL de tampon TC, 10 μL d’ATP 10 mM et 5 μL de DTT 50 mM dans un tube microcentrifugeuse.
      REMARQUE : Les conditions tampons finales sont de 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl 2, 0,5 mM TNT et0,2 mM ATP.
    2. Étiquetez-le comme GAB et conservez-le à 4 °C.
  5. Préparer le tampon de polymérisation de l’actine (APB).
    1. Mélanger 455 μL de tampon FC, 25 μL d’ATP 100 mM et 20 μL de DTT 50 mM dans un tube microcentrifugeux.
      NOTE: Les conditions tampons finales sont 50 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 22 mM TNT et 5 mM ATP.
    2. Étiquetez le tube comme APB et conservez-le à 4 °C.
  6. Reconstituer l’actine
    1. Reconstituer l’actine des muscles squelettiques de lapin en ajoutant 100 μL d’eau désionisée à un flacon de 1 mg d’actine lyophilisée. Bien mélanger en pipitant doucement de haut en bas. Aliquote dans des échantillons de 5 μL, surgeler et conserver les aliquotes d’actine à 10 mg/mL à -80 °C.
    2. Reconstituer l’actine des muscles squelettiques de lapin biotinylés en ajoutant 20 μL d’eau osmosée. Aliquote dans des échantillons de 5 μL, surgeler et conserver les aliquotes d’actine biotinylée de 1 mg/mL à -80 °C.
  7. Polymérisation d’actine non marquée avec stabilisation de la phalloïdine rhodamine
    1. Décongeler un flacon de 10 mg/mL d’actine et le conserver sur la glace.
    2. Préparer un tampon GAB frais, ajouter 100 μL de GAB à l’aliquote d’actine et mélanger en pipitant doucement de haut en bas. Incuber la solution sur glace pendant 1 h.
    3. Préparer l’APB frais pendant l’incubation. Après incubation, polymériser l’actine en filaments en ajoutant 11 μL d’APB à la solution d’actine. Bien mélanger en pipitant doucement de haut en bas. Placer sur la glace pendant 20 min.
    4. Ajouter 5 μL de phalloïdine marquée à la rhodamine à la solution de filament d’actine fraîchement polymérisée. Laisser sur la glace dans l’obscurité pendant 1 h.
    5. Conservez le flacon d’actine de rhodamine enveloppé dans du papier d’aluminium dans l’obscurité à 4 °C.
      REMARQUE: Il est suggéré d’utiliser ces filaments pendant une période maximale de 1 semaine. La qualité de l’AF peut être confirmée chaque jour grâce à une imagerie rapide d’une cellule d’écoulement contenant uniquement des AF et à la visualisation quotidienne de filaments cohérents.
  8. Polymérisation d’actine biotinylée avec stabilisation de la phalloïdine Alexa Fluor 488
    1. Décongeler un flacon de 10 mg/mL d’actine et 1 flacon de 1 mg/mL d’actine biotinylée et les conserver sur la glace.
    2. Faire un tampon GAB frais.
    3. Combiner les deux flacons (étape 2.8.1) dans un rapport actine:actine biotinylée de 10:1. Ajouter 100 μL de GAB au mélange d’actine et bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas. Incuber sur glace pendant 1 h.
    4. Faire de l’APB frais pendant l’incubation.
    5. Après l’étape d’incubation, polymériser l’actine en ajoutant 11 μL d’APB à la solution d’actine. Bien mélanger en picoretant doucement de haut en bas. Incuber sur glace pendant 20 min.
    6. Ajouter 5 μL de phalloïdine marquée Alexa Fluor 488 et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 1 h.
    7. Conservez le flacon d’actine biotinylée enveloppé dans du papier d’aluminium dans l’obscurité à 4 °C.
      NOTE: Ces filaments peuvent être utilisés pendant une période maximale de 1 semaine.

3. Préparation de la myosine et des billes

  1. Reconstituer la myosine II
    1. Faire tourner brièvement vers le bas (~5 s) la myosine II squelettique lyophilisée pour la recueillir au fond du tube à l’aide d’une minicentrifugeuse standard.
    2. Reconstituer la myosine à 10 mg/mL en ajoutant 100 μL de DTT 1 mM préparé dans de l’eau d’OI.
    3. Diluer la solution mère de myosine 10x en ajoutant 10 μL de myosine à 10 mg/mL à 90 μL de DTT 1 mM dans de l’eau d’osmose inverse. Fabriquer des aliquotes de petit volume (1 à 5 μL), les congeler et les conserver à -80 °C.
      NOTE: L’activité de la myosine peut être confirmée en effectuant un test de filament de glissement standard tel que publié précédemment46,47. Voir la discussion pour une brève description.
  2. Nettoyage des billes enrobées de streptavidine
    1. Diluer 20 μL de billes de streptavidine de 1 μm dans 80 μL d’eau osmosée. Laver quatre fois en essoretant à 9 600 × g et en se reconstituant dans 100 μL d’eau osmosée.
    2. Sonicer pendant 2 min à 40% d’amplitude et conserver les billes lavées sur un rotateur à 4 °C.

4. Préparation des cellules d’écoulement

  1. Préparer une solution de poly-l-lysine (LPL) en ajoutant 30 mL d’éthanol à 100 % dans un tube de 50 mL et en ajoutant 200 μL de poly-l-lysine à 0,1 % p/v dans de l’eau et bien mélanger.
  2. Ajouter une lamelle de couverture gravée à la solution PLL et laisser tremper pendant 15 min. Retirez le bordereau à l’aide d’une pince à épiler, en prenant soin de ne toucher que le bord du couvercle lorsqu’il est tiré vers le haut du tube (voir Figure 1A-C). Attrapez les bordereaux par les bords avec une main gantée.
  3. Sécher le bordereau de couverture avec une compagnie aérienne filtrée jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’éthanol et aucun résidu sur le couvercle.
  4. Appliquez deux morceaux de ruban adhésif double face au milieu d’une lame de microscope, à 3-4 mm l’un de l’autre. Déchirez ou coupez l’excès de ruban adhésif qui pend du bord de la glissière.
  5. Ajouter la lame de couverture enduite de PLL sur le dessus de la bande perpendiculairement à l’axe long de la lame de microscope (formant un T) pour former un canal.
  6. Utilisez un petit tube pour comprimer la lamelle de couverture sur le ruban et la lame de microscope à fond jusqu’à ce que la bande soit transparente (Figure 1A). Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la bande, car cela peut provoquer une fuite du canal d’écoulement.
    REMARQUE: La cellule d’écoulement peut contenir un volume de 10-15 μL.

5. Préparation du faisceau d’actomyosine

  1. Dans des tubes séparés, diluer chaque type de filament d’actine (marqué à la rhodamine et au 488 biotinylé) 600x en mélangeant 0,5 μL d’actine marquée respective avec 300 μL d’APB. Ajouter 5 μL supplémentaires de la phalloïdine étiquetée correspondantement dans chaque tube et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 15 minutes.
  2. À la solution d’actine biotinylée, ajouter un système de piégeage de l’oxygène de 1 μL de bêta-D-glucose à 500 mg/mL, de 1 μL de glucose oxydase à 25 mg/mL et de 1 μL de catalase à 500 unités/mL. Ajouter 1 μL d’ATP 100 mM et 1 μL de billes de streptavidine diluées et nettoyées 100x. Remuer doucement avec un embout de pipette. Placez la suspension sur un rotateur à 4 °C pendant que le reste du faisceau d’actomyosine est en cours d’assemblage.
  3. Ajouter 15 μL d’actine rhodamine diluée à la cellule d’écoulement de la LPL (Figure 1D). Aspirez l’excès de solution à travers la cellule d’écoulement, mais ne laissez pas le canal d’écoulement s’assécher. Incuber pendant 10 min dans une chambre d’humidité.
    REMARQUE: Les chambres d’humidité peuvent être fabriquées à partir de boîtes d’embout de pipette vides avec de l’eau ajoutée au fond et le couvercle recouvert de papier d’aluminium pour bloquer la lumière.
  4. Préparer une solution de caséine à 1 mg/mL dans de l’APB.
  5. Ajouter 15 μL de caséine à 1 mg/mL pour éviter la liaison non spécifique des composants suivants (figure 1E). Incuber pendant 5 min dans une chambre d’humidité.
  6. Ajouter la concentration désirée de myosine à l’actine biotinylée et à la suspension de billes de l’étape 5.2. Remuer doucement avec l’embout de la pipette, puis ajouter immédiatement 15 μL de la suspension de l’étape 5.2 + la concentration de myosine souhaitée dans la cellule d’écoulement (Figure 1F,G). Incuber pendant 20 min. Scellez les extrémités ouvertes de la cellule d’écoulement avec du vernis à ongles pour éviter l’évaporation pendant les expériences d’imagerie et de piégeage optique.
    REMARQUE : Une concentration de 1 μM en solution de myosine donne un regroupement robuste et peut être utilisée comme point de départ pour la personnalisation souhaitée du dosage (voir la figure 2).

6. Mesures de force à l’aide d’un piège optique (NT2 Nanotracker2)

REMARQUE: Bien que le protocole ci-dessous soit spécifiquement destiné au système NT2, ce test peut être utilisé avec d’autres systèmes de piégeage optique, y compris ceux qui sont construits sur mesure, qui ont également des capacités de fluorescence. Le flux de travail général reste le même pour obtenir la surface de la diapositive en évidence, effectuer des étalonnages de cordons et acquérir des données en trouvant des faisceaux d’actine fluorescents. Pour le système NT2, la figure supplémentaire S1, la figure supplémentaire S2, la figure supplémentaire S3, la figure supplémentaire S4, la figure supplémentaire S5, la figure supplémentaire S6 et la figure supplémentaire S7 fournissent des détails sur le système de piégeage optique et l’interface logicielle.

  1. Allumez le boîtier de commande et le laser (Figure supplémentaire S1).
  2. Démarrez le logiciel informatique du piège optique en cliquant sur l’icône JPK Nanotracker sur le bureau.
  3. Réveillez la radiocommande en cliquant sur le bouton Logitech au centre (Figure supplémentaire S2).
  4. Allumez le module de fluorescence en activant l’interrupteur marche/arrêt (Figure supplémentaire S3).
  5. Tournez la tourelle du cube filtrant pour l’imagerie en fond clair (figure supplémentaire S4).
  6. Une fois le système prêt, allumez le laser à l’aide du bouton d’alimentation laser situé dans le coin inférieur gauche de l’écran à 50 mW et laissez-le se stabiliser pendant 30 min (figure supplémentaire S5).
  7. Cliquez séquentiellement sur les boutons Illumination, Caméra, Objectif et Mouvement de scène dans le logiciel pour afficher ces fenêtres de visualisation et de manipulation pendant l’expérience. Allumez l’éclairage du microscope en cliquant sur le bouton On/Off et réglez-le sur la puissance maximale en cliquant et en faisant glisser la barre vers la droite (Figure supplémentaire S5).
  8. Ouvrez la zone d’échantillon et retirez le porte-échantillon de l’étage du microscope. Ajoutez la cellule d’écoulement, fixez-la avec les porte-échantillons métalliques et assurez-vous que la lame avec le bordereau de couverture est en bas.
  9. Ajouter 30 μL d’eau osmosée au centre de l’objectif inférieur. Ne laissez pas l’embout de la pipette toucher l’objectif. Réinsérez l’étape d’échantillonnage.
    REMARQUE : Comme le système NT2 utilise un objectif d’immersion dans l’eau comme objectif de piégeage, le milieu d’immersion peut être différent en fonction de l’objectif de piégeage dans la configuration de l’utilisateur.
  10. Soulevez l’objectif inférieur à l’aide des flèches de commande à l’écran ou L2 de la télécommande jusqu’à ce que le cordon d’eau touche la lamelle de couverture (figure supplémentaire S5).
  11. Abaissez l’objectif supérieur jusqu’à ce qu’environ la moitié de la distance jusqu’à la cellule d’écoulement soit atteinte à l’aide des flèches à l’écran ou R2 de la télécommande. Ajouter 170 μL d’eau osmosée au sommet de la cellule d’écoulement directement sous l’objectif supérieur. Abaisser l’objectif supérieur jusqu’à ce qu’il brise la tension superficielle de l’eau et forme un ménisque.
  12. Déplacez l’étage du microscope à l’aide du patin fléché de la télécommande jusqu’à ce que le bord de la bande adjacent au canal d’écoulement soit atteint. Fermez la porte de l’échantillon.
    REMARQUE: Un « clic » à la fermeture de la porte de l’échantillon indique que l’obturateur laser est maintenant ouvert. Il s’agit d’un dispositif de sécurité qui ne permet au volet de s’ouvrir que si la porte est fermée.
  13. À l’aide de la fenêtre Objectif à l’écran, mettez le bord de la bande au point en amenant l’objectif inférieur nommé Objectif laser vers le haut en cliquant sur la flèche supérieure à l’aide des commandes à l’écran. Faites de même pour l’objectif supérieur en cliquant sur la flèche du bas (Figure supplémentaire S5).
    REMARQUE: Les flèches doubles déplacent l’objectif ou la scène plus rapidement. Le bord de la bande est utilisé pour la mise au point car il s’agit d’un objet volumineux, facile à trouver, proche de la surface de la lamelle de couverture. Les bulles d’air à l’intérieur de la bande sont une autre option. Cependant, cela n’est pas nécessaire si l’utilisateur dispose d’une routine automatisée pour trouver la mise au point de surface ou d’une méthode interne préférée.
  14. Une fois la bande mise au point, fermez partiellement le diaphragme en haut du piège optique. Abaissez l’objectif supérieur jusqu’à ce que la forme polygonale de l’iris soit visible. Mettez ces bords au point, rouvrez l’iris, puis associez les objectifs en cliquant sur l’icône Cadenas (Figure supplémentaire S5).
  15. Trouvez un cordon flottant et piégez-le en cliquant sur le bouton Trap Shutter, qui ouvrira l’obturateur et permettra au laser de piégeage de frapper l’échantillon. Cliquez sur le curseur Interruption à l’écran et faites-le glisser pour déplacer l’emplacement du laser de recouvrement. Une fois piégé, calibrez le cordon pour corréler les mesures de tension à la force et au déplacement.
  16. Cliquez sur le bouton Calibration . Ajustez la routine d’étalonnage en fonction de l’analyse des spectres de puissance et ajustez la fréquence de coin dans le logiciel pour les directions X, Y et Z (figure supplémentaire S6).
  17. Cliquez sur Paramètres. Tapez le diamètre de la perle (1 000 nm) et tapez la température de l’étage située en bas à gauche de la fenêtre du logiciel. (voir la figure supplémentaire S6).
  18. Cliquez sur Piège 1. Cliquez sur X Signal. Cliquez sur Exécuter pour effectuer l’ajustement de la fréquence d’angle. Cliquez et faites glisser dans la fenêtre pour optimiser l’ajustement de la fonction. Cliquez sur Utiliser pour connaître les valeurs de sensibilité et de rigidité. Cliquez sur Accepter les valeurs. Répétez l’opération pour les signaux Y et Z. Fermez la fenêtre. (voir la figure supplémentaire S6).
    REMARQUE : Les routines d’étalonnage du cordon sur d’autres systèmes de piégeage optique ou des systèmes sur mesure qui ont été rigoureusement testés par l’utilisateur, comme la méthode d’équipartition ou la méthode de force de traînée, sont également acceptables57,58.
  19. Trouvez un faisceau d’actomyosine en recherchant les billes liées aux AF sur la surface de la lame.
  20. Lorsqu’un cordon non encombré par d’autres billes flottantes est détecté, observez les AF autour de lui par imagerie par fluorescence pour vérifier la présence d’un faisceau.
  21. Vérifiez qu’un faisceau est présent en recherchant les deux AF fluorescents colocalisés. Allumez la source de lumière blanche et utilisez le cube filtrant approprié pour imager chaque filament d’actine en tournant la tourelle (cubes de filtre d’excitation de 488 nm et 532 nm pour Alexa Fluor 488 et l’excitation à la rhodamine, respectivement). Voir la figure supplémentaire S4.
    REMARQUE: Une expérience de contrôle pour vérifier l’intensité de fluorescence des AF simples peut être utile pour identifier les faisceaux composés d’un seul filament marqué à la rhodamine 488 et à la rhodamine, ou applicable à n’importe quel ensemble de fluorophores que l’utilisateur choisit d’utiliser.
  22. Une fois vérifié, trapez le cordon attaché au filament supérieur du paquet en cliquant sur le bouton Trap Shutter.
  23. Utilisez les commandes à l’écran pour enregistrer les données en cliquant sur le bouton Oscilloscope (Figure supplémentaire S7). Pour visualiser les mesures sans enregistrer les données, cliquez sur Démarrer. Pour enregistrer toutes les données, cliquez sur Enregistrement automatique. Pour enregistrer les mesures, cliquez sur Démarrer l’enregistrement. Choisissez les données à visualiser en temps réel (position, force, direction x, direction y) en choisissant dans le menu déroulant le signal X ou le signal Y. N’oubliez pas que xdirection est de gauche à droite et que la direction y est de haut en bas sur l’écran. Voir la figure supplémentaire S7.
    REMARQUE: Les données seront enregistrées sous forme de fichiers .out et incluent l’heure, la tension, le déplacement et la force pour chaque direction. Ces fichiers peuvent être exportés dans d’autres logiciels pour la visualisation et l’analyse.

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Résultats

Les cellules d’écoulement contenant les systèmes de faisceaux d’actomyosine sont de conception standard, constituées d’une lame de microscope et d’une lamelle de couverture gravée séparée par un canal constitué de ruban adhésif double face (Figure 1). Le test est ensuite construit à partir de la fiche de couverture en utilisant des introductions par étapes comme décrit dans le protocole. Le test final consiste en des filaments d’actine marqués à la rhodamine ; la concentration de myosine sou...

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Discussion

Une étude in vitro utilisant des pincettes optiques combinées à l’imagerie par fluorescence a été réalisée pour étudier la dynamique des ensembles de myosine interagissant avec les filaments d’actine. Les faisceaux d’actine-myosine-actine ont été assemblés à l’aide de myosine musculaire II, d’actine rhodamine au bas du faisceau et sur la surface de la lame, et de filaments d’actine biotinylés marqués 488 sur le dessus du paquet. La protéine d’actine du muscle de lapin a été polymérisée et stabilisée à l’aide de ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail est soutenu en partie par le Graduate Student Council Research Fellowship (OA) de l’Université du Mississippi, le Sally McDonnell-Barksdale Honors College de l’Université du Mississippi (JCW, JER), le Mississippi Space Grant Consortium sous le numéro de subvention NNX15AH78H (JCW, DNR) et l’American Heart Association sous le numéro de subvention 848586 (DNR).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Protéine d’actine (biotine) : muscle squelettiqueCytosqueletteAB07-AProtéine d’actine biotinylée
Protéine d’actine, muscle squelettique de lapinCytosqueletteAKL99-AProtéine d’actine
Alexa Fluor 488 PhalloïdineInvitrogenA12379Stabilisateur d’actine et colorant Alexa Fluor 488
ATPFisher scientificBP413-25Nécessaire pour l’actine assemblage et motilité de la myosine
Bêta-D-glucoseFisherscientific MP218069110Partie d’un système de piégeage de l’oxygène utilisé pour réduire le photoblanchiment pendant l’imagerie de fluorescence
Blotting Grade Blocker (caséine)Biorad1706404Utilisé pour bloquer la surface de la liaison non spécifique
CaCl2Fisher scientificC79500Le chlorure de calcium, fournit le contrôle nécessaire sur la dynamique du réseau de myosine d’actine
CatalaseFisher scientificICN10040280Partie du système de piégeage de l’oxygène utilisé pour réduire le photoblanchiment lors de l’imagerie de fluorescence
LamellesFisher scientific12544CUtilisé pour fabriquer des cellules d’écoulement
DTTFisherscientific AC327190010Utilisé pour la préparation
de tamponsÉthanolFisher scientificA4094Régent utilisé pour le nettoyage des lamelles
de recouvrement Glucose oxydaseFisher scientific34-538-610KUPartie du système de piégeage de l’oxygène utilisé pour réduire le photoblanchiment pendant l’imagerie de fluorescence
KClFisher scientificP217-500Utilisé pour la préparation du tampon
KOHFisher scientificP250-1Utilisé pour graver les lamelles de recouvrement et ajuster tampon pH
MgCl2Fisher scientificM33-500Utilisé pour la préparation
tampons Lames de microscopeFisher scientific12-544-2Utilisé pour fabriquer des cellules d’écoulement
Protéine Myosine II : muscle squelettique du lapinCytosqueletteMY02Protéine motrice de myosine pleine longueur isolée du muscle squelettique du lapin
Nanotracker2Bruker/JPKNT2Instrument de piégeage optique
Poly-l-lysineSigma-AldrichP8920Installations d’adhérence des filaments d’actine sur la surface en verre de la lamelle
Rhodamine PhalloïdineCytosquelettePHDR1Stabilisateur d’actine et colorant fluorescent à la rhodamine
Perles de streptavidine, 1 &mu ; mSpherotechSVP-10-5Poignée de piégeage optique
Tris-HClFisher scientificPR H5121Utilisé pour la préparation de tampon
de

Références

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Dynamique des prot ines motricesfaisceaux d actomyosineg n ration de forcepi geage optiqueessais cytosquelettiquescalibration de billesfilaments d actine fluorescents
Criblage de la mécanique d’ensemble de la myosine dans des faisceaux de filaments d’actine à l’aide de pincettes optiques
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