Microscopie électronique à transmission in situ induite par la lumière pour l’observation de l’interaction liquide-matière molle

Résumé

Le présent protocole décrit les modifications au microscope électronique à transmission (MET) avec un système d’éclairage lumineux, la fabrication de cellules liquides et les observations TEM in situ des interactions induites par la lumière entre les cellules bactériennes et un photosensibilisant. Les méthodes de préparation des échantillons, les dommages causés par le faisceau d’électrons et l’imagerie sont également abordés.

Résumé

Le protocole actuel décrit les modifications apportées à la configuration du microscope électronique à transmission (MET) pour les observations in situ induites par la lumière. Une fibre optique de verre insérée dans la colonne d’électrons au-dessus du pôle de l’objectif et un laser, une source de lumière réglable, ont été utilisés pour fabriquer le dispositif. Une fois l’illuminateur étalonné à l’aide d’un système de mesure externe, il permet d’ajuster l’intensité de l’éclairage aux besoins du processus observé. Ce système d’éclairage a été utilisé pour imager les phénomènes de thérapie photodynamique antimicrobienne, qui font actuellement l’objet d’intenses recherches. L’échantillon a été préparé en repérant une suspension de bactéries sur un substrat de carbone, de graphène ou de nitrure de silicium, en buvant la solution excédentaire, en repérant la solution photosensibilisante, en buvant à nouveau l’excès de liquide, puis en assemblant la cellule liquide avec un deuxième substrat ou film de graphène. Le processus de l’expérience d’imagerie elle-même comprend le choix du bon endroit pour l’observation avec l’utilisation d’un faible grossissement et d’une dose minimale d’électrons, puis l’activation cyclique de la source lumineuse pour capturer les images suivantes à des intervalles spécifiés avec le minimum d’électrons nécessaire. La dose d’électrons de chaque exposition ainsi que le temps et l’intensité de l’éclairage utilisé doivent être soigneusement enregistrés en raison de la complexité des phénomènes observés car, en même temps, le processus est à la fois entraîné par la lumière et par les électrons. Une fois l’expérience proprement dite, des observations de contrôle supplémentaires doivent être faites, dans lesquelles les mêmes doses d’électrons sont utilisées mais sans influence lumineuse supplémentaire et de plus petites doses d’électrons sont utilisées pour des doses plus élevées de lumière. Cela permet de distinguer les effets microstructuraux induits par la lumière de ceux causés par les électrons dans les domaines de la vie et de la science des matériaux.

Introduction

Les phénomènes induits par la lumière en haute résolution sont intéressants dans de nombreux domaines tels que la nanotechnique 1,2,3, la catalyse ^4,5 et la biophotonique⁶. Certains modèles originaux qui permettent de telles expériences peuvent être trouvés dans la littérature, y compris les modifications des porte-échantillons 1,4,7,8,9 et de la fibre optique fixée au microscope

Protocole

1. Modification du microscope électronique à transmission

1. Modifier le microscope électronique à transmission en connectant la fibre optique (voir Tableau des matériaux) à la colonne du microscope en haut de la lentille de l’objectif. Prévoyez quelques centimètres d’espace entre l’objectif et la lentille du condensateur, ainsi qu’un emplacement libre pour les accessoires.
   NOTE: Un porte-échantillon^{dédié 4} ou un support pour les observations cathodoluminescentes en configuration inverse¹ peut également être utilisé.
2. Vérifiez que le système ne fuit pas à l’aide de pom....

Résultats

La configuration expérimentale a été conçue pour observer les processus induits par la lumière se produisant dans un liquide à haute résolution. L’analyse concurrentielle des images nous a permis de distinguer les dommages causés par le faisceau d’électrons des changements liés à la réaction photochimique. L’effet du faisceau d’électrons sur l’échantillon sensible (dans ce cas, les cellules encapsulées avec du liquide) était visible dans toute la zone irradiée lorsque les électrons la traversaient uniformément. Bien sûr,.......

Discussion

L’installation et la mise en service de l’illuminateur nécessitent des connaissances de base en matière de service et peuvent endommager le microscope. La façon la plus simple d’introduire la lumière dans le microscope est de connecter la fibre optique à partir du haut de la lentille de l’objectif, où il y a généralement de la place pour les bobines de déviation TEM et les détecteurs supplémentaires. On peut également s’attendre à plus d’espace libre avec les anciens dispositifs d’entrée par le haut, où le même emplaceme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Film carbone sur grille en cuivre de 200 mailles	Agar Scientific	AGS160	Les grilles TEM standard pour l’observation et la préparation des cellules liquides
Pince à épiler croisée	Dumont	N5	La pince à épiler est nécessaire pour la préparation des cellules liquides
Capteur de puissance à photodiode	ThorLabs	S130C	Le capteur utilisé pour la mesure de l’intensité lumineuse
Fibre multimode à revêtement polyimide	Thorlabs	FG400UEP	Doit être intégré au microscope à l’aide de l’adaptateur intégré sur place, conformément à la norme 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Microscope électronique à transmission	Hitachi	H-800	Peut être remplacé par n’importe quel microscope à entrée latérale, disponible pour modification
Laser à diode accordable	CNI	MRL-III-660D	La longueur d’onde lumineuse doit être choisie en fonction du spectre d’absorption du photosensibilisateur