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Microscopie électronique à transmission in situ induite par la lumière pour l’observation de l’interaction liquide-matière molle

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DOI :

10.3791/63742

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26 juillet 2022

 , 
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering, Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry, Wroclaw University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit les modifications au microscope électronique à transmission (MET) avec un système d’éclairage lumineux, la fabrication de cellules liquides et les observations TEM in situ des interactions induites par la lumière entre les cellules bactériennes et un photosensibilisant. Les méthodes de préparation des échantillons, les dommages causés par le faisceau d’électrons et l’imagerie sont également abordés.

Résumé

Le protocole actuel décrit les modifications apportées à la configuration du microscope électronique à transmission (MET) pour les observations in situ induites par la lumière. Une fibre optique de verre insérée dans la colonne d’électrons au-dessus du pôle de l’objectif et un laser, une source de lumière réglable, ont été utilisés pour fabriquer le dispositif. Une fois l’illuminateur étalonné à l’aide d’un système de mesure externe, il permet d’ajuster l’intensité de l’éclairage aux besoins du processus observé. Ce système d’éclairage a été utilisé pour imager les phénomènes de thérapie photodynamique antimicrobienne, qui font actuellement l’objet d’intenses recherches. L’échantillon a été préparé en repérant une suspension de bactéries sur un substrat de carbone, de graphène ou de nitrure de silicium, en buvant la solution excédentaire, en repérant la solution photosensibilisante, en buvant à nouveau l’excès de liquide, puis en assemblant la cellule liquide avec un deuxième substrat ou film de graphène. Le processus de l’expérience d’imagerie elle-même comprend le choix du bon endroit pour l’observation avec l’utilisation d’un faible grossissement et d’une dose minimale d’électrons, puis l’activation cyclique de la source lumineuse pour capturer les images suivantes à des intervalles spécifiés avec le minimum d’électrons nécessaire. La dose d’électrons de chaque exposition ainsi que le temps et l’intensité de l’éclairage utilisé doivent être soigneusement enregistrés en raison de la complexité des phénomènes observés car, en même temps, le processus est à la fois entraîné par la lumière et par les électrons. Une fois l’expérience proprement dite, des observations de contrôle supplémentaires doivent être faites, dans lesquelles les mêmes doses d’électrons sont utilisées mais sans influence lumineuse supplémentaire et de plus petites doses d’électrons sont utilisées pour des doses plus élevées de lumière. Cela permet de distinguer les effets microstructuraux induits par la lumière de ceux causés par les électrons dans les domaines de la vie et de la science des matériaux.

Introduction

Les phénomènes induits par la lumière en haute résolution sont intéressants dans de nombreux domaines tels que la nanotechnique 1,2,3, la catalyse 4,5 et la biophotonique6. Certains modèles originaux qui permettent de telles expériences peuvent être trouvés dans la littérature, y compris les modifications des porte-échantillons 1,4,7,8,9 et de la fibre optique fixée au microscope 10,11.

La combinaison de l’éclairage lumineux, d’un environnement liquide et de la microscopie électronique à transmission (MET) offre une excellente occasion d’étudier en détail et dynamiquement les processus photo-induits. Cependant, la condition de vide poussé à l’intérieur du microscope est plutôt défavorable pour de nombreux liquides, en particulier les solutions aqueuses. L’encapsulation liquide, qui le protège de l’environnement, peut être réalisée à l’aide de quelques techniques basées principalement sur des substrats de graphène12, de nitrure de silicium 13 ou de carbone14. En plus de la recherche en science des matériaux2, les cellules dites liquides offrent des possibilités pour effectuer des observations microscopiques non conventionnelles sur des spécimens biologiques proches de leurs conditions natives15. De telles observations sont extrêmement exigeantes, en particulier pour les micro-organismes vivants tels que les cellules bactériennes. Le faisceau d’électrons en tant que rayonnement ionisant provoque des dommages irréversibles aux échantillons hydratés, de sorte que la dose d’électrons doit être spécifiée16. Cela est nécessaire pour minimiser les effets défavorables, contrôler les dommages et éviter les artefacts confus. La dose maximale optimale d’électrons qui permet d’observer les cellules vivantes est encore un sujet discutable16, mais la dose de 30 e−/nm2 semble être la valeur seuil, du moins pour les bactéries17.

Certains des sujets d’intérêt pour de telles études microscopiques sont les processus au cours de la thérapie photodynamique antimicrobienne (APDT)18. En bref, la thérapie se déroule comme suit. Les cellules bactériennes sont entourées par le liquide photosensible appelé photosensibilisant. Lorsque l’éclairage lumineux est donné à une longueur d’onde spécifique, les espèces réactives cytotoxiques de l’oxygène (ROS) sont générées par transfert d’énergie ou de charge des molécules photosensibilisatrices excitées à l’oxygène naturellement présent dans la solution. Les agents pathogènes exposés aux ROS sont rapidement inactivés avec une très grande efficacité, sans effets secondaires19. La réponse à la thérapie varie pour des microbes distincts – par exemple, l’impact du même photosensibilisateur peut être très différent pour les bactéries à Gram positif et à Gram négatif20. En général, il a été établi que la cible principale des ROS est les structures externes des cellules, où les dommages entraînent des troubles fonctionnels de la membrane cellulaire et, par conséquent, conduisent à la mort des bactéries21,22. Cependant, les dommages aux acides nucléiques et aux protéines peuvent également être considérés comme une cause d’inactivation18, de sorte qu’on ne sait toujours pas quelles structures cellulaires sont les principales cibles au cours de ce processus19. Une meilleure compréhension des processus dommageables pourrait aider à améliorer cette thérapie définitive. Par rapport aux méthodes de microscopie optique utilisées dans la recherche APDT23, les techniques TEM offrent plus de possibilités d’examiner le mécanisme APDT avec une résolution et un grossissementplus élevés 24. La TEM a déjà été utilisée avec succès pour l’observation cellulaire au cours du traitement en cours, ce qui nous a permis d’étudier les dommages bactériens à Gram positif et de décrire en détail les changements qui se produisent dans la paroi cellulaire 6,25.

Le protocole actuel présente une configuration expérimentale appropriée pour l’imagerie à haute résolution de l’inactivation des bactéries induite par la lumière à l’aide de la MET, ce qui nécessite un système d’éclairage lumineux approprié, l’encapsulation des cellules avec un liquide et un contrôle strict de la dose d’électrons. La bactérie utilisée pour l’observation était Staphylococcus aureus, et une solution de bleu de méthylène a été utilisée comme photosensibilisant. La configuration spéciale d’éclairage lumineux comprend un laser à semi-conducteur accordable connecté directement à la colonne du microscope à l’aide de la fibre lumineuse. Cette conception assure une irradiation uniforme dans tout l’échantillon en raison du placement presque parallèle de la fibre optique à l’axe du microscope. La lumière monochromatique de haute intensité générée par le laser peut ensuite être utilisée pour étudier divers effets photochimiques. La lumière utilisée dans l’expérience avait une longueur d’onde égale à 660 nm car, dans la région visible, le bleu de méthylène a des pics d’absorption à 613 nm et 664 nm26. Le protocole d’encapsulation liquide est basé sur des substrats de carbone, ce qui rend la procédure rapide et simple. Enfin, une méthode d’observation TEM in situ à faible dose de cellules dans un liquide est présentée. Les difficultés concernant la préparation de l’échantillon, les effets de la dose d’électrons sur l’échantillon sensible et l’interprétation raisonnable de l’image sont discutés.

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Protocole

1. Modification du microscope électronique à transmission

  1. Modifier le microscope électronique à transmission en connectant la fibre optique (voir Tableau des matériaux) à la colonne du microscope en haut de la lentille de l’objectif. Prévoyez quelques centimètres d’espace entre l’objectif et la lentille du condensateur, ainsi qu’un emplacement libre pour les accessoires.
    NOTE: Un porte-échantillondédié 4 ou un support pour les observations cathodoluminescentes en configuration inverse1 peut également être utilisé.
  2. Vérifiez que le système ne fuit pas à l’aide de pompes à vide rugueuses. Si le système ne présente pas de fuite de vide, testez-le sous vide poussé.
    1. Vérifiez que l’actionnement du système de vide ne s’écarte pas du démarrage standard du microscope ventilé. En cas de problèmes d’exécution, d’assemblage ou de mise en service du module, contactez le personnel de service autorisé ou le fabricant de l’appareil.
      REMARQUE: L’illuminateur correctement conçu et monté ne masquera pas le faisceau d’électrons. Si le faisceau se déplace successivement au cours du fonctionnement du microscope, la fibre optique non conductrice ne sera pas suffisamment recouverte d’un blindage métallique et accumulera une charge électrique. Dans ce cas, faites glisser la fibre optique profondément dans la gaine conductrice.
  3. Mesurez l’intensité lumineuse à l’aide du capteur de puissance à photodiode (voir le tableau des matériaux). Si l’espace entre les pôles de la lentille de l’objectif ne permet pas la mesure à l’intérieur du microscope, mesurer la géométrie de l’échantillon et de l’illuminateur et reproduire ces conditions dans une installation de mesure externe.
  4. Si le microscope n’est pas équipé d’un système de mesure de dose d’électrons, effectuer l’étalonnage en mesurant le courant du faisceau avec une coupelle de Faraday (voir Tableau des matériaux) et en calculant numériquement la densité des électrons frappant l’échantillon27.

2. Encapsulation des bactéries avec le photosensibilisant

  1. Placer deux grilles TEM non traitées recouvertes de carbone amorphe entre deux pinces croisées orientées vers le haut du côté recouvert de carbone. Tenez les grilles aussi près du bord que possible.
    NOTE: Pour certaines combinaisons de substrat, de solution et d’échantillon, il peut être avantageux d’utiliser un écoulement luminescent sur un ou les deux mailles pour éliminer les impuretés d’usine et obtenir une surface hydrophile maximale28. En utilisant l’exemple de la bactérie S. aureus et de la solution de bleu de méthylène, il a été déterminé que les résultats les meilleurs et les plus reproductibles ont été obtenus sur du carbone neuf non traité sur des grilles en cuivre sans décharge luminescente supplémentaire ni nettoyage au plasma6.
  2. Mettez 4 μL de solution bactérienne sur l’une des grilles. La densité optique de l’échantillon doit être comprise entre 5 et 10.
    REMARQUE: Les bactéries utilisées dans l’étude ont été purifiées de la culture et dispersées dans un tampon PBS. Il est fortement recommandé de vérifier la concentration de bactéries dans l’échantillon frais chaque fois qu’il l’utilise, par exemple en utilisant des méthodes de coloration négative, en suivant les protocoles établis disponibles 29,30,31.
  3. Attendez 60 s et épongez soigneusement le liquide à l’aide de papier filtre. Essayez de répandre le liquide sur toute la surface de la grille pendant ce processus.
  4. Mettez 4 μL de photosensibilisant sur la même grille.
    REMARQUE : Le bleu de méthylène à une concentration de 2 μg/mL a été utilisé comme photosensibilisant pour la présente étude.
  5. Après 5 s, éponger le liquide. Laissez une très fine couche de liquide sur le substrat.
  6. Placez rapidement la grille sèche sur celle recouverte de liquide.
  7. Déplacez doucement la grille supérieure vers le bord de la seconde et pressez les substrats sur les bords à l’aide d’une pince à épiler.
    REMARQUE: Un peu de liquide peut s’écouler de l’échantillon à ce stade, ce qui signifie qu’il n’y en a pas eu assez qui a été drainé. Cependant, cela ne signifie pas nécessairement que la formation de la cellule liquide échouera.
  8. Répétez soigneusement la pression.
    REMARQUE: Il est plus facile d’effectuer cette étape en tournant les pincettes de 90° de sorte qu’elles soient perpendiculaires à la table et que les extrémités des deux pincettes restent à la même hauteur, sans dépendre de la position d’ouverture / fermeture.
  9. Laissez la cellule liquide entre les pinces à épiler pendant 1 min.
  10. Insérez l’échantillon dans le support TEM juste après avoir terminé la préparation.
    REMARQUE: La tension de la plaque / bague de montage du support aidera les substrats à adhérer et à garder le liquide à l’intérieur.
    1. Si possible, pompez le porte-échantillon dans une station de pompage externe pour réduire la contamination du microscope par évaporation du liquide.

3. Observations TEM in situ de cellules bactériennes dans l’effet de dose liquide-électron

  1. Insérez l’échantillon dans le microscope.
  2. Démarrez les observations en mode de faible grossissement pour trouver une zone d’observation appropriée.
    REMARQUE: Les zones plus sombres sont plus susceptibles d’être liquides en raison de la diffusion par faisceau d’électrons.
    1. Pendant les observations, maintenez la dose d’électrons aussi faible que possible. Augmenter le temps d’exposition (jusqu’à 2 s pour une tension d’accélération de 150 kV et un grossissement de 5 000x). Le grossissement de 5 000x pour la caméra à montage inférieur (le champ de vision approximatif est de 10 μm) est suffisant pour imager les bactéries d’un diamètre de ~1 μm.
      REMARQUE: Parfois, il n’est pas facile de distinguer le liquide, donc, au début des observations, il est utile de concentrer le faisceau d’électrons là où il est susceptible d’être liquide. Le liquide devrait se déplacer sur un faisceau d’électrons focalisés, et les bulles apparaîtront. Après cette vérification, il est nécessaire de trouver une autre zone pour d’autres observations.
  3. Trouvez les cellules entourées de liquide au grossissement approprié avec un temps d’exposition prolongé et capturez immédiatement la première image. Maintenez la dose d’électrons constante et collectez des images toutes les 30 s pour observer les changements.
  4. Examinez attentivement les images et calculez la dose totale d’électrons27 qui correspond aux premiers changements visibles dans les cellules.

4. Observations TEM in situ des processus induits par la lumière entre les cellules bactériennes et le photosensibilisateur

  1. Avant de commencer l’expérience, réglez l’intensité de la lumière laser en ajustant la valeur actuelle. Choisissez la longueur d’onde appropriée en fonction du spectre d’absorption du photosensibilisant. Selon le tracé d’étalonnage précédent (étape 1.4.), choisissez la valeur actuelle correspondant à l’intensité lumineuse la plus faible.
    NOTE: La longueur d’onde lumineuse utilisée dans cette étude était de 660 nm.
  2. Insérez l’échantillon dans le microscope et trouvez la zone d’observation après l’étape 3.2. dans la section précédente.
  3. Capturez la première image de la cellule avant de commencer l’éclairage de l’échantillon et utilisez l’occulteur de faisceau pour éteindre le faisceau d’électrons afin d’éviter les effets de l’irradiation électronique.
  4. Allumez le laser. Commencez par un temps d’éclairage court (ici 30 s) car la lumière laser a une intensité relativement élevée. Après ce temps, éteignez la source lumineuse.
  5. Éteignez l’occulteur de faisceau et capturez l’image immédiatement. Si possible, utilisez un algorithme automatique pour exposer l’échantillon uniquement pendant le temps nécessaire à la prise de l’image. Mesurer soigneusement le temps d’irradiation électronique pour calculer la dose d’électrons27 utilisée pour l’imagerie.
  6. Répétez l’étape 4.4. et étape 4.5. pour obtenir le temps d’éclairage attendu.

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Résultats

La configuration expérimentale a été conçue pour observer les processus induits par la lumière se produisant dans un liquide à haute résolution. L’analyse concurrentielle des images nous a permis de distinguer les dommages causés par le faisceau d’électrons des changements liés à la réaction photochimique. L’effet du faisceau d’électrons sur l’échantillon sensible (dans ce cas, les cellules encapsulées avec du liquide) était visible dans toute la zone irradiée lorsque les électrons la traversaient uniformément. Bien sûr,...

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Discussion

L’installation et la mise en service de l’illuminateur nécessitent des connaissances de base en matière de service et peuvent endommager le microscope. La façon la plus simple d’introduire la lumière dans le microscope est de connecter la fibre optique à partir du haut de la lentille de l’objectif, où il y a généralement de la place pour les bobines de déviation TEM et les détecteurs supplémentaires. On peut également s’attendre à plus d’espace libre avec les anciens dispositifs d’entrée par le haut, où le même emplaceme...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La recherche a été financée par la subvention Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Centre national des sciences, Pologne).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Film carbone sur grille en cuivre de 200 maillesAgar ScientificAGS160Les grilles TEM standard pour l’observation et la préparation des cellules liquides
Pince à épiler croiséeDumontN5La pince à épiler est nécessaire pour la préparation des cellules liquides
Capteur de puissance à photodiodeThorLabsS130CLe capteur utilisé pour la mesure de l’intensité lumineuse
Fibre multimode à revêtement polyimideThorlabsFG400UEPDoit être intégré au microscope à l’aide de l’adaptateur intégré sur place, conformément à la norme 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Microscope électronique à transmissionHitachiH-800Peut être remplacé par n’importe quel microscope à entrée latérale, disponible pour modification
Laser à diode accordableCNIMRL-III-660DLa longueur d’onde lumineuse doit être choisie en fonction du spectre d’absorption du photosensibilisateur

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Mots-clés

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