Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution

Summary

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Abstract

Le dysfonctionnement mitochondrial dans les nerfs périphériques accompagne plusieurs maladies associées à la neuropathie périphérique, qui peuvent être déclenchées par de multiples causes, notamment les maladies auto-immunes, le diabète, les infections, les troubles héréditaires et les tumeurs. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques de la souris peut être difficile en raison de la petite taille de l’échantillon, d’un nombre limité de mitochondries présentes dans le tissu et de la présence d’une gaine de myéline. La technique décrite dans ce travail minimise ces défis en utilisant un protocole de perméabilisation unique adapté de celui utilisé pour les fibres musculaires, pour évaluer la fonction mitochondriale du nerf sciatique au lieu d’isoler les mitochondries du tissu. En mesurant la production d’espèces réactives fluorimétriques avec Amplex Red/Peroxyidase et en comparant différents substrats mitochondriaux et inhibiteurs dans les nerfs perméabilisés par la saponine, il a été possible de détecter simultanément les états respiratoires mitochondriaux, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’activité des complexes mitochondriaux. Par conséquent, la méthode présentée ici offre des avantages par rapport à l’évaluation de la fonction mitochondriale par d’autres techniques.

Introduction

Les mitochondries sont essentielles au maintien de la viabilité cellulaire et remplissent de nombreuses fonctions cellulaires telles que le métabolisme énergétique (voies de métabolisme du glucose, des acides aminés, des lipides et des nucléotides). En tant que site principal de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), les mitochondries sont au centre de plusieurs processus de signalisation cellulaire tels que l’apoptose et participent à la synthèse des amas fer-soufre (Fe-S), à l’importation et à la maturation des protéines mitochondriales et au maintien de leur génome et de leurs ribosomes ^1,2,3

Protocol

Le présent protocole est approuvé par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux dans la recherche, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) et les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le nerf sciatique est isolé de souris mâles C57BL/6 âgées de quatre mois, euthanasiées par luxation cervicale conformément aux directives institutionnelles. Les étapes du protocole sont optimisées pour éviter la détérioration mitochondriale. Par conséquent, dans ce protocole, l’étalonnage des capteurs d’oxygène polarographiques a été effectué avant la dissection et la perméabilisation du tissu nerveux sciatique de souris.

Results

La consommation mitochondriale d’oxygène par le nerf sciatique perméabilisé est représentée à la figure 2. La trace rouge représente le flux_d’O2 par unité de masse en pmol/s.mg. Après avoir enregistré une consommation basale d’oxygène avec des substrats endogènes (respiration de routine), du succinate (SUCC) est injecté pour enregistrer la respiration entraînée par le complexe II (succinate déshydrogénase), ce qui entraîne une augmentation du taux de consommation d’oxygène. En séq.......

Discussion

Plusieurs maladies ou affections accompagnant les neuropathies ont un dysfonctionnement mitochondrial comme facteur de risque. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques est essentielle pour élucider comment les mitochondries agissent dans ces conditions neurodégénératives. L’évaluation de la fonction mitochondriale est laborieuse en raison de la difficulté de la méthode d’isolement et de la rareté du matériel. Ainsi, le développement de techniques de perméabilisation tissulaire qui ne nécess.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adénosine 5' triphosphate disdisodique hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Adénosine 5&prime ;-diphosphate sel sodique	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Réactif	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red est préparé dans du DMSO conformément à la fiche technique du produit
Antimycine A (de Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7030	choc thermique, sans protéase, sans acides gras, essentiellement sans globuline, pH 7, &ge ; 98 %
Carbonate	de calcium Sigma-Aldrich	C6763
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C7752	(du cœur équin ; petite hémiprotéine)
DataLab version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Autriche		Copyright (c) 2002 - 13 par Dr. Erich Gnaiger
Agitateur orbital numérique 120V	Thermo Fisher scientific	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sel de sodium	Sigma-Aldrich	E8145
Seringue Hamilton	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL et 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogène solution de peroxyde 30 % p/p	Merck	H1009
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
L-(&minus ;)-Acide malique	Sigma-Aldrich	M7397
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma-Aldrich	M2393
MES sel de sodium	Sigma-Aldrich	M3885
Micro-pince à dissection, courbe	Sigma-Aldrich	F4142
Pince à micro-dissectionnement, droite	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Jeu de filtres Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, Autriche	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) Fluorométrie O2k : production de HRR et de H2O2 dans les mitochondries cérébrales de souris. Réseau physiologique mitochondr 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - composant du module Capteur de fluorescence Vert	OROBOROS INSTRUMENTS, Autriche	44210-01
Oligomycine	Sigma-Aldrich	O4876	(à partir de Streptomyces diastatochromogenes ; mélange d’oligomycines A, B et C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Autriche	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxydase de raifort	Sigma-Aldrich	P8375
Boîtes de Pétri, polystyrène	MERCK	P5606
Phosphocréatine disodium hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Dihydrogénophosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	PHR1330
hydroxyde de potassium	Sigma-Aldrich	221473
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saponine	Sigma-Aldrich	SAE0073
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	P5280
Succinate de sodium dibasique hexahydraté	Sigma-Aldrich	S2378
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625