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Article de méthode

Microscopie subcellulaire intravitale de la glande mammaire

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DOI :

10.3791/63674

⸱

24 juin 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 3Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une technique simple d’imagerie intravitale de la glande mammaire de la souris allaitante par balayage laser, microscopie confocale et multiphotonique.

Résumé

La glande mammaire constitue un modèle par excellence pour l’étude des fonctions épithéliales, notamment le remodelage tissulaire, la polarité cellulaire et les mécanismes de sécrétion. Au cours de la grossesse, la glande passe d’un arbre canalaire primitif encastré dans un coussinet adipeux à un réseau alvéolaire hautement ramifié prêt pour la formation et la sécrétion de colostrum et de lait. Après l’accouchement, la glande fournit tous les nutriments nécessaires à la survie néonatale, y compris les gouttelettes lipidiques recouvertes d’une membrane, les protéines, les glucides, les ions et l’eau. Divers composants du lait, y compris le lactose, les micelles de caséine et les protéines du lait écrémé, sont synthétisés dans les cellules alvéolaires et sécrétés à partir des vésicules par exocytose à la surface apicale. Les LD sont transportées des sites de synthèse dans le réticulum endoplasmique rugueux à l’apex cellulaire, recouvertes de membranes cellulaires et sécrétées par un mécanisme apocrine unique. D’autres constituants préformés, y compris les anticorps et les hormones, sont transportés du côté séreux de l’épithélium dans le lait par transcytose. Ces processus se prêtent à la microscopie intravitale car la glande mammaire est une glande cutanée et, par conséquent, directement accessible à la manipulation expérimentale. Dans cet article, une procédure simple est décrite pour étudier la cinétique de la sécrétion de LD in situ, en temps réel, chez des souris anesthésiées vivantes. Le bore-dipyrrométhène (BODIPY)665/676 ou le monodansylpentane sont utilisés pour marquer la fraction lipidique neutre des souris transgéniques, qui expriment soit l’EGFP soluble (enhanced green fluorescent protein) dans le cytoplasme, soit un peptide ciblant la membrane fusionné à l’EGFP ou au tdTomato. Les protéines de fusion membranaires servent de marqueurs de la surface cellulaire et les colorants lipidiques résolvent les LD ≥ 0,7 μm. Les images en accéléré peuvent être enregistrées par microscopie confocale à balayage laser standard jusqu’à une profondeur de 15 à 25 μm ou par microscopie multiphotonique pour une imagerie plus profonde dans les tissus. La glande mammaire peut être baignée d’agents pharmacologiques ou de colorants fluorescents tout au long de la chirurgie, fournissant une plate-forme pour des manipulations expérimentales aiguës si nécessaire.

Introduction

La microscopie intravitale de la glande mammaire de souris attire de plus en plus l’attention en tant que méthode puissante pour analyser toute une gamme de phénomènes biologiques, y compris l’origine et la différenciation des cellules souches 1,2, la progression des tumeurs métastatiques 3,4,5 et le rôle des macrophages canalaires tout au long du développement mammaire et de l’involution6. Grâce au développement de la microscopie subcellulaire intravitale (ISMic)7, les recherches ont été étendues au trafic membranaire et aux mécanismes de sécrétion pendant la lactation 8,9, et à la contraction des cellules myoépithéliales médiée par l’ocytocine 9,10. Deux méthodes principales ont été développées pour tirer parti de l’accessibilité de la glande entre la peau et la paroi du corps.

Dans la première approche, une fenêtre en acrylique ou en verre est insérée dans la peau et fixée avec un anneau de retenue métallique 1,3,11. Les souris tolèrent bien la chirurgie, et divers phénomènes peuvent être analysés de manière intermittente chez un même animal pendant plusieurs semaines. Cette méthode s’est avérée particulièrement utile pour le traçage de la lignée 1,12 et le suivi de l’invasion et de la progression des tumeurs mammaires in situ 3,11. Cependant, la résolution en dessous du niveau de la cellule entière s’est avérée difficile car la glande est toujours attachée à la paroi du corps et est donc soumise à des artefacts de mouvement causés par la respiration et le rythme cardiaque.

Dans la deuxième approche, la glande est exposée chirurgicalement sur un lambeau de peau avec un système vasculaire intact et stabilisée sur la platine du microscope avec des espaceurs 4,9,13. Une partie de la glande est ainsi efficacement séparée de la paroi abdominale, et les artefacts de mouvement sont minimisés. Dans la plupart des cas, le parenchyme exposé est placé directement sur la lamelle avec la face ventrale de la souris vers le bas sur un microscope inversé. Dans une modification récente, la souris a été placée en décubitus dorsal sur un microscope vertical, et la glande exposée a été protégée dans une cellule remplie de liquide scellée avec une lamelle2. Cette dernière configuration permet d’accéder à la surface parenchymateuse pour une manipulation expérimentale lors de l’imagerie. Dans les deux cas, la résolution jusqu’à <1 μm permet d’analyser les processus intracellulaires, comme en témoigne le suivi des gouttelettes lipidiques (LD) dans les cellules épithéliales mammaires9.

Le protocole actuel détaille une méthode simple pour l’imagerie intravitale des cellules épithéliales mammaires au niveau subcellulaire en utilisant la biogenèse, le transport et la sécrétion de LD pendant la lactation à titre d’exemple. Cette approche est largement applicable à de nombreux autres processus, y compris le transport et la sécrétion de protéines de lait14, la transcytose des protéines de la face séreuse de l’épithélium à la lumière alvéolaire15,16 et le remodelage de la glande pendant l’involution17,18.

Les souris exprimant une protéine fluorescente sont préférées pour la plupart des expériences intravitales afin de faciliter la sélection des zones appropriées pour l’imagerie et comme marqueur morphologique de référence. Il existe une large gamme de souris transgéniques et knock-in appropriées, qui expriment des marqueurs protéiques fluorescents dans les compartiments cellulaires, les éléments cytosquelettiques, les membranes et les organites19. Dans les exemples donnés, la sourisEGFP cyto FvB a été utilisée, dans laquelle la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) est ciblée sur le cytoplasme de la plupart des cellules20 (notéecyto EGFP), et la souris C57BL/6J Tomato (mT/mG)21, qui est une double lignée Cre fluorescente codant pour les gènes tdTomato et EGFP. L’expression de l’EGFP est rendue possible par l’excision du gène tdTomato par Cre. L’un ou l’autre fluorophore est ciblé sur la membrane plasmique dans la plupart des cellules par le biais d’un séquon dérivé de la protéineMARCKS 21. Dans ce travail, les souris exprimant le fluorophore rouge tdTomato sont notées tdTomatomembr (mT), et les souris exprimant EGFP, après excision du gène tdTomato sont notées EGFPmembr (mG).

Les souris ont cinq paires de glandes mammaires de chaque côté de la ligne médiane ventrale, trois dans la région thoracique (numérotées de 1 à 3) et deux dans la région inguinale (numérotées de 4 à 5) (figure 1A). Pour ISMic, les glandes inguinales sont les plus accessibles et les plus faciles à stabiliser, car elles sont les plus éloignées des mouvements globaux associés à la respiration et au rythme cardiaque dans le thorax.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre de recherche sur le cancer, l’Institut national du cancer, les National Institutes of Health, conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches des États-Unis, à la politique du Service de santé publique des États-Unis sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire. et le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Pour ce travail, les glandes numéro 4 de souris primipares femelles (âgées de 4 à 5 mois, jour 10 de lactation) ont été préparées chirurgicalement en position couchée sur le dos droit (Figure 1A).

1. Préparation des animaux

  1. Pesez la souris sur une balance à chargement par le haut pour calculer la quantité d’anesthésique requise.
  2. Pendant et après l’application d’anesthésiques, maintenez la température corporelle en plaçant la souris sur un coussin chauffant.
  3. Anesthésier la souris par une brève exposition à l’isoflurane (3,0 % à 3,5 %) dans une chambre respiratoire saturée d’oxygène (voir le tableau des matériaux) pendant 1 à 2 minutes, suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine.
  4. Maintenir les animaux sous anesthésie profonde pendant la chirurgie et l’imagerie en appliquant des doses titrées de xylazine et de kétamine (de la moitié au quart de la dose initiale décrite à l’étape 1.3) à travers un cathéter à demeure (voir étape 3.4) toutes les 45 minutes environ, au besoin.
    REMARQUE : Un plan d’anesthésie optimal est plus facilement maintenu en vérifiant les réflexes palpébraux et de pincement des orteils toutes les 10 à 20 minutes. La température des souris conscientes est de 36,5 à 38 °C, qui chute à 34,5 °C sous anesthésie.
  5. Croiser les petits22 si des souris donneuses à un stade de lactation similaire sont disponibles ; sinon, euthanasiez la litière.
    REMARQUE : Les petits âgés de <10 jours doivent être euthanasiés par exposition à 3,0 % d’isoflurane suivie d’une décapitation. Les petits âgés de ≥10 jours doivent être euthanasiés par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale.

2. Procédure chirurgicale

  1. Gardez la souris au chaud tout au long de l’opération sur un coussin chauffant. Rasez la fourrure de la peau entourant les glandes mammaires 4 et 5 (décubitus dorsal, côté droit) à l’aide d’un rasoir électrique à main. Nettoyez la zone rasée avec trois gommages alternés à la bétadine et à l’alcool.
  2. Essuyez tous les instruments chirurgicaux avec de l’alcool à 70 %. Faites une incision médiane de ~1 cm près du quatrième mamelon en pinçant la peau avec une pince à épiler et en coupant la peau en relief avec des ciseaux tranchants. Faites des incisions circulaires autour de la glande dans les directions crânienne et caudale et retirez soigneusement la peau de l’abdomen. Gardez la peau exposée humide avec une solution saline physiologique.
  3. Pour minimiser la perte de sang, scellez tous les vaisseaux sanguins proéminents avec un cautériseur à main (voir le tableau des matériaux) avant de les couper. Tout sang exogène doit être rapidement éliminé avec une solution saline physiologique pour éviter une perte ultérieure de résolution optique.
  4. Éliminez le tissu conjonctif et adipeux superficiel en tapotant doucement la couche superficielle à l’aide d’une pince fine.
  5. Gardez la glande exposée humide avec une solution saline physiologique et protégez la paroi abdominale avec du gel et un film thermoplastique semi-transparent et flexible (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE : Les étapes 2.2 à 2.5 créent un lambeau de peau avec une partie de la glande et du système vasculaire associé séparée de la paroi abdominale (figure 1Bi-iv).
  6. Si nécessaire, traitez la glande avec des agents exogènes, par exemple des agents pharmacologiques ou des colorants spécifiques aux organites, en baignant la glande exposée pendant l’opération.
    REMARQUE : Dans les exemples donnés, les LD d’une sourisEGFP cyto ou EGFPmembr (mG) ont été marquées avec 1,0 mL de bore-dipyrrométhène (BODIPY)665/676 (10 mM de solution mère dans du sulfoxyde de diméthyle dilué 1 à 1 000 fois dans une solution saline et appliquée pendant <1 h) et chez la souris tdTomatomembr (mT) ou EGFPmembr (mG), avec 0,5 mL de monodansylpentane23 (solution mère 0,1 M dans du sulfoxyde de diméthyle diluée 1 à 1 000 fois dans une solution saline et appliquée pendant 5 min).

3. Préparation de l’imagerie

  1. Positionnez soigneusement la souris avec la face abdominale vers le bas sur une platine de microscope inversée chauffée (37 °C), de sorte que le rabat cutané s’étende sur le verre de protection central (30 mm) (Figure 1Biv). Protégez les zones exposées avec une fine couche de gel.
  2. Stabilisez le lambeau de peau avec des entretoises sur mesure pour amortir la glande des artefacts de mouvement causés par la respiration et le rythme cardiaque. Pour ce faire, placez une entretoise crantée faite de trois bâtonnets de coton collés (Figure 1Ci) entre le rabat de peau et la paroi du corps et fixez la patte arrière et la queue à la platine derrière l’entretoise (Figure 1Bv).
  3. Empêchez le rabat cutané de glisser pendant l’imagerie en collant solidement un couvercle en plastique (Figure 1Cii) à chaque extrémité de l’ouverture de la platine (Figure 1Bv).
  4. Insérez un cathéter à demeure sous-cutané sous la peau dorsale attaché à un tube, une seringue et une pompe (voir la table des matériaux).
  5. Confirmez que le lambeau cutané est stable avec un flux sanguin adéquat par microscopie à fluorescence conventionnelle (Figure 1Bvi).
  6. Recouvrez la souris d’une gaze éponge (voir tableau des matériaux) pour la garder au chaud pendant l’imagerie,
    REMARQUE : Les étapes 3.1 à 3.5 sont les plus critiques pour garantir l’acquisition de vidéos haute résolution adaptées à l’analyse quantitative. Il est inutile de dépasser ce stade si la stabilité des tissus n’a pas été confirmée.

4. Microscopie

  1. Pour la microscopie confocale conventionnelle de la souris EGFPcyto ou EGFPmembr (mG) marquée avec BODIPY665/676 (Figure 2, Vidéo 1 et Vidéo 2), utilisez un microscope inversé équipé d’un objectif d’immersion dans l’huile 60x préchauffé, maintenu à 37 °C (voir Tableau des matériaux).
    1. Détectez séparément EGFP et BODIPY665/676 à l’aide des lasers 488 et 633, respectivement ; pour EGFP, excitation 488 nm, et émission 560 nm, avec filtre passe-bande BA 505-605 ; pour BODIPY665/676, excitation 633 nm et émission 668 nm, avec filtre passe-bande BA 655-755.
    2. Collectez les images par balayage linéaire à 4 ou 8 μs/pixel (512 x 512 pixels ; 12 bits par pixel) toutes les 5 s ou 10 s pendant 1 à 2 h et stockez-les sous forme de fichiers TIFF. Conservez manuellement les zones numérisées dans le cadre en corrigeant la dérive x/y tout au long du cycle d’imagerie. Construisez des images 3D à partir de z-scans à l’aide d’un logiciel associé au microscope (voir Tableau des matériaux).
  2. Pour la microscopie à deux photons de la sourisEGFP membr (mG) marquée au monodansylpentane (Figure 3, Vidéo 3), utilisez un microscope inversé équipé d’un laser accordable et d’un objectif 30x préchauffé à 37 °C (voir Tableau des matériaux).
    1. Excité le presse-étoupe à 910 nm et détection du monodansylpentane et de l’EGFP avec deux détecteurs GaAs, en utilisant des filtres passe-bande 410-460 nm et 495-540 nm pour les émissions bleues et vertes, respectivement.
    2. Collectez des images par balayage linéaire à 2 μs/pixel (320 x 320 pixels ; 16 bits par pixel) et stockez-les sous forme de fichiers OIR. Conservez manuellement les zones numérisées dans le cadre en corrigeant la dérive x/y tout au long du cycle d’imagerie. Construisez des images 3D à partir de z-scans à l’aide d’un logiciel associé au microscope.
  3. Pour la microscopie à deux photons de la souris tdTomatomembr (mT) marquée au monodansylpentane (Figure 4, Vidéo 4), utilisez un microscope inversé avec des lasers accordables et un objectif 63x préchauffé à 37 °C (voir le tableau des matériaux).
    1. Excitez des échantillons à 800 nm et 1 060 nm simultanément et détectez le monodansylpentane avec un détecteur hybride HyD réglé à l’émission 418-471 nm et TdTomato avec un autre détecteur hybride HyD réglé à l’émission 595-667 nm.
    2. Collectez les images par balayage linéaire avec quatre lignes en moyenne à 200 Hz (512 x 512 pixels ; 12 bits par pixel) et stockez-les sous forme de fichiers LIF. Conservez manuellement les zones numérisées dans le cadre en corrigeant la dérive x/y tout au long du cycle d’imagerie. Construisez des images 3D à partir de balayages z à l’aide d’un logiciel associé au microscope.

5. Euthanasie

  1. Euthanasier les souris à la fin de l’imagerie par inhalation de CO2 en suivant les protocoles approuvés par l’établissement.

6. Création de vidéos en temps réel

  1. Convertissez les séquences temporelles en fichiers TIFF, puis en vidéos à l’aide d’un logiciel approprié (voir la Table des matériaux).
    REMARQUE : L’analyse quantitative de vidéos spécifiques dépasse le cadre de cet article et nécessitera des méthodes spécifiques pour résoudre des problèmes spécifiques. Par exemple, voir Ebrahim et al.24 pour le rôle des complexes d’actimyosine dans l’exocytose de la salive des glandes salivaires, Meyer et al.25 pour la dynamique de la sécrétion biliaire par le foie, et Masedunskas et al.9 pour l’analyse de la sécrétion de LD par les cellules épithéliales mammaires.

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Résultats

Le lait est sécrété par des cellules épithéliales alvéolaires polarisées, qui se différencient pendant la grossesse à partir des bourgeons d’un arbre ductulaire étendu26 (Figure 2A). Les précurseurs de la synthèse du lait sont assimilés à travers les membranes basales/latérales et les produits finis sont sécrétés à travers la surface apicale dans un « espace laitier » central. La face basale de chaque alvéole est recouverte d’un réseau stellaire de cellules myoépithél...

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Discussion

L’utilisation d’un microscope à un ou plusieurs photons dépend des questions posées, de la nature et de l’emplacement du tissu à imager et de la résolution requise. Les microscopes multiphotoniques sont basés sur la génération de deux photons de faible énergie ou plus dans le proche infrarouge, qui peuvent pénétrer les tissus à une plus grande profondeur avec moins de phototoxicité que les microscopes à un photon29,30. De plus, l...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a d’intérêts conflictuels à déclarer.

Remerciements

Les auteurs remercient Sherry Rausch et Samri Gebre (National Cancer Institute, NIH) pour la gestion et les soins aux animaux, ainsi que James Mather pour son aide dans la production d’une gamme d’espaceurs en plastique. Cette recherche a été financée [en partie] par le programme de recherche intra-muros des NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
488 laserMelles-Griot-CWnbsp ; laser 50 mW
60x Objectif à immersion dans l’huile PLAPON (NA 1.42)Olympus1-U2B933Lentille Microscope confocal
633 laserMelles-Griot-CWHe-Ne laser 12 mW
63x objectif (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350Lens Microscope à deux photons
BA 410-460 nmChroma-Filtre passe-bande
BA 495-540 nmFiltre passe-bandeChroma
BA 505-605 nmFiltre passe-bandechromatique
BA 655-755 nmFiltre passe-bandechroma-dipyrrométhane
(BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932Capteur de peroxythérapie lipidique
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651
CathéterTerumoSV27ELSets de perfusion à ailettes  ;
CautériseurBraintree Scientific, IncGEM 5917Système de cautère
CMV-Cre souris  ;Jackson lab006054Ligne de souris
CoverslipBioptechs-30mmde diamètre coverlip pour microscope inversé
Curity 4x4 inch tout usage gaze épongeCovidien9024Éponge
EGFPcyto sourisJackson lab003291Ligne de souris
Fiji/ImageJ softwaresource-Freesoftware tool
Pince fineBraintree Scientific, IncFC003 8Pince à tissus
Microscope Fluoview 1000 OlympusFV1000Microscope confocal
Logiciel FluoViewMicroscope confocal Olympus-Microscope et microscope à deux photons
Rasoir électrique portatifBraintree Scientific, IncCLP-8786-451ATondeuse sans fil
Coussin chauffantBraintree Scientific, IncDPIP Coussin chauffant pour animaux
Détecteurs HyD Détecteurspectral Leica-Leica 4Tune
Logiciel Imaris Bitplane/ Oxford instruments-CommercialOutil logiciel
Ingisht X3 Laser accordable SpectraPhysicsInsight X3Laser à impulsions accordables
IsofluraneVetOne13985-046-40Anesthésique
kétamine  ;VetOne13985-702-10Anesthésique
LAS X LogicielLeica-Microscopedeux photons Outil logiciel
Mai-Tai Laser accordable SpectraPhysicsMai-TaiLaser
MetaMorphMolecularDevices-CommercialOutil logiciel
Monodansylpentane AUTODOTAbceptaSm1000aColorant pour gouttelettes lipidiques
MPE-RS microscopeOlympusIX70Microscope à deux photons
souris mT/mGJackson lab007676Ligne de souris
Chauffaged’objectif Bioptechs150819Chauffage d’objectif pour microscopes confocaux et à deux photons
Chambre respiratoire saturée d’oxygènePatterson Scientific78933385, SAS3 et EVAC4Système d’anesthésie et d’évacuation gazeuse  ;
ParafilmHeathrow ScientificHS234526Bà film thermoplastique semi-transparent, flexible
Olympus-Descanned  ;   ; détecteurs
Détecteur PMTLSM-TechnologyDétecteurs non désançonnésfabriqués sur mesure
PompeHarvard Appareil703602, 704402Injecteur et contrôleur Nanomite
SalineBiologique114-055-721EASaline normale
Ciseaux tranchants à bout émousséBraintree Scientific, IncSCT-S 508Ciseaux
chirurgicauxSeringueCovidien22-257-150Seringue à tuberculine 1mL
TCS SP8 Microscope spectral de plongéeLeicaSP8Microscope à deux photons
épiler  ;Braintree Scientific, IncFC032Pince à tissus
Xylazine  ;VetOne13985-704-10Anesthésique
& Gel Open à Détecteur PMT QualitéPince à

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