Le présent protocole décrit la méthode d’élevage des insectes ravageurs tortricides dans les laboratoires. Les procédures permettant de distinguer le sexe des insectes et d’extraire les acides nucléiques pour le séquençage à haut débit sont établies à l’aide de deux ravageurs tortricides.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les tortricidae (lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers, qui causent de graves pertes agricoles. Pour comprendre la biologie de ces papillons nuisibles, les techniques fondamentales ont été très demandées. Ici, des méthodes d’élevage de masse, d’observations et d’études moléculaires sont développées à l’aide de deux tortrix de thé, Homona magnanima et Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Les insectes ont été élevés en masse avec un régime artificiel tranché et maintenus par consanguinité pendant plus de 100 générations en tenant compte de leurs caractéristiques biologiques. Les insectes ont divers dimorphismes sexuels; par conséquent, il est difficile de distinguer le sexe pendant les stades de développement, qui ont empêché les tests ultérieurs. Le présent travail a mis en évidence que le sexe des larves de tortricides pouvait être déterminé en observant les testicules ou la coloration lactique-acétique de l’orcéine pour visualiser le chromosome W spécifique à la femelle. De plus, en utilisant les méthodes de détermination du sexe, la présente étude a permis d’extraire des acides nucléiques d’embryons déterminés par le sexe et de les appliquer au séquençage à haut débit. Ces conseils sont applicables à d’autres insectes nuisibles et faciliteront d’autres études morphologiques et génétiques.
Introduction
Les insectes lépidoptères représentent plus de 10 % de toutes les espèces vivantes décrites1, et certaines espèces de taxons causent de graves dommages aux plantes et de graves pertes agricoles 2,3. Bien que des études moléculaires et génétiques aient été développées à l’aide d’insectes modèles tels que le ver à soie Bombyx mori 4,5, les insectes nuisibles n’ont pas encore fait l’objet d’enquêtes, en partie à cause des difficultés d’élevage et de manipulation 6,7.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Collecte d’insectes et élevage de masse
- Collectez des insectes tortricides dans les champs en suivant les références 8,12 publiées précédemment.
REMARQUE : Les larves de H. magnanima et d’A. honmai sont prélevées sur des feuilles de thé endommagées (figure 1A); les adultes sont attirés par la lumière UV portable de 4 W (longueur d’onde de 365 nm, voir tableau des matériaux, figure 1B). - Élevez les larves recueillies (Figure 1C,D)....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Mise en place des lignes hôtes et leur maintenance
La viabilité des larves collectées sur le terrain est attribuée différemment à l’emplacement, aux saisons et aux conditions d’élevage sur le terrain (p. ex., 90 % de la viabilité à Taïwan, Taoyuan, comme le montrent Arai et al.12). Environ 30% à 50% des paires généreront la prochaine génération comme d’habitude. Pour H. magnanima et A. honmai, les matrilines sont maintenues par consanguinité depuis plus de 100.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Tortricid comprend plusieurs ravageurs agricoles et forestiers; la présente étude a présenté des méthodes pour élever la tortrix au fil des générations, observer l’embryogenèse et le sexe des insectes, et effectuer une analyse moléculaire à l’aide d’embryons matures.
L’un des obstacles à l’étude des insectes nuisibles est d’établir des méthodes d’élevage. En particulier, la consanguinité affecte parfois négativement la condition physique de l’espèce. La réduction de la condition physique par l.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Bourses de recherche pour jeunes scientifiques [numéro de subvention 19J13123 et 21J00895].
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| tasse de 1/2 once | FP CHUPA | CP070009 | l’élevage d’insectes ; couvercle de tasse de https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| /2 once | FP CHUPA | CP070011 | l’élevage d’insectes ; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99,7 % d’acide acétique | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon | 36289 | fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Bioanalyseur Agilent 2100 | Agilent Technologies | non montré | Quantification des acides nucléiques ; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Quantification des acides nucléiques ; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| solution de chlorure de benzalkonium | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Stérilisation ; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Coton | AOUME | 8-1611-02 | élevage d’insectes ; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| solution DAPI | Dojindo, Tokyo, Japon | 340-07971 | colorations ; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Hydrogénophosphate disodique | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4 ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| kit de quantification HS de l’ADNdb | Invitrogen | Q33231 | Quantification des acides nucléiques ; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| colonne Econospin RNA II | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | Extraction de l’ARN ; Éthanol http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon | 4.98748E+12 | fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html | |
| Acide éthylènediamine-N,N,N',N'-tétraacétique Sel tétrasodique tétrahydraté (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampon de lyse cellulaire (EDTA) ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Papier cristal | HEIKO | 2100010 | l’élevage d’insectes ; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& ; utm_medium=cpc& utm_source= Bloc chauffant Adw |
| WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japon | 4002620 | incubation ; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon | 4.98748E+12 | fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | non illustré | Régime artificiel ; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | Extraction de l’ARN ; |
| https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Extraction d’acides nucléiques ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Acide lactique | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Colorations ; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html méthanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon | 4.98748E+12 | fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Mélangeur Voltex ; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photomètre NP 80 | Implen | non montré | Quantification des acides nucléiques ; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect harvesting ; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3 % 83 %A9 %E3%83 %AB %E3%83%91 % E3%83%83 %E3%82 %AF %E3%83 % AF %E3 % 82 %A4 %E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II Kit de préparation de banque d’ARN pour Illumina | New England BioLabs | E7770S | ; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Colorations ; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html Paraformaldéhyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| polyoxyéthylène(20) monolaurate de sorbitan | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20 ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Lumière noire UV portable (4W, longueur d’onde 365nm) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japon | non illustré | Collection d’insectes ; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Chlorure de potassium | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Dihydrogénophosphate de potassium | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4 ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | anti-effacement ; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | Extraction d’ADN ; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| solution de précipitation de protéines | Qiagen | 158912 | extraction de l’ADN ; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Quantification des acides nucléiques ; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicine | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon | 4.98748E+12 | Stérilisation ; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html Kit de quantification de l’ARN HS | Invitrogen | Q32855 | Quantification des acides nucléiques ; solution https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase | Nippon Gene | 313-01461 | Extraction de l’ARN ; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | non illustré | Régime artificiel ; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Chlorure de sodium | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Dodécylsulfate de sodium | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampon de lyse cellulaire (FDS) ; |
| solution aqueuse d’hypochlorite de sodium | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon | 4.98748E+12 | séparation des œufs ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Chlorhydrate de tétracycline | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon | 4.98748E+12 | Stérilisation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampon de lyse cellulaire ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| extraction d’ARN 10977023 d’Invitrogen ultra-pure | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
Références
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society<....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
