Voici une description de l’isolement simple et relativement rapide de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans à partir d’un ou de quelques animaux à l’aide d’un kit de tissus disponible dans le commerce. La préparation d’ADNg qui en résulte est un modèle approprié pour la PCR.
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Article de méthode
Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’extraction génomique de l’ADN à partir d’un ou de quelques Caenorhabditis elegans a de nombreuses applications en aval, y compris la PCR pour les lignées de génotypage, le clonage et le séquençage. Les méthodes traditionnelles à base de protéinase K pour l’extraction de l’ADN génomique de C. elegans prennent plusieurs heures. Les kits d’extraction commerciaux qui ouvrent efficacement la cuticule de C. elegans et extraient l’ADN génomique sont limités. Une méthode facile, plus rapide (~ 15 min) et rentable d’extraction de l’ADN génomique de C. elegans qui fonctionne bien pour les applications en classe et en recherche est rapportée ici. Cette méthode d’extraction de l’ADN est optimisée pour utiliser un ou quelques nématodes larvaires tardifs (L4) ou adultes comme matériau de départ pour obtenir un modèle fiable pour effectuer la PCR. Les résultats indiquent que la qualité de l’ADN convient à l’amplification de cibles génétiques de différentes tailles par PCR, permettant le génotypage d’un ou de quelques animaux, même à des dilutions à un cinquantième de l’ADN génomique d’un seul adulte par réaction. Les protocoles signalés peuvent être utilisés de manière fiable pour produire rapidement un modèle d’ADN à partir d’un seul ou d’un petit échantillon de C. elegans pour des applications basées sur la PCR.
Introduction
Ici, deux protocoles connexes sont présentés pour la lyse de Caenorhabditis elegans afin de rendre l’ADN accessible pour les applications basées sur la PCR. La PCR est une technique moléculaire couramment utilisée pour de nombreuses applications, y compris le génotypage et l’amplification de fragments d’ADN pour le clonage et le séquençage, entre autres. Le petit ver rond (1 mm) vivant librement C. elegans est un système animal populaire pour la recherche biologique. L’obtention d’ADN génomique approprié à partir d’un seul animal ou de quelques animaux est suffisante pour amplifier la séquence par PCR. Les larves et les adultes de la fin de la L4 ne contiennent que ~1 000 cellules somatiques (y compris certaines cellules polyploïdes multinucléaires), des cellules germinales et (si l’animal est un hermaphrodite gravide) une progéniture in utero1. Cependant, ces animaux sont protégés par une cuticule qui doit être perturbée pour extraire l’ADN génomique2. Les méthodes standard pour préparer un modèle d’ADN génomique de nématode pour la PCR impliquent plusieurs étapes et prennent plusieurs heures. Les animaux sont d’abord congelés dans un tampon de lyse de ver contenant de la protéinase K (−70 °C ou moins) pendant au moins 15 à 45 min (plus longtemps est recommandé par certains protocoles)3,4,5,6. Cette étape ouvre les animaux.
Après congélation, les animaux sont incubés pendant 1 h à 60-65 °C pour que la protéinase K fonctionne, puis l’enzyme est inactivée pendant 15-30 min à 95 °C. La protéinase K détruit les nucléases qui dégradent l’ADN. L’inactivation de la protéinase K avant la PCR est importante pour empêcher la protéinase K de dégrader l’ADN polymérase. Les deux protocoles basés sur des kits décrits ici sont des méthodes rapides, fiables et rentables pour extraire l’ADN génomique d’un seul animal ou de quelques nématodes pour la recherche quotidienne et l’enseignement des applications de laboratoire. Le kit utilisé a été optimisé à l’origine par le fabricant pour extraire l’ADN des tissus animaux, de la salive et des cheveux7. Il utilise une solution exclusive de préparation tissulaire et une solution d’extraction pour lyser les cellules et rendre l’ADN génomique accessible. Une solution de neutralisation exclusive neutralise ensuite les composants qui peuvent inhiber la PCR (par exemple, les sels, les ions et les molécules de liaison Mg2+).
Lors du génotypage, un seul animal peut être testé. Pour déterminer si une souche est homozygote, le fait de tester six descendants ou plus d’un seul animal donne une grande confiance qu’une lignée est homozygote ou non (il y a 0,02 % de chances de choisir au hasard six descendants mutants homozygotes d’un parent hétérozygote [(1/4)6 × 100 % = 0,02 %]). Cette méthode 1) est simple, avec moins d’étapes que la méthode de la protéinase K, et 2) réduit le temps de préparation du gabarit à 15 min. Les résultats de ce travail démontrent que le protocole développé fonctionne de manière robuste dans l’extraction de l’ADN génomique d’un ou de quelques vers, qui peut être utilisé de manière fiable pour des applications en aval qui ne nécessitent pas d’ADN hautement purifié, y compris la PCR.
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Protocole
1. Entretien de C. elegans
REMARQUE : Les souches N2 (type sauvage) et blmp-1(tm548) de C. elegans ont été maintenues sur des plaques de milieux de croissance de nématodes (NGM) standard à 20 °C.
- Préparer les plaques de NGM en dissolvant 23,005 g de poudre de NGM dans 973 mL d’eau dans une fiole de 2 L. Couvrez l’ouverture du ballon avec du papier d’aluminium (ou un capuchon autoclavable qui permet la ventilation) et fixez le revêtement avec du ruban adhésif autoclave. Autoclave pour dissoudre la poudre et stériliser le contenu avec un cycle de stérilisation d’au moins 30 min.
- Refroidir le milieu à 60 °C au bain-marie.
- Au milieu refroidi, ajouter 25 mL de tampon stérile de phosphate 1 M (KH2PO4), pH 6,0; 1 mL de solution de chlorure de calcium 1 M; et 1 mL de solution de sulfate de magnésium 1 M.
- Remuer le milieu sur une plaque magnétique pour obtenir un mélange homogène et éviter un refroidissement et une solidification inégaux (~5 min). Assurez-vous que la barre d’agitation tourne assez vite pour créer un vortex, mais pas si vite que des bulles sont introduites (~ 250-300 tr / min).
- Versez ~25 mL du milieu dans chaque plaque de Petri de 10 cm (~40 plaques au total). Sécher les plaques à température ambiante pendant la nuit (généralement 16-25 °C).
- Cultivez une colonie d’Escherichia coli OP50 dans 30 à 50 mL de bouillon LB pendant la nuit à 37 °C.
- Ensemencez chaque plaque avec 500 μL de culture d’E. coli OP50 et laissez-les sécher à température ambiante avant utilisation (généralement 16-25 °C)8. Conserver les plaques à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
- Transférer C. elegans sur des plaques ensemencées à l’aide d’un pic à fil ou d’une autre méthode et les laisser grandir jusqu’au stade L4 ou adulte à la température requise pour la souche (généralement 16-25 °C, 1-2 jours si les animaux étaient plaqués affamés comme dauers, 3-4 jours si les animaux étaient plaqués comme embryons)8.
2. Extraction de l’ADN d’un seul ver
REMARQUE: Cette méthode est utile pour extraire l’ADN d’un seul ver (un ver dans 1,8 μL de volume total). Un mélange maître peut être fait si plusieurs vers sont lysés en même temps.
- Programmer un thermocycleur pour un cycle à 55 °C pendant 10 min suivi de 95 °C pendant 3 min (programme de lyse).
- Aliquote 0,8 μL de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 mL sur glace. Ajouter 0,2 μL de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de la solution d’extraction. Mélanger par pipetage.
- Identifier un animal L4 ou adulte sous un microscope à dissection9. Pour identifier les hermaphrodites L4, recherchez une vulve caractéristique visible sous la forme d’un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Identifiez les hermaphrodites adultes en recherchant les plus gros animaux sur la plaque qui peuvent avoir des embryons ovales visibles dans leur utérus.
- À l’aide d’un pic à fil de platine, transférez l’animal sélectionné dans la solution10.
- Centrifugez brièvement le tube (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g) à température ambiante pour en recueillir le contenu au fond du tube.
- Placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini à l’étape 2.1.
- Lorsque le programme est terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajouter 0,8 μL de la solution de neutralisation du kit au mélange. Mélanger par pipetage.
- Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).
- Utilisez directement le lysat pour la PCR ou stockez-le à 4 °C ou −20 °C pour une utilisation future.
REMARQUE: L’ADN extrait est stable à 4 °C ou −20 °C pendant au moins 6 mois7.
3. Extraction de l’ADN de quelques individus
REMARQUE: Cette méthode est utile pour extraire l’ADN de quelques vers. Un mélange maître peut être préparé si plusieurs souches sont lysées en même temps.
- Programmer le thermocycleur pour un cycle à 55 °C pendant 10 min suivi de 95 °C pendant 3 min (programme de lyse).
- Aliquote 2,0 μL de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 mL sur glace. Ajouter 0,5 μL de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de la solution d’extraction. Mélanger par pipetage.
- Identifier L4 ou les animaux adultes sous un microscope à dissection9. Les hermaphrodites L4 ont une vulve caractéristique qui est visible comme un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Les hermaphrodites adultes sont les plus gros animaux de la plaque et peuvent avoir des embryons ovales visibles dans leur utérus.
- À l’aide d’un pic de fil de platine, transférez quelques animaux dans la solution : 9 animaux produisent 1 équivalent animal d’ADN génomique pour 0,5 μL de lysat, et 16 animaux produisent environ 1 équivalent animal d’ADN génomique dans 0,25 μL (3,5 nématodes/μL)10.
REMARQUE: Il est difficile de transférer plus de 16 animaux dans ce volume. - Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).
- Placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini à l’étape 3.1.
- Lorsque le programme est terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajouter 2 μL de la solution de neutralisation du kit au mélange. Mélanger par pipetage.
- Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).
- Utilisez directement la lyse pour la PCR ou stockez-la à 4 °C ou −20 °C pour une utilisation future.
REMARQUE: L’ADN extrait est stable à 4 °C ou −20 °C pendant au moins 6 mois7.
4. Réaction PCR
REMARQUE: Une application en aval de cette technique de lyse par ver, détectant une mutation de délétion à l’aide d’une polymérase rapide, est décrite. L’efficacité des deux protocoles de lyse des vers dans la production d’ADN modèle génomique pour une PCR réussie à des dilutions à 1/50ème d’un ver par réaction est également démontrée.
- Extraire l’ADN d’un seul ver et de 16 vers à l’aide de N2 de type sauvage et de souches mutantes, comme décrit ci-dessus aux étapes 2 et 3.
- Préparer des dilutions 2, 10, 20 et 50 fois de l’ADN d’un seul ver provenant d’animaux N2 de type sauvage.
- Mettre en place des réactions pcR suivant le protocole du fabricant à l’aide d’amorces spécifiques à la séquence d’intérêt et d’un mélange maître de PCR à démarrage à chaud (tableau 1 et tableau 2). Utilisez 1 μL d’ADN non dilué ou 2 μL d’ADN dilué comme modèle dans chaque réaction.
- Confirmer les produits pcrifiques par électrophorèse sur gel et imagerie11.
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Résultats
L’ADN génomique d’un ou de quelques adultes de type sauvage a été extrait à l’aide du kit commercial ou du protocole de lyse traditionnel pour comparer l’efficacité de ces deux méthodes. Ces lysats ont ensuite été utilisés comme modèles pour la PCR afin d’amplifier soit une cible plus grande d’environ 2 100 pb (codage blmp-1), soit une cible plus petite d’environ 500 pb (codant une partie de sma-10). Les deux méthodes ont permis d’obtenir des produits de PCR appropriés (figure 1A
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Discussion
Déterminer les génotypes de C. elegans est une étape importante lors de la réalisation de croisements génétiques pour créer de nouvelles souches de C. elegans . L’extraction génomique de l’ADN à l’aide d’un seul ou de quelques C. elegans est une étape cruciale dans le génotypage de C. elegans. Ce protocole décrit l’extraction d’ADN génomique de C. elegans à l’aide d’un kit commercial. Cette méthode est rapide et fonctionne de manière robuste. L’ADN génomique extrait à l’aide d...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
La souche N2 et la bactérie E. coli OP50 ont été obtenues auprès du Caenorhabditis Genetics Center (CGC), financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). La souche blmp-1(tm548) a été obtenue à partir du National Bioresource Project, au Japon. Les auteurs remercient WormBase. Ce travail a été soutenu par NIH R01GM097591 à T.L.G., un financement interne par la Texas Woman’s University à T.L.G, et le Centre de recherche étudiante de TWU à M.F.L.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ruban d’autoclave | Defend | 43237-2 | |
| feuille d’aluminium, | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Kit Extract-N-Amp (comprend une solution de préparation des tissus, une solution d’extraction et une solution de neutralisation) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp plaque chauffante/agitateur | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB média, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| sulfate de magnésium, pur à 97 %, anhydre | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifugeuse | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U ADN polymérase haute fidélité à démarrage à chaud | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E » utilisé dans la figure supplémentaire S1, une polymérase haute vitesse et haute fidélité (20&ndash ; 30 s/kb) |
| NGM poudre de milieu | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D » dans la figure 1B, une polymérase haute vitesse et haute fidélité (15&ndash ; 30 s/kb) |
| amorces Technologies | d’ADN intégrées | Oligos d’ADN | |
| PrimeSTAR GXL polymérase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C » dans la figure 1B, une polymérase haute fidélité (1 min/kb) pour les matrices riches en GC et les modèles jusqu’à 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1&ndash ; 10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A » sur la figure 1B, polymérase utilisée sur la figure 1A, C, D, une polymérase à grande vitesse (10 s/kb) pour des cibles jusqu’à 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq Mélange réactionnel PCR | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B » sur la figure 1B, une polymérase (1 min/kb) pour des cibles jusqu’à 7 kb |
| Thermocycleur SimpliAmp | Applied Biosystems | A24812 | |
| barre d’agitation | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| mélangeur vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| pic à vis Genesee | Scientific Corporation | 59-AWP |
Références
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Réimpressions et autorisations
