Article de méthode

Étude des effets atténuants de l’administration de Bacillus cereus sur la colite par la modulation du microbiote intestinal

DOI :

10.3791/63707

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27 juillet 2022

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1School of Life Sciences, Anhui University, 2Key Laboratory of Human Microenvironment and Precision Medicine of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University, 3Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, 4Institute of Physical Science and Information Technology, Anhui University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour établir le modèle murin de colite induite par le sulfate de dextran sans germes pseudo-germes induits par des antibiotiques afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans la régulation des effets positifs de Bacillus cereus sur la colite.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

On pense que la dysbiose du microbiote intestinal joue un rôle dans la progression de la colite. Cependant, les normes précises pour l’administration de probiotiques dans le soulagement de la colite restent indéfinies. La plupart des méthodes d’analyse reposent sur une diversité et une abondance limitées de micro-organismes intestinaux. Par conséquent, les études observationnelles ne peuvent pas établir de causalité. Dans cette étude, nous avons appliqué des souris pseudo-exemptes de germes induites par des antibiotiques pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la régulation des effets probiotiques de Bacillus cereus (B. cereus) sur la colite induite par le sulfate de dextran sodique (DSS) chez la souris. Ce processus permet d’évaluer l’effet régulateur bidirectionnel de la supplémentation en B. cereus sur la santé et fournit des résultats stables et reproductibles. Ici, les protocoles détaillés pour la culture de B. cereus , l’opération par gavage, la collecte des selles et le traitement de l’élimination des antibiotiques sur les souris colite sont fournis. Les méthodes d’optimisation sont également applicables à d’autres troubles inflammatoires chroniques associés. Les résultats ont montré que l’administration de B. cereus diminuait la perte de poids corporel, le raccourcissement de la longueur du côlon, l’indice d’activité de la maladie et les scores histopathologiques. Cependant, le traitement aux antibiotiques a supprimé l’effet positif de B. cereus sur la colite. Ces résultats indiquent que le microbiote intestinal est nécessaire pour atténuer les effets de B. cereus sur la colite. Par conséquent, l’exploration des effets bénéfiques des probiotiques dans cette recherche est une approche prometteuse pour développer de nouvelles stratégies de traitement visant à atténuer les symptômes des troubles inflammatoires chroniques.

Introduction

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Les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) sont des troubles inflammatoires gastro-intestinaux chroniques courants, notamment la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse (CU)1. Les voies thérapeutiques actuelles pour la colite inflammatoire sont les 5-aminosalicylates, les corticostéroïdes, l’azathioprine et les antibiotiques2. De plus, ces médicaments ont des effets secondaires considérables3. Par conséquent, nous devrions accorder plus d’attention à l’effet des probiotiques sur le traitement de la colite.

Les approches thérapeutiques alternatives comprennent l’administration de probiotiques, qui a été utilisée dans des modèles animaux et des essais cliniques. Des études antérieures ont indiqué que l’administration de différents probiotiques, tels que Bacillus cereus ou Bifidobacterium infantis, pourrait soulager la colite 4,5. Dans les études précliniques, l’efficacité et l’innocuité des probiotiques doivent être étudiées dans des modèles animaux.

Les modèles murins de colite au sulfate de dextran sodique (DSS) peuvent aider à explorer les mécanismes de la colite et à évaluer les effets positifs des probiotiques. L’induction du DSS entraîne des érosions de la muqueuse intestinale, un dysfonctionnement de la barrière intestinale et une augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale6. La plupart des modèles murins de probiotiques ont principalement mis en évidence des effets biologiques. Cependant, le mécanisme derrière l’administration de ce probiotique est difficile à explorer, étant donné la limite de la vérification supplémentaire de la relation causale entre les probiotiques et le soulagement de la colite. Il est donc nécessaire de développer une méthode standardisée pour étudier le mécanisme des probiotiques.

Traditionnellement, ces études nécessitent l’inoculation de certains probiotiques chez des souris exemptes de germes7. Cependant, il existe certaines limites de laboratoire à l’utilisation de souris sans germes comme récepteurs pour les probiotiques, telles que la faible capacité immunitaire et les installations sans germes coûteuses8. Afin d’éviter ces limitations, un modèle alternatif de colite induite par le DSS a été établi en utilisant des souris pseudo-exemptes de germes. Le modèle de souris pseudo-exempte de germes a été établi par l’application d’antibiotiques comme décrit précédemment 9,10.

Dans cet article, nous établissons des souris pseudo-exemptes de germes avec un cocktail d’antibiotiques. Nous décrivons également en détail la méthodologie d’établissement et d’évaluation des modèles de colite chez la souris et étudions les effets des probiotiques sur l’atténuation des symptômes de la colite. Le protocole ci-dessous fournit également les méthodes d’administration des probiotiques par gavage.

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Protocole

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Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université d’Anhui, en Chine, et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université d’Anhui, en Chine (No. IACUC(AHU)-2020-014).

1. Administration d’antibiotiques

  1. Préparez un cocktail d’antibiotiques en dissolvant de l’ampicilline (1 g/L), du sulfate de néomycine (1 g/L), du métronidazole (0,5 g/L) et de la vancomycine (0,5 g/L) dans 1 L d’eau de boisson5.
  2. Après dissolution complète, conservez les solutions à 4 °C.
  3. Mettez les solutions de cocktail d’antibiotiques dans une bouteille d’eau. Placez la bouteille sur la cage de la souris.
    REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser des bouteilles brunes ou d’envelopper les bouteilles avec du papier d’aluminium pour protéger les solutions antibiotiques de la lumière.
  4. Remplacez le cocktail d’antibiotiques par des solutions fraîches 2 fois par semaine.
  5. Laissez les souris boire librement les solutions de cocktail d’antibiotiques pendant 4 semaines.

2. Préparation de l’eau potable DSS et induction de la colite

  1. Pour obtenir une solution de sulfate de dextran sodique (DSS) à 2,5 %, dissolvez 2,5 g de DSS dans 100 mL d’eau distillée11.
  2. Remplacer l’eau de boisson par la solution DSS à 2,5 % dans le groupe de souris modèles de colite. Assurez-vous que les souris du groupe de la colite n’ont pas accès à d’autres sources d’eau potable. Pendant ce temps, traitez les souris témoins avec de l’eau distillée sans DSS.
  3. Souris domestiques mâles C57BL/6J (poids corporel moyen, 20 g ± 2 g ; âgées de 7 semaines) dans des conditions exemptes d’agents pathogènes avec un accès libre à de la nourriture et à de l’eau standard.
    REMARQUE : Hébergez un total de cinq souris par cage dans des conditions exemptes d’agents pathogènes.
  4. Conception expérimentale
    REMARQUE : Les expériences sur les animaux ont été conçues en deux étapes. Cinq souris ont été incluses pour chaque groupe.
    1. Première étape : Pour évaluer l’effet positif de B. cereus sur le soulagement de la colite, répartissez au hasard les souris dans les trois groupes suivants : groupe témoin (contrôle), modèle de colite induite par le SSD (DSS), supplémentation en probiotiques B. cereus pour les souris induites par le DSS (B. cereus).
    2. Deuxième étape : Pour explorer le rôle du microbiote intestinal dans la régulation des effets probiotiques de B. cereus sur la colite induite par le DSS, répartissez au hasard les souris dans les trois groupes suivants : ABX (contrôle), ABX (DSS) et ABX (B. cereus + DSS).
      1. Traitez les souris du groupe ABX (contrôle) avec une solution saline physiologique.
      2. Après un traitement avec des solutions cocktail d’antibiotiques pendant 4 semaines, laissez les souris du groupe ABX (DSS) recevoir de l’eau contenant 2,5 % de DSS pendant 1 semaine et une solution saline physiologique normale pendant 2 semaines.
      3. Après le traitement avec des solutions cocktail d’antibiotiques et de l’eau DSS, traitez quotidiennement les souris du groupe ABX (B. cereus + DSS) avec B. cereus (2 x 108 cellules) dans 200 μL de solution saline physiologique à l’aide d’une canule intragastrique pendant 2 semaines.
  5. Après l’administration du cocktail d’antibiotiques, traitez immédiatement les souris mâles C57BL/6 avec une solution de DSS à 2,5 % dans l’eau de boisson pendant 7 jours.
  6. Enregistrez le poids corporel des souris avant l’intervention DSS comme poids de base.

3. Quantification de B. cereus

  1. Préparez huit tubes de microcentrifugation de 1,5 mL remplis de 900 μL de solution saline normale stérile.
  2. Pipeter 100 μL de B . cereus à croissance logarithmique et dissoudre dans 900 μL de solution saline normale stérile.
  3. Diluer en série B. cereus à l’aide de tubes.
  4. Déposer 40 μL de chaque dilution sur la plaque de gélose LB correspondante étiquetée avec le taux de dilution. Répétez l’opération 3 fois pour chaque taux de dilution.
  5. Cultivez les plaques dans un incubateur à température constante de 37 °C pendant 16 h.
  6. Sélectionnez les plaques avec ~20-70 colonies pour le comptage. Calculer la concentration bactérienne moyenne en fonction du multiple de dilution des plaques sélectionnées.

4. Préparation de B. cereus pour le gavage

  1. Après la quantification de B. cereus, prélever 1 mL de milieu B . cereus contenant 1 x 109 UFC et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min. Ensuite, lavez les cellules bactériennes 2 fois avec de l’eau stérile par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min et retirez le surnageant.
  2. Diluer le concentré de B. cereus avec une solution saline normale stérile jusqu’à une concentration finale de 2 x 108 UFC/200 μL4.
  3. Pipetez la dilution de haut en bas à plusieurs reprises pour obtenir une suspension dispersée de B. cereus .
  4. Effectuer la quantification de la concentration de B. cereus par la technique de comptage sur plaque avant de terminer la méthode par gavage.

5. Application de suppléments de B. cereus par gavage

  1. Administrer les interventions (2 x 10 probiotiquesde 8 UFC dans 200 μL de solution saline normale) aux souris par gavage oral à une heure fixe.
  2. Pour administrer B. cereus, connectez une aiguille à gavage (taille de l’aiguille d’alimentation : 20 G, 38 mm) à une seringue de 1 ml. Essuyez l’extérieur de l’aiguille de gavage avec de l’éthanol à 70 % entre les souris et maintenez l’application de la dose appropriée.
  3. Pour retenir les souris, prenez-les par la queue et saisissez fermement la peau lâche du dos avec l’extrémité de la queue fixée entre les deux derniers doigts du maître.
  4. Gardez les souris en position verticale. Ensuite, insérez l’aiguille à gavage avec précaution et douceur dans la bouche jusqu’à l’œsophage. Si aucune résistance n’est rencontrée dans cette étape, enfoncez doucement l’aiguille dans l’estomac.
    REMARQUE : Confirmez la respiration régulière et sans entrave des souris avant l’administration du médicament.
  5. Faites avancer lentement l’aiguille et administrez la solution de B. cereus . Retirez doucement l’aiguille une fois le gavage terminé. Relâchez la souris et remettez-la dans sa cage.

6. Détermination de l’indice d’activité de la maladie

REMARQUE : L’indice d’activité de la maladie (DAI) a été calculé quotidiennement en fonction de la perte de poids corporel des souris, du sang occulte fécal et de la consistance des selles.

  1. Mesurez quotidiennement le poids corporel des souris. Attribuez un score de 0 à 4 à chaque souris en fonction du pourcentage de perte de poids corporel (0 : 0 %, 1 : 1 %-5 %, 2 : 6 %-10 %, 3 : 11 %-18 % et 4 : >18 %).
  2. Prélevez des échantillons de selles fraîches de chaque souris. Utilisez un coton-tige pour stimuler la contraction de l’anus afin de favoriser la défécation. Ensuite, prélevez les échantillons de matières fécales immédiatement après la défécation dans un tube à centrifuger stérilisé.
  3. Déterminez le sang occulte fécal à l’aide d’un papier réactif de sang occulte dans les selles. Prélever 10 mg d’échantillon de selles sur un bâtonnet applicateur.
  4. Placez l’échantillon sur la carte de test et appliquez une fine tache sur la carte. Ouvrez le rabat arrière et appliquez du révélateur sur le frottis.
  5. Ensuite, notez le sang occulte à l’aide d’un papier de test de sang occulte dans les selles dans les 120 s.
    REMARQUE : Toute trace de bleu sur ou sur le bord du frottis est positive pour le sang occulte. Les scores occultes fécaux étaient les suivants : 0 : Aucun, 1 : Hémobscurisme positif, 2 : Léger, 3 : Traces de sang dans les selles et 4 : Saignement grossier.
  6. Identifier la consistance des selles en détectant l’échantillon de selles11. Attribuez un score de 0 à 4 (0 : Normal, 1 : Selles molles, 2 : Selles semi-formées, 3 : Selles liquides et 4 : Diarrhée).

7. Prélèvement de tissus

  1. Anesthésier les souris en injectant 10 % d’hydrate de chloral (10 mg/kg) à la fin de la première et de la deuxième étape de l’expérience. Évaluer la profondeur de l’anesthésie chez la souris par le réflexe de retrait par pincement.
  2. Ensuite, euthanasiez les souris par luxation cervicale.
  3. Fixez les souris en décubitus dorsal sur la table d’opération et ouvrez la cavité péritonéale.
  4. Séparez chirurgicalement tout le côlon et mesurez la longueur à l’aide d’une règle.
  5. Ensuite, lavez doucement le côlon à l’aide d’une seringue de 5 ml remplie de PBS prérefroidi.

8. Évaluation des lésions histologiques

  1. Coupez le tissu du côlon en petits fragments, fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4 % et intégrez-les dans de la paraffine à l’aide d’une machine à enrober les tissus.
  2. Ensuite, sectionnez les tissus inclus dans la paraffine avec un microtome pour préparer des coupes de tissu colique de 4 μm d’épaisseur. Déparaffinez et déshydratez les sections du côlon. Ensuite, colorez les sections du côlon avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E).
    REMARQUE : Les échantillons de côlon coloré sont évalués par l’investigateur à l’aide d’un système pour les mesures suivantes : degré d’infiltration des cellules inflammatoires (Aucun : 0, Léger : 1, Modéré : 2, Sévère : 3), lésions de la muqueuse (Aucune : 0, Couche muqueuse : 1, Sous-muqueuse : 2, Musculeuse et séreuse : 3), Dommages de la crypte (Aucun : 0, 1/3 : 1, 2/3 : 2, entier : 3, entier + perte d’épithélium : 4), l’étendue des lésions ( %) (0 % : 0, 1 % à 25 % : 1, 26 % à 50 % : 2, 51 % à 75 % : 3, 76 % à 100 % : 4). Le score total des lésions histologiques est calculé pour chaque score individuel des mesures ci-dessus5.
  3. Laissez deux expérimentateurs indépendants évaluer (en aveugle) les scores histologiques de l’échantillon au microscope optique.

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Résultats

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Supplémentation en B. cereus et colite
Le modèle expérimental de colite aiguë a été induit par l’intervention du SSD dans l’eau potable. La figure 1A montre le protocole expérimental d’administration de B. cereus à un modèle murin de colite. L’induction du DSS a manifestement diminué le poids corporel (Figure 1B) et la longueur du côlon. L’effet apaisant de B. cereus par gavage oral a été étudié sur des souris modèl...

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Discussion

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Afin d’utiliser les probiotiques dans les études cliniques, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des probiotiques dans des modèles animaux. Les protocoles fournis ont été préalablement optimisés pour l’évaluation de la gravité de la colite. Les souris traitées avec le DSS sont un modèle d’inflammation intestinale, qui imite les caractéristiques cliniques et histologiques caractéristiques de la colite ulcéreuse12. Les souris modèles de colite aig...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été financée au moins en partie par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (K.S., subvention n° 32000081), la Fondation des sciences naturelles de la province d’Anhui (K.S., subvention n° 1908085QC120), le programme de projet ouvert du Laboratoire clé d’État des sciences et technologies alimentaires, Université de Jiangnan (K.S., subvention n° SKLF-KF-201920), la Fondation des sciences naturelles des établissements d’enseignement supérieur de l’Anhui de Chine (K.S., subvention N° KJ2019A0040), la Fondation pour la recherche scientifique doctorale de l’Université d’Anhui (K.S., subvention n° J01003316), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Y.W., subvention n° 31770066, 31470218), le Fonds ouvert pour la construction de disciplines, Institut des sciences physiques et des technologies de l’information de l’Université d’Anhui (Y.W.), et le Programme des talents exceptionnels de l’Université d’Anhui, Chine (Y.W.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,01 M PBS (poudre, pH 7,2&ndash ; 7.4)SolarbioP1010-2L
Alcool éthylique absoluHushi64-17-5
Solution de différenciation fsat alcool acideBeyotimeN°C0163S
Agar-agarSangon Biotech9002-18-0
AmpicillineSolarbio69-53-4Magasin à 2&ndash ; 8 ° ; C
Incubateur anaérobieLong YueLA1-3T
Sulfate de dextran sel de sodium coliteMP Biomédical160110
Incubateur électrothermiqueSANFAHP-050A
Fixateur de tissus à usage généralBiosharpRéf. BL539A
GlycérinumHushi56-81-5
Kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosineBeyotimeN°C0105
Support de montage de KisserBeyotimeN°C0181
MétronidazoleSolarbio443-48-1Magasin à 2&ndash ; 8 ° ; C
Sulfate de néomyéineSolarbio1405-10-3Magasin à 2&ndash ; 8 ° ; C
Incubateur oscillantShanghai ZhichuZQLY-180S
Chlorure de sodiumSangon Biotech7647-14-5
Papier de test de sang occulte dans les sellesBasoBA2020B
TryptoneOXOÏDE2285856
VancomycineSolarbio1404-93-9Magasin à 2&ndash ; 8 ° ; C
XylèneHushi1330-20-7
Extrait de levureSangon Biotech8013-01-2

Références

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Mots-clés

Mod le de colitesuppl mentation en probiotiquescolite induite par le DSStraitement antibiotiqueadministration par gavagesang occulte dans les selleshistopathologie du c lontroubles inflammatoires

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