Une stratégie d’enrichissement spin-tip pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides des tissus pancréatiques humains

Résumé

Les modifications post-traductionnelles (PTM) modifient les structures et les fonctions des protéines. Les méthodes d’enrichissement simultané de plusieurs types de PTM peuvent maximiser la couverture dans les analyses. Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie d’affinité métallique immobilisée Ti(IV) double fonctionnelle suivie d’une spectrométrie de masse pour l’enrichissement et l’analyse simultanés de la protéine N-glycosylation et de la phosphorylation dans les tissus pancréatiques.

Résumé

La spectrométrie de masse peut fournir une couverture profonde des modifications post-traductionnelles (PTM), bien que l’enrichissement de ces modifications à partir de matrices biologiques complexes soit souvent nécessaire en raison de leur faible stœchiométrie par rapport aux analytes non modifiés. La plupart des flux de travail d’enrichissement des PTM sur les peptides dans les flux de travail protéomique ascendants, où les protéines sont digérées enzymatiquement avant que les peptides résultants ne soient analysés, n’enrichissent qu’un seul type de modification. C’est l’ensemble du complément des PTM, cependant, qui conduit à des fonctions biologiques, et l’enrichissement d’un seul type de PTM peut manquer une telle diaphonie des PTM. La diaphonie PTM a été observée entre la glycosylation des protéines et la phosphorylation, les deux PTM les plus courants dans les protéines humaines et aussi les deux PTM les plus étudiés en utilisant des flux de travail de spectrométrie de masse. En utilisant la stratégie d’enrichissement simultané décrite ici, les deux PTM sont enrichis à partir de tissu pancréatique humain post-mortem, une matrice biologique complexe. La chromatographie d’affinité métallique immobilisée Ti(IV) à double fonction est utilisée pour séparer simultanément diverses formes de glycosylation et de phosphorylation en plusieurs fractions dans une méthode pratique basée sur la pointe de spin, permettant des analyses en aval des interactions potentielles de diaphonie PTM. Ce flux de travail d’enrichissement pour les glyco- et phosphopeptides peut être appliqué à différents types d’échantillons afin d’obtenir un profilage en profondeur de plusieurs PTM et d’identifier des molécules cibles potentielles pour de futures études.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles des protéines (PTM) jouent un rôle majeur dans la modulation des structures protéiques et, par conséquent, de leurs fonctions et des processus biologiques en aval. La diversité du protéome humain augmente de façon exponentielle en raison de la variabilité combinatoire offerte par divers PTM. Différentes variantes de protéines de leurs séquences canoniques prédites par le génome sont connues sous le nom de protéoformes, et de nombreux protéoformes proviennent de PTM¹. L’étude de la diversité protéiforme en matière de santé et de maladie est devenue un domaine de recherche d’un grand....

Protocole

Le consentement a été obtenu pour l’utilisation de tissus pancréatiques à des fins de recherche auprès du plus proche parent du défunt et une autorisation du Conseil d’examen institutionnel des sciences de la santé de l’Université du Wisconsin-Madison a été obtenue. La surveillance de la CISR n’est pas requise parce qu’elle ne concerne pas de sujets humains, tel que reconnu par le 45 CFR 46.102(f).

ATTENTION : Des précautions doivent être prises lors de la manipulation des réactifs utilisés dans ce protocole, qui comprennent les acides (formique, acétique, trifluoroacétique), les bases (hydroxyde d’ammonium) et les cryogènes (azote liquide)....

Résultats

Des données représentatives de spectrométrie de masse, y compris des fichiers bruts et des résultats de recherche, ont été déposées au ProteomeXchange Consortium via le référentiel partenaire PRIDE avec l’identificateur de jeu de données PXD033065²².

Dans ce travail, des répliques d’injection en double ont été analysées pour chaque élution d’enrichissement. Les identifications effectuées à partir des deux répliques techniques ont été rassemblées en dernière ana.......

Discussion

La stratégie Ti(IV)-IMAC à double fonction est utile pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides du même échantillon dans un seul flux de travail de préparation d’échantillon. Il a également été démontré que les méthodes basées sur ERLIC permettent d’enrichir simultanément les PTM. Les deux stratégies ont déjà été utilisées pour une couverture approfondie dans les analyses PTM^14,18. En adaptant la méthode dual Ti à la diminution du temps .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide acétique glacial (certifié ACS)	Fisher Scientific	A38S-500
Acétone (certifié ACS)	Fisher Scientific	A18-1
Acétonitrile de qualité Optima LC/MS	Fisher Scientific	A955-4
Acétate d’ammonium (cristallin/certifié ACS)	Fisher Scientific	A637-500
Hydroxyde d’ammonium (certifié ACS Plus)	Fisher Scientific	A669-212
Logiciel Byonic	Protein Metrics	n/a	Logiciel commercial utilisé pour l’analyse glycoprotéomique (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 Matériau BEH	Eaux	186002353	Matériau retiré de la colonne et utilisé pour emballer les nanocapillaires (tiré pour intégrer l’embout utilisé directement en ligne avec l’entrée de l’instrument)
CAE-Ti-IMAC, 100 %	J& K Scientific	2749380-1G	Matériau utilisé pour l’IMAC Ti(IV)-double fonction ; peut également être utilisé pour l’enrichissement conventionnel en IMAC/phosphopeptide conventionnel
Kit Cellcrusher	Cellcrusher	n/a	Utilisé pour broyer des échantillons de tissus en poudre avant extraction
Eppendorf 5424R Microcentrifugeuse	Fisher Scientific	05-401-205	Pour la centrifugation
à température contrôléecOmplete inhibiteur de protéase comprimés	cocktail Sigma	11697498001
DTT, qualité moléculaire (DL-Dithiothreitol)	Promega	V3151	Agent réducteur de protéines
Éthanol, 200 proof (100 %), USP	Fisher	22-032-601
Fisherbrand Mélangeur à vortex analogique	Fisher Scientific	02-215-414
Fisherbrand Tubes à microcentrifuger à faible rétention (1.5 mL)	Fisher Scientific	02-681-320
Fisherbrand Tubes de microcentrifugation à faible rétention (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	Pour la lyse d’échantillons par ultrasons
Acide formique, 99.0+ %, Optima LC/MS Grade	Fisher Scientific	A117-50
Capillaire en silice fondue (75 &mu ; m diamètre intérieur, 360 &mu ; m diamètre extérieur)	Polymicro Technologies LLC	100 m TSP075375	Pour colonnes tirées et garnies en interne avec émetteur intégré
Acide fluorhydrique (48 % en poids dans H2O)	Sigma-Aldrich	339261-100ML	Utilisé pour l’ouverture de l’émetteur de la colonne capillaire tirée
Iodoacétamide BioUltra	Sigma	I1149-5G	Réactif réducteur de protéines
Logiciel MaxQuant	n/a	n/a	Logiciel gratuit utilisé pour l’analyse phosphoprotéomique (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker avec chauffage et refroidissement	Benchmark Scientific	H5000-HC	Bloc chauffant
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent par cartouche, 30 µ ; m, 100/pqt	Waters	186000383	Dessalage à cartouche à plus grande échelle pour les digestions tryptiques (capacité de charge d’environ 1 mg chacune)
Pointes de pipette OMIX C18, 100 & micro ; Pointe en L, 10 - 100 &mu ; L volume d’élution, 1 x 96 pointes	Agilent	A57003100	Pointe de pipette à garnissage à plus petite échelle pour le dessalage pour l’enrichissement des élutions
P-2000 Micropipette	Puller Sutter Instrument Co.	P-2000/F	Pour l’extraction de colonnes nanocapillaires pour LC-MS
PhosSTOP comprimés inhibiteurs de la phosphatase	Sigma	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher Scientific	23275
PolySAX LP (12 &mu ; m, taille des pores 300 Å ;)	PolyLC	BMSX1203	Matériau pour la chromatographie forte par échange d’anions utilisée pour l’enrichissement en glycopeptides ERLIC/conventionnel
Phosphate de potassium monobasique (cristallin/certifié ACS)	Fisher Scientific	P285-500
Cellule d’injection sous pression avec plaque d’agitation magnétique intégrée	Next Advance	PC77-MAG	Pour l’emballage de colonnes nanocapillaires avec phase stationnaire jusqu’à une limite
de 2500 psiLogiciel Proteome Discoverer	Thermo Fisher Scientific	n/a	Logiciel commercial pour l’analyse protéomique (avec nœuds logiciels de recherche de bases de données intégrés) et la visualisation de données (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
Concentrateur sous vide SpeedVac SC110 Modèle SC110-120	Savant	n/a	Concentrateur centrifuge sous vide pour le séchage d’échantillons (sous chaleur)
Solution SDS, solution de dodécylsulfate de sodium à 10 %, biologie moléculaire/électrophorèse	Scientific	BP2436200
Chlorure de sodium modifié Trypsin	Promega	V5111
cristallin/certifié ACS)	Fisher Scientific	S271-500
TopTip, vide, 10-200 & micro ; L, paquet de 96	Glygen Corporation	TT2EMT.96	Pointe de pipette vide avec trou de la taille d’un micron utilisée qui peut être utilisée pour emballer des matériaux chromatographiques pour les enrichissements, fournie avec des adaptateurs de tube Tampon
bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, 1 M, pH 8,5 (volatil))	Sigma	90360-100ML
Acide trifluoroacétique, qualité réactif, 99 %	Fisher Scientific	60-017-61
Base Tris (cristaux blancs ou poudre cristalline/biologie moléculaire)	Fisher Scientific	BP152-500
Trypsine/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5071
Urée (certifié ACS)	Fisher Scientific	U15-500
Water, Optima LC/MS Grade	Fisher Scientific	W64