La combinaison de la transduction du vecteur viral et de l’élimination du cerveau à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément un grand nombre de neurones et d’astrocytes.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Étude de l’interaction spatiale entre les astrocytes et les neurones dans les cerveaux nettoyés
Dans cet article
Résumé
Résumé
La combinaison de la transduction des vecteurs viraux et de l’élimination des tissus à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément plusieurs types de cellules cérébrales et leurs interactions. La transduction de vecteurs viraux permet le marquage de divers types de cellules dans différentes couleurs de fluorescence dans le même tissu. Les cellules peuvent être identifiées génétiquement par activité ou projection. En utilisant un protocole CLARITY modifié, la taille potentielle de l’échantillon d’astrocytes et de neurones a augmenté de 2 à 3 ordres de grandeur. L’utilisation de CLARITY permet l’imagerie d’astrocytes complets, qui sont trop gros pour tenir dans leur intégralité en tranches, et l’examen des somata avec tous leurs processus. En outre, il offre la possibilité d’étudier l’interaction spatiale entre les astrocytes et différents types de cellules neuronales, à savoir le nombre de neurones pyramidaux dans chaque domaine astrocytaire ou la proximité entre les astrocytes et des populations spécifiques de neurones inhibiteurs. Ce document décrit, en détail, comment ces méthodes doivent être appliquées.
Introduction
Au cours des dernières années, la connaissance de la fonction des astrocytes et de la façon dont ils interagissent avec les circuits neuronaux a considérablement augmenté. Les astrocytes peuvent influencer la plasticité 1,2, aider à la récupération neuronale post-blessure 3,4, et même induire une potentialisation neuronale de novo, avec des études récentes montrant l’importance des astrocytes dans l’acquisition de la mémoire et la récompense, auparavant considérées comme des fonctions purement neuronales 5,6,7
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université hébraïque et respectaient les directives du Guide de l’Institut national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Transduction du vecteur viral
REMARQUE: La transduction du vecteur viral est utilisée pour exprimer les fluorophores dans le cerveau.
- Utilisez un atlas (p. ex., Allen Brain Atlas) pour localiser la coordination pertinente de la zone cible.
REMARQUE : Les atlas 3D peuvent être consultés en ligne (p. ex., http://connectivity.brai....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Le nettoyage réussi des tranches épaisses de tissu cérébral entraîne une nouvelle gamme de questions qui peuvent être posées concernant les propriétés des grandes populations cellulaires par opposition aux propriétés des cellules individuelles ou des groupes de cellules voisines. Pour obtenir des résultats positifs, il faut respecter strictement le protocole CLARITY, car il existe un large éventail de paramètres qui doivent être pris en compte pour réduire la variance entre les échantillons (par exemple, pourcentage de c.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les méthodes de nettoyage des tissus présentent un outil révolutionnaire dans la recherche sur le cerveau, invitant à des questions qui n’auraient pas pu être posées auparavant. En ciblant les propriétés d’un petit groupe de cellules, d’une seule cellule ou même d’une seule synapse, CLARITY permet désormais de cibler des populations cellulaires totales ou des caractéristiques de connectivité à longue portée en utilisant des fluorophores pertinents.
Le résultat de l’expression du fluorophore et.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 803589), de la Fondation israélienne pour la science (subvention ISF n° 1815/18) et des subventions Canada-Israël (CIHR-ISF, subvention n° 2591/18). Nous remercions Nechama Novick d’avoir commenté l’ensemble du manuscrit.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP ::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vecteur viral utilisé pour détecter les astrocytes | |
| AAV5-CaMKII ::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vecteur viral utilisé pour détecter les neurones | |
| AAV5-CaMKII ::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vecteur viral utilisé pour détecter les noyaux neuronaux | |
| AAV5-CaMKII ::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vecteur viral utilisé pour détecter les neurones | |
| Acrylamide (40 %) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2 %) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Acide borique | Sigma | #B7901 | Poids moléculaire - 61,83 g/mol |
| Microscope confocal, balayage, FV1000 | Objectif Olympus | 4x (UPlanSApo, 0,16 NA) | |
| Logiciel | ImarisBitplane, Royaume-Uni | Un logiciel qui permet l’analyse 3D d’images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4 % | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| Logiciel | Un logiciel qui permet l’analyse 3D d’images à l’aide de la réalité virtuelle | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Poids moléculaire - 121,14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Microscope à deux photons | Neurolabware | Laser Ti :saphir (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubes photomultiplicateurs GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtre passe-bande (Semrock), objectif 16x immersion dans l’eau (Nikon, 0,8 NA) ; | |
| VA-044 Initiateur | Wako | #011-19365 |
Références
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
