Étude de l’interaction spatiale entre les astrocytes et les neurones dans les cerveaux nettoyés

Résumé

La combinaison de la transduction du vecteur viral et de l’élimination du cerveau à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément un grand nombre de neurones et d’astrocytes.

Résumé

La combinaison de la transduction des vecteurs viraux et de l’élimination des tissus à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément plusieurs types de cellules cérébrales et leurs interactions. La transduction de vecteurs viraux permet le marquage de divers types de cellules dans différentes couleurs de fluorescence dans le même tissu. Les cellules peuvent être identifiées génétiquement par activité ou projection. En utilisant un protocole CLARITY modifié, la taille potentielle de l’échantillon d’astrocytes et de neurones a augmenté de 2 à 3 ordres de grandeur. L’utilisation de CLARITY permet l’imagerie d’astrocytes complets, qui sont trop gros pour tenir dans leur intégralité en tranches, et l’examen des somata avec tous leurs processus. En outre, il offre la possibilité d’étudier l’interaction spatiale entre les astrocytes et différents types de cellules neuronales, à savoir le nombre de neurones pyramidaux dans chaque domaine astrocytaire ou la proximité entre les astrocytes et des populations spécifiques de neurones inhibiteurs. Ce document décrit, en détail, comment ces méthodes doivent être appliquées.

Introduction

Au cours des dernières années, la connaissance de la fonction des astrocytes et de la façon dont ils interagissent avec les circuits neuronaux a considérablement augmenté. Les astrocytes peuvent influencer la plasticité ^1,2, aider à la récupération neuronale post-blessure ^3,4, et même induire une potentialisation neuronale de novo, avec des études récentes montrant l’importance des astrocytes dans l’acquisition de la mémoire et la récompense, auparavant considérées comme des fonctions purement neuronales ^5,6,7 . Une caractéristique particulièrement intéressante dans la recherche sur les astrocytes est la disposition spatiale des cellules, qui maintiennent des organisations spatiales uniques dans l’hippocampe et d’autres structures cérébrales ^8,9,10. Contrairement aux dendrites neuronales qui s’entrelacent entre les somata cellulaires, les astrocytes de l’hippocampe habitent des territoires visuellement distinguables avec un léger chevauchement entre leurs processus, créant des domaines distincts ^8,11,12,13. Les preuves soutenant la participation des astrocytes dans les circuits neuronaux ne soutiennent pas l’absence de description anatomique détaillée de ces populations et des neurones dans leurs domaines¹⁴.

Les procédures de transduction des vecteurs viraux, ainsi que les animaux transgéniques (TG), ont été popularisés comme un ensemble d’outils pour étudier les structures cérébrales, les fonctions et les interactions cellulaires^15,16. L’utilisation de différents promoteurs permet de cibler des cellules spécifiques en fonction de leurs propriétés génétiques, de leurs niveaux d’activation^17,18 ou de leurs cibles de projection. Différents virus peuvent exprimer des fluorophores de différentes couleurs dans différentes populations. Un virus peut être combiné avec l’expression endogène de fluorophores dans la TG, ou les animaux TG peuvent être utilisés sans avoir besoin de virus. Ces techniques sont largement utilisées pour le marquage neuronal, et certains laboratoires ont commencé à les utiliser avec des modifications spécialisées pour cibler d’autres types de cellules, telles que les astrocytes ^5,9,19.

La technique CLARITY, décrite pour la première fois en 2013^20,21, permet ^d’étudier des tranches de cerveau épaisses en rendant l’ensemble du cerveau transparent tout en laissant les structures microscopiques intactes. En combinant les deux méthodes - transduction du vecteur viral et nettoyage des tissus - l’option d’examiner les interactions spatiales entre différentes populations de type cellulaire est maintenant disponible. La plupart des études d’interaction astrocyte-neurone ont été réalisées sur de fines tranches de cerveau, ce qui a donné lieu à des images d’astrocytes incomplets en raison de leurs grands domaines, limitant ainsi radicalement le nombre de cellules analysées. L’utilisation de la technique CLARITY permet de caractériser simultanément la résolution unicellulaire des populations cellulaires dans des volumes à grande échelle. L’imagerie de populations cellulaires marquées par fluorescence dans des cerveaux clairs n’offre pas de résolution synaptique, mais permet une caractérisation approfondie des interactions spatiales entre les astrocytes et une variété de types de cellules neuronales.

Pour cette raison, nous avons exploité ces techniques de pointe pour étudier les propriétés des astrocytes dans l’ensemble du CA1 dorsal, en imageant toutes les lames (Stratum Radiatum, couche pyramidale et Stratum Oriens). Nous avons mesuré des dizaines de milliers d’astrocytes (avec une pénétrance virale de >96%⁵), analysant ainsi l’information de l’ensemble de la population astrocytaire autour de CA1. Avec une pénétrance efficace des marqueurs neuronaux, nous avons pu enregistrer les interactions entre l’ensemble de la population d’astrocytes CA1 et les quatre types de cellules neuronales- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), neurones inhibiteurs VIP et cellules pyramidales excitatrices⁹.

Plusieurs expériences ont été réalisées en utilisant une combinaison de fluorescence d’animaux TG et de vecteurs viraux de couleurs différentes (toutes les cellules inhibitrices), tandis que d’autres (excitatrices) ont utilisé deux vecteurs viraux exprimant différents fluorophores sous différents promoteurs⁹. Cet article présente un protocole détaillé, y compris le marquage des cellules souhaitées dans le cerveau, rendant le cerveau transparent à l’aide d’une procédure CLARITY modifiée, ainsi que l’imagerie et l’analyse de structures cérébrales complètes, à l’aide de diverses procédures et logiciels.

Protocole

Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université hébraïque et respectaient les directives du Guide de l’Institut national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Transduction du vecteur viral

REMARQUE: La transduction du vecteur viral est utilisée pour exprimer les fluorophores dans le cerveau.

1. Utilisez un atlas (p. ex., Allen Brain Atlas) pour localiser la coordination pertinente de la zone cible.
   REMARQUE : Les atlas 3D peuvent être consultés en ligne (p. ex., http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. En utilisant la chirurgie stéréotaxique, injecter les vecteurs viraux dans la structure cérébrale pertinente. Voir⁹ pour un protocole détaillé.
3. Attendez 3 à 6 semaines pour l’expression du fluorophore.
   REMARQUE: Une courte période de temps suffit si seuls les corps cellulaires doivent être marqués. Une longue période de temps sera nécessaire si les projections axonales sont pertinentes pour la question, car il faut plus de temps pour que les fluorophores s’expriment dans les axones, qui peuvent mesurer plusieurs millimètres de long.
4. Valider au préalable la spécificité et la pénétrance de l’expression des fluorophores (tant de l’expression virale que des animaux TG) (Figure 1A). Avant de procéder à la procédure CLARITY, désignez au moins un cerveau pour les tranches minces et assurez-vous que l’expression du fluorophore est à la fois forte et spécifique à la caractéristique de la cellule cible.

2. CLARTÉ

REMARQUE: Cette méthode rend le cerveau transparent dans les 2-6 semaines.

1. Effectuer une perfusion transcrânienne sur des animaux en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) suivie de 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS. Retirez le cerveau et conservez-le dans du PFA pendant la nuit à 4 °C dans un tube de 50 mL ou un récipient similaire.
   REMARQUE: Avant la perfusion transcrânienne, l’animal doit être profondément anesthésié. Dans les exemples présentés dans ce protocole, tous les animaux ont été anesthésiés à l’aide de kétamine et de xylazine (90% et 10%, respectivement).
2. Remplacer le PFA par une solution d’hydrogel (SH; voir tableau 1) pendant 48 h à 4 °C.
   REMARQUE: Ne laissez pas les matériaux devenir plus chauds que la température de réfrigération (4-8 ° C) à ce stade, sinon l’hydrogel va polymériser. Le SH utilisé dans ce protocole contient 2% d’acrylamide, contrairement aux protocoles précédents suggérant 4%²² ou 1%¹⁷. L’avantage de 2% est détaillé dans la section de discussion. Lors de la préparation du SH, travaillez sur une surface glacée. Conservez-le à -20 °C.
3. Dégazage
   REMARQUE: Le but de cette étape est d’éliminer tout l’oxygène libre du tissu car O₂ interfère avec le processus de polymérisation. N’importe quel gaz_nonO2 peut être utilisé (par exemple,_N2, CO₂); N₂ est recommandé.
   1. Transférer le N₂ du réservoir via un tube flexible de 5 mm (interne), relié à une aiguille de 19 G à son extrémité (Figure 1B).
   2. Faites deux petits trous (larges à l’aiguille) dans le bouchon du tube : l’un pour introduire le gaz et l’autre pour permettre à l’air de quitter le tube (Figure 1C).
   3. Fixez le tuyau du gaz_N2 au tube et remplacez les gaz pendant environ 30 minutes à température ambiante (RT).
   4. Retirez le tuyau et scellez immédiatement les trous avec de la pâte à modeler sur chaque tube (Figure 1D).
4. Transférer les tubes scellés dégazés dans un bain à 37 °C pendant 3,5 h pour polymériser le SH, qui deviendra un gel. Veillez à ne pas secouer les tubes (Figure 1E).
5. Extrayez le cerveau du tube et retirez doucement le gel polymérisé de son entourage à l’aide de lingettes de laboratoire. Assurez-vous qu’aucun gel résiduel ne reste attaché à la surface du tissu, car il pourrait réagir avec la solution dans les étapes suivantes, inhibant le processus de nettoyage des tissus (Figure 1F).
   REMARQUE: Parce que le gel contenait du PFA, l’extraction doit être effectuée sous une hotte aspirante.
6. Tranchez le cerveau si la question à l’étude n’en nécessite qu’une partie. Divisez-le en deux ou en tranches très épaisses contenant toutes les zones d’intérêt (Figure 1G).
7. Placer les tranches dans la première solution de nettoyage (CS1, voir tableau 2) dans un nouveau récipient et agiter à 70 tr/min pendant 24 h à 37 °C.
8. Suivez les étapes décrites ci-dessous pour transférer le cerveau de CS1 à la deuxième solution de nettoyage (CS2, voir le tableau 2).
   1. Préparez à l’avance un tube perforé pour le cerveau (Figure 1H).
   2. Préchauffer CS2 à 40-45 °C dans un bécher suffisamment grand pour contenir le tube. Faites-le sur une plaque chauffante avec un agitateur. S’assurer que la température n’atteint pas 55 °C pour éviter le blanchiment des protéines exprimées.
   3. Placer le bécher rempli de CS2 et le tube perforé sur un dispositif d’agitation (un bécher de 2 L dans la figure 1I). Réglez un taux d’agitation modéré qui fera couler le liquide sans déformer le tissu.
      REMARQUE: Dans les 2 à 6 semaines, le tissu deviendra transparent (le processus commence à la périphérie et se déplace vers l’intérieur vers les structures cérébrales centrales). La décision quant au moment où le tissu est « assez clair » dépend du jugement personnel. Le cerveau doit être suffisamment transparent pour l’imagerie au microscope sans interférence (la figure 1J n’est pas assez claire; Figure 1K assez claire). Dépasser le point où le tissu est suffisamment clair peut entraîner une perte de rigidité tissulaire.
9. Transfert de CS2 dans PBST (0,5 % triton X-100 en PBS, voir tableau 2) dans un nouveau récipient à 37 °C avec une légère agitation (70 tr/min) pendant 24 h.
   REMARQUE : Dans le PBST, le tissu deviendra blanchâtre (Figure 1L). La clarté reviendra (et s’améliorera) lorsqu’elle sera intégrée dans la solution de correspondance d’indice de réfraction (RIMS, voir l’étape 2.14).
10. Remplacez le PBST par un nouveau PBST. Conserver dans les mêmes conditions (37 °C avec une légère agitation) pendant encore 24 h.
11. Remplacez à nouveau PBST par un nouveau PBST et maintenez à RT pendant 24 h.
12. Transfert vers PBS à RT pendant 24 h.
13. Remplacez le PBS et laissez à RT pendant 24 heures supplémentaires.
14. Retirez le cerveau du PBS et transférez-le au RIMS à 37 °C pendant la nuit.
    REMARQUE: Initialement, des ondulations dans le RIMS peuvent entourer le cerveau. Ce protocole a été conçu et validé à l’aide de deux RIMS commerciaux spécifiques (voir tableau 3). Cependant, le protocole ne doit pas différer lors de l’utilisation d’autres RIMS (commerciaux ou auto-fabriqués).
15. Maintenir le tissu à TA pendant encore 24 heures ou jusqu’à ce que la solution atteigne son plein équilibre, c’est-à-dire lorsque le tissu devient transparent et que la solution ne contient plus d’ondulations visibles (Figure 1M).
16. Si le tissu est transparent, passez à la préparation de la chambre. Si, à ce stade, le tissu devient blanc au lieu d’être transparent (en raison d’agrégats de molécules résiduelles de FDS), nettoyez à nouveau l’échantillon en répétant les étapes 2.9 et 2.10 et transférez le tissu dans CS2 (étape 2.8) pendant quelques jours, suivi de toutes les étapes jusqu’à l’étape 2.15.

3. Préparation de la chambre

REMARQUE: Chaque échantillon nécessite une lame avec une chambre d’imagerie dans laquelle l’échantillon sera placé.

1. Placez l’échantillon au milieu de la diapositive.
2. À l’aide d’un pistolet à colle chaude, créez des murs sur les bords de la glissière, presque aussi hauts que le tissu. Assurez-vous de laisser un petit espace (environ 5 mm) à l’un des coins (Figure 2A,B).
3. Appliquez 1-2 gouttes du RIMS sur l’échantillon pour garder la surface supérieure humide et empêcher la formation de bulles entre le couvercle et le tissu.
4. Immédiatement après l’application des gouttes RIMS, ajoutez la dernière couche de colle chaude sur les parois (afin qu’elles atteignent la hauteur du cerveau / tranche) et progressez immédiatement (pendant que la colle chaude est encore liquide) à l’étape 3.5.
5. Scellez le dessus avec un couvercle, en le plaçant aussi uniformément que possible sur le dessus de la couche de colle chaude encore chaude (Figure 2C).
6. Remplissez la chambre avec le RIMS à travers l’espace laissé dans les parois de colle chaude (Figure 2D,E).
7. Comblez l’écart avec de la colle chaude. Ne laissez pas d’air à l’intérieur (Figure 2F).
8. Si les parois de colle chaude s’étendent au-delà des bordures de la glissière, coupez les bords d’extension (Figure 2G).
9. Si l’objectif utilisé pour l’imagerie est immergé, ajoutez encore 2 à 3 mm de colle sur les parois au-dessus du couvercle afin que la solution d’immersion dure plus longtemps (Figure 2H).

4. Imagerie (confocale ou à deux photons)

1. Vérifiez si la scène peut contenir la chambre, car l’épaisseur de la chambre peut atteindre plusieurs millimètres.
   REMARQUE : Par exemple, le microscope confocal (voir la Table des matériaux) utilisé dans ce protocole est équipé de plusieurs étages (p. ex., circulaire, rectangulaire). L’étage choisi pour tenir la chambre n’est pas pertinent tant que ses paramètres correspondent à la taille de la chambre.
2. Travaillez avec un objectif avec une distance de travail suffisante, c’est-à-dire une distance de travail minimale ≥3 mm, car la région d’intérêt du cerveau peut être de quelques millimètres de profondeur et le couvercle peut ne pas être complètement droit car il a été placé manuellement.
   REMARQUE : À titre de démonstration, les résultats présentés à la figure 1, à la vidéo 1 et à la vidéo 2 ont été obtenus au microscope à deux photons à l’aide d’un objectif 16x à immersion dans l’eau avec une distance de travail de 3 mm et un grossissement de 2,4 pour obtenir un champ de vision de 652 x 483 μm et une pile z avec des intervalles de 0,937 μm entre les plans.
3. Effectuez une imagerie multizone, ce qui peut prendre quelques heures, voire quelques jours. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de stockage gratuit dans l’ordinateur car la taille de chaque image peut atteindre des dizaines de gigabits.
   REMARQUE: L’imagerie CLARITY peut entraîner beaucoup plus de sections d’image en profondeur. Par conséquent, les intensités utilisées pour capturer l’expression doivent être relativement faibles pour éviter la surexpression pendant la sommation de l’image.
4. Pour les objectifs d’immersion, vérifiez régulièrement le liquide pendant l’imagerie et complétez avec du liquide supplémentaire si nécessaire.
   REMARQUE: Lors de l’imagerie des données présentées dans la vidéo 3, de l’eau a été ajoutée à la surface de la chambre toutes les 6-8 heures pour lutter contre l’évaporation.
5. Une fois l’image acquise, visualisez-la et analysez-la à l’aide de plusieurs progiciels différents.
   REMARQUE: Le logiciel recommandé comprend Imaris et SyGlass pour la visualisation et l’analyse. Le pipeline précis pour la reconstruction optimisée des astrocytes à l’aide du logiciel Imaris a été décrit précédemment⁹. En bref, les caractéristiques d’Imaris utilisées dans cette étude étaient des filaments pour reconstruire complètement les structures cellulaires et des taches pour extraire la position dans l’espace de tous les somata.

Résultats

Le nettoyage réussi des tranches épaisses de tissu cérébral entraîne une nouvelle gamme de questions qui peuvent être posées concernant les propriétés des grandes populations cellulaires par opposition aux propriétés des cellules individuelles ou des groupes de cellules voisines. Pour obtenir des résultats positifs, il faut respecter strictement le protocole CLARITY, car il existe un large éventail de paramètres qui doivent être pris en compte pour réduire la variance entre les échantillons (par exemple, pourcentage de c...

Discussion

Les méthodes de nettoyage des tissus présentent un outil révolutionnaire dans la recherche sur le cerveau, invitant à des questions qui n’auraient pas pu être posées auparavant. En ciblant les propriétés d’un petit groupe de cellules, d’une seule cellule ou même d’une seule synapse, CLARITY permet désormais de cibler des populations cellulaires totales ou des caractéristiques de connectivité à longue portée en utilisant des fluorophores pertinents.

Le résultat de l’expression du fluorophore et...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AAV1-GFAP ::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vecteur viral utilisé pour détecter les astrocytes
AAV5-CaMKII ::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vecteur viral utilisé pour détecter les neurones
AAV5-CaMKII ::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vecteur viral utilisé pour détecter les noyaux neuronaux
AAV5-CaMKII ::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		vecteur viral utilisé pour détecter les neurones
Acrylamide (40 %)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2 %)	Bio-rad	#161-0142
Acide borique	Sigma	#B7901	Poids moléculaire - 61,83 g/mol
Microscope confocal, balayage, FV1000	Objectif Olympus		4x (UPlanSApo, 0,16 NA)
Logiciel	ImarisBitplane, Royaume-Uni		Un logiciel qui permet l’analyse 3D d’images
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4 %	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
Logiciel			Un logiciel qui permet l’analyse 3D d’images à l’aide de la réalité virtuelle
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Poids moléculaire - 121,14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Microscope à deux photons	Neurolabware		Laser Ti :saphir (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubes photomultiplicateurs GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtre passe-bande (Semrock), objectif 16x immersion dans l’eau (Nikon, 0,8 NA)  ;
VA-044 Initiateur	Wako	#011-19365