Isolement, culture et caractérisation des cellules de Schwann primaires, des kératinocytes et des fibroblastes du prépuce humain

Les cellules primaires dérivées de tissus vivants et cultivées dans des conditions in vitro ressemblent étroitement à l’état physiologique¹, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les processus physiologiques et physiopathologiques. La peau contient plusieurs types de cellules, y compris les kératinocytes, les fibroblastes, les sébocytes, les mélanocytes et les cellules de Schwann (SC), qui peuvent être isolés et cultivés pour des expériences in vitro . Les méthodes d’isolement et de culture des kératinocytes, des fibroblastes et des SC, à partir d’un seul morceau de peau, n’ont pas été décrites. L’objectif de ce protocole est double : 1) établir une méthode fiable et reproductible pour l’isolement et la culture des SC dermiques et 2) utiliser une méthode efficace et robuste pour l’isolement des kératinocytes, des fibroblastes et des SC d’un seul prépuce humain.

À l’heure actuelle, il existe des protocoles établis pour isoler les kératinocytes^{cutanés 2,3,4} et les fibroblastes ^5,6. Ces études décrivent l’isolement des kératinocytes, des fibroblastes ou des deux de la peau, mais aucun protocole ne traite de la façon d’établir des cultures de SC primaires à partir de la peau humaine. Des études récentes suggèrent que les SC neuronaux modulent les processus cellulaires des kératinocytes et des fibroblastes et régulent les fonctions physiologiques normales de la peau⁷. Les SC sont donc essentiels à l’homéostasie cutanée et contribuent de manière substantielle à la physiologie régulatrice qui influence le comportement des types de cellules cutanées voisines présentes⁸. Par conséquent, un protocole qui permet l’isolement de chacun de ces types de cellules est idéal pour les expériences in vitro impliquant la communication cellule-cellule ou la diaphonie entre les types de cellules.

Ce protocole décrit l’établissement de cultures cellulaires individuelles de cellules primaires à partir d’un seul morceau de peau. Ce protocole est particulièrement utile lorsque la quantité de tissu disponible est limitée. De plus, l’isolement des trois types de cellules d’un seul donneur permet des comparaisons robustes entre les types de cellules ou des expériences de co-culture tout en atténuant l’influence de la génétique au cours de l’expérience souhaitée.

L’acquisition et l’utilisation de tissus de prépuce humain anonymisés à des fins de recherche ont été examinées et ont reçu la détermination de « recherche non humaine » par le Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574).

REMARQUE: En suivant le protocole ci-dessous, 2,4 x 10⁶ kératinocytes, 4,4 x 10⁶ fibroblastes et 1,1 x 10⁶ SC sont obtenus à partir d’un seul prépuce. En général, ces cellules primaires peuvent être utilisées pour 3 passages, en fonction des conditions expérimentales.

1. Isolement des cellules primaires et conditions de culture

1. Procédure de séparation de l’épiderme et du derme
   1. Acquérir un prépuce néonatal en suivant les procédures de soins standard d’un médecin en vertu des protocoles réglementaires hospitaliers approuvés. Le médecin détermine le moment de la circoncision après la naissance et la quantité de peau enlevée.
   2. Placer le prépuce excisé dans un tube de microcentrifugation contenant 8 à 10 mL de milieu basal DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco glacé et transporter immédiatement le prépuce au laboratoire de culture cellulaire pour l’isolement cellulaire. Rincez la peau deux fois avec 20-25 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco contenant 1x antibiotique / antimycotique.
      REMARQUE: Pour une viabilité cellulaire maximale, le prépuce excisé doit être placé à 4 °C jusqu’au traitement, et les cellules doivent être récoltées dans les 24 heures.
   3. Après rinçage dans du DPBS/antibiotiques, faire tremper le prépuce dans 25 à 30 mL de milieu basal DMEM glacé pendant 10 à 15 min dans un récipient de culture tissulaire de 10 cm. Effectuer toutes les étapes de traitement dans une hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile.
   4. À l’aide d’un scalpel, ouvrir soigneusement le prépuce et exposer le derme et le tissu adipeux sous-cutané.
   5. Retirez le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince, d’une lame de scalpel et de ciseaux, au besoin. Jeter le tissu adipeux. Coupez le prépuce nettoyé en trois à cinq petits morceaux.
   6. Transférer les morceaux de peau dans un tube conique stérile contenant 16 à 20 mL de dispase-I/DMEM (4 mg/mL dans le milieu basal DMEM).
   7. Mélanger les morceaux de peau dans le tube conique par inversion, par intermittence, pendant les 30 premières minutes d’incubation avec dispase-I. Ensuite, placez le tube conique à 4 °C pendant 16-18 h, en gardant à l’esprit d’immerger les morceaux de peau dans dispase-I/media.
      REMARQUE: La solution de dispase-I doit être préparée juste avant l’addition en utilisant un milieu basal DMEM froid, filtrée avec une passoire de 0,22 μm et maintenue à 4 °C.
   8. Après une digestion nocturne avec dispase-I, retirez les morceaux de peau et placez-les sur un plat de culture sec et stérile. Déroulez chaque morceau de peau de sorte que la couche épidermique externe touche le plat de culture.
   9. À l’aide de deux pinces, séparez soigneusement l’épiderme du derme. Commencez sur le bord du tissu et pelez l’épiderme loin du derme.
      REMARQUE: Si la couche de l’épiderme est difficile à séparer du derme, la digestion dispase-I n’était pas suffisante. Options de dépannage : 1) retourner les morceaux de peau dans la solution dispase-I/DMEM et incuber pendant 2 à 3 h supplémentaires à 4 °C ; 2) placer les morceaux de peau dans de la dispase-I/DMEM fraîche et incuber à 4 °C pendant 2-3 h de plus.
   10. Utilisez l’épiderme et le derme séparés pour isoler les kératinocytes (épiderme), les fibroblastes et les cellules de Schwann (derme).
       REMARQUE: Suivez les étapes ci-dessous pour des types de cellules spécifiques à l’isolement et aux conditions de culture.
2. Isolement des kératinocytes de l’épiderme
   1. Ajouter 5 mL de solution saline tampon HEPES (HBS) à une boîte de culture de 10 cm et ajouter les fragments d’épiderme séparés. Incuber à température ambiante (RT) pendant 10 min.
   2. Après l’incubation de HBS, recueillir la solution HBS dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 5 mL de tampon de neutralisation de la trypsine (TNB) (Table des matériaux) dans un tube conique de 50 mL et réserver.
   3. Ajouter 3 mL de solution de trypsine aux fragments épidermiques. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
   4. Agiter doucement les fragments épidermiques à l’aide de pinces jusqu’à ce que la solution de trypsine devienne trouble.
   5. Ajouter la solution de trypsine/kératinocytes au tube contenant du HBS et du TNB à l’étape 1.2.2.
   6. Pour tous les fragments épidermiques restants qui ne se sont pas dissous lors de la digestion initiale de la trypsine, ajouter 3 mL de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 %. Incuber à 37 °C pendant 10 min et répéter les étapes 1.2.4 et 1.2.5.
   7. Ajouter 2 mL de sérum fœtal bovin (FBS) à la solution de trypsine/EDTA contenant des tubes de solution HBS et TNB.
   8. Centrifuger le tube de prélèvement contenant HBS/TNB/trypsine et kératinocytes à 870 x g pendant 5 min à 4 °C.
   9. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3 mL de milieu de croissance complet des kératinocytes (Table des matériaux).
   10. Filtrer la suspension cellulaire avec un filtre stérile de 100 μM dans un tube conique stérile de 50 mL pour éliminer les débris.
   11. Quantifier le nombre de cellules et la viabilité des cellules.
       REMARQUE : Ici, un dispositif spécialisé d’échantillonnage et de coloration des cellules (Table des matériaux) a été utilisé pour quantifier le nombre de cellules et la viabilité en suivant les instructions du fabricant.
   12. Plaques de culture de semences au besoin pour les expériences. La densité d’ensemencement recommandée est d’environ 45 000 cellules/cm².
   13. Placer les plaques de culture dans un incubateur à 37 °C dans 5% de CO₂ pendant 2 jours pour permettre aux kératinocytes d’adhérer au plat.
   14. Après 2 jours, aspirer toutes les cellules non adhérentes. Rafraîchissez le milieu de culture cellulaire tous les deux jours jusqu’à ce que les kératinocytes atteignent la confluence souhaitée pour le passage ou les expériences en aval (confluence de 50% à 80%).
3. Isolement des cellules de Schwann (SC) et des fibroblastes du derme
   1. Pré-enduire les flacons T25 de poly-L-lysine (PLL, 0,01 μg/μL) en utilisant 5 mL de 1x DPBS. Placer les flacons pré-enduits à 37 °C pendant 3 h. Lavez la matrice de revêtement PLL deux fois à l’aide de 1x DPBS (5 mL).
      REMARQUE: Les flacons T25 peuvent être préparés à l’avance.
   2. Rincer les morceaux isolés du derme avec 5 mL de milieu basal DMEM.
   3. Hachez le derme en petits morceaux avec des ciseaux ou un scalpel.
   4. Digérer le derme haché avec 5 mL de collagénase (2 mg/mL dans le milieu basal DMEM) à 37 °C pendant 2,5 h. Triturez délicatement le derme émincé avec une pointe de pipette toutes les 30 minutes jusqu’à ce que le derme se dissocie complètement.
   5. Filtrer la suspension cellulaire avec une passoire cellulaire de 70 μM. Il est nécessaire d’appliquer une force mécanique à l’aide d’une seringue de 1 mL pour filtrer complètement la suspension.
   6. Diluer la suspension cellulaire filtrée avec 5 mL de milieu DMEM complet (milieu basal DMEM + 5% FBS + 1x d’antibiotique) pour arrêter l’activité enzymatique de la collagénase.
   7. Centrifuger la suspension de la cellule à 870 x g pendant 5 min à RT pour granuler les cellules.
   8. À partir de cette pastille cellulaire, on obtiendra à la fois des fibroblastes et des SC. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 2 mL de milieu complet DMEM pour diviser les cellules (suspension/tube de cellule de 1 mL) et centrifuger à 870 x g pendant 5 min à RT.
   9. Pour la culture de SC, suivez les étapes 1.3.10-1.3.17 et pour la culture de fibroblastes, suivez les étapes 1.3.18-1.3.22.
   10. À partir de l’étape 1.3.8, aspirez le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de milieu DMEM complet frais.
   11. Quantifier le nombre de cellules et la viabilité.
       REMARQUE : Ici, un dispositif spécialisé d’échantillonnage et de coloration des cellules (Table des matériaux) a été utilisé pour quantifier le nombre de cellules et la viabilité en suivant les instructions du fabricant.
   12. Ensemencez les flacons T25 préenrobés avec 5 mL de cellules remises en suspension à une densité de 4,0 x 10³ cellules/mL. Incuber la fiole à 37 °C en présence de 5 % de CO₂ pendant la nuit (~12-16 h d’incubation).
   13. Après 16 h, confirmer l’adhérence des cellules par microscopie (Table des matériaux) à un grossissement de 10x.
   14. Retirez les cellules non adhérentes et lavez la fiole 3x avec 5 mL de 1x DPBS.
   15. Ajouter 5 mL de 10 μM cytosine arabinoside (agent antimitotique, tue les fibroblastes) dans le milieu complet DMEM. Incuber la fiole à 37 °C en présence de 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   16. Aspirer le milieu contenant de l’arabinoside cytosine de la fiole. Rincez la fiole 3x avec 5 mL de 1x DPBS.
   17. Remplir la fiole de culture avec 5 mL de SC dans un milieu de culture complet (Table des matériaux) et incuber à 37 °C en présence de 5 % de CO₂ pendant 48 h. Actualisez le milieu de culture complet SC tous les deux jours jusqu’à ce que les SC atteignent 80% de confluence.
   18. Aspirer le surnageant de la couche dermique dissociée (étape 1.3.8) et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 5 mL de milieu complet de fibroblastes (milieu basal des fibroblastes + 5% FBS + 1x antibiotique).
   19. Quantifier le nombre de cellules et la viabilité des cellules.
       REMARQUE : Ici, un dispositif spécialisé d’échantillonnage et de coloration des cellules (Table des matériaux) a été utilisé pour quantifier le nombre de cellules et la viabilité en suivant les instructions du fabricant.
   20. Plaquer les fibroblastes à une densité cellulaire de 4,0 x 10³ cellules/mL dans des flacons de culture T25 (non pré-enduits) en utilisant 5 mL de milieu complet de fibroblastes. Incuber à 37 °C en présence de 5% de CO₂ pendant la nuit (~12-16 h d’incubation).
   21. Après 16-24 h, confirmer l’adhérence de la cellule par microscopie (Table des matériaux) à un grossissement de 10x. Aspirer les cellules non adhérentes de la fiole et laver la fiole deux fois avec 5 mL de 1x DPBS.
   22. Ajouter 5 mL de fibroblaste frais en milieu complet et incuber à 37 °C en présence de 5 % de CO₂ pendant 48 h. Rafraîchissez le milieu de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les fibroblastes atteignent la confluence souhaitée pour les essais de passage ou en aval (confluence de 50% à 80%).

2. Vérification des kératinocytes épidermiques, des SC dermiques et du marqueur protéique des fibroblastes par immunofluorescence

1. Jour 1 - Glissières en verre de la chambre de couche et cellules détachées
   1. Pré-enduire des lames de verre à chambre à 4 puits avec du collagène I pour les kératinocytes, ou PLL pour les SC ou seulement 1x DPBS pour les fibroblastes (0,5 mL par puits). Assurez-vous de recouvrir toute la surface. La chambre d’incubation glisse à 37 °C pendant 2 h. Pendant l’incubation, préparez les cellules.
   2. Une fois que les cellules cultivées ont atteint une confluence de 50% à 80%, lavez les flacons avec 1x DPBS 3x (1 mL pour chaque puits).
   3. Détacher les cellules adhérentes avec 5 mL de solution de trypsine-EDTA (TE) à 0,25 % en incubant à 37 °C en présence de 5 % de CO_{2 pendant 2} min, jusqu’à ce que les cellules commencent à devenir rondes. Visualisez le détachement des cellules par microscopie (Table des matériaux) à un grossissement de 10x.
   4. Après l’incubation, transférer la solution TE contenant des cellules dans un tube conique avec 5 mL de sérum fœtal bovin (FBS).
   5. Ajouter 5 mL de tampon de neutralisation de la trypsine (TNB) dans la fiole de culture, puis transférer le contenu dans le tube centrifuge susmentionné (cellules avec TE et FBS). Visualisez le détachement des cellules par microscopie (Table des matériaux) à un grossissement de 10x.
      REMARQUE: TNB ou FBS ou les deux peuvent être utilisés pour neutraliser l’activité de la trypsine.
   6. Centrifuger le tube conique contenant des cellules/TE/TNB à 870 x g pendant 5 min. Transférer le surnageant dans un autre tube et remettre la pastille cellulaire dans le milieu de culture complet correspondant. Mesurer la viabilité cellulaire comme mentionné à l’étape 1.2.11.
   7. Rincez les lames de verre de la chambre pré-revêtues (étape 2.1.1) avec 1x DPBS (1 mL pour chaque puits) 3x.
   8. Semi-sécher les lames à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire et ensemencer des kératinocytes, des SC ou des fibroblastes à une densité appropriée (30 000 cellules/0,5 mL/chambre) dans un milieu de culture cellulaire complet approprié.
   9. Incuber les glissières de la chambre à 37 °C pendant la nuit pour permettre aux cellules d’adhérer.
2. Jour 2 - Blocage de la lame de verre de la chambre avec l’albumine sérique bovine (BSA) et l’incubation des anticorps primaires
   1. Aspirer le milieu cellulaire des glissières de la chambre et laver 3x avec 1 mL de 1x DPBS.
   2. Fixer les cellules adhérentes avec 4% de paraformaldéhyde dans 1x DPBS (1 mL pour chaque puits) et incuber pendant 15 min à RT à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire.
   3. Aspirer 4% de paraformaldéhyde des glissières de la chambre et laver les lames de la chambre 3x avec 1x DPBS (1 mL pour chaque puits).
   4. Perméabiliser les membranes cellulaires avec 1% de TritonX-100 dans 1x DPBS (1 mL pour chaque puits) et incuber pendant 15 min à TA.
   5. Aspirer la solution bloquante des glissières de la chambre, laver 3x avec 1x DPBS (1 mL pour chaque puits) pendant 30 s puis aspirer 1x DPBS du puits.
   6. Bloquez les glissières de la chambre avec 5% de BSA (0,5 mL pour chaque puits) et incubez pendant 45 min à RT.
   7. Aspirer la solution bloquante des glissières de la chambre, laver 3x avec 1x DPBS (1 mL pour chaque puits) pendant 30 s chacune puis aspirer 1x DPBS du puits.
   8. Diluer les anticorps primaires avec 5% de BSA (0,2 mL pour chaque puits) (Dilutions des anticorps primaires: kératinocytes: anticorps cytokératine 14 de souris (1:100) et anticorps cytokératine 10 (1:100); Cellules de Schwann : anticorps S100 de souris (1:200) et anticorps du récepteur du facteur de croissance nerveuse du lapin (p75-NTR) (1:500); Fibroblastes : anticorps contre la vimentine de lapin (1:200) et anticorps contre l’actine musculaire alpha-lisse de souris (α-SMA) (1:200)).
   9. Ajouter les anticorps primaires aux cellules correspondantes sur la lame de verre de la chambre et incuber pendant environ 15-16 h (pendant la nuit) à 4 °C dans une chambre humidifiée.
   10. Aspirer les anticorps primaires des lames de la chambre, laver 3 fois avec 1x DPBS (1 mL pour chaque puits) pendant 30 s chacun, puis aspirer 1x DPBS du puits.
   11. Diluer les anticorps secondaires (Anticorps secondaire IgG anti-lapin chèvre-Alexa Fluor 488 (1:500) et anticorps secondaire IgG anti-souris chèvre-Alexa Fluor 594 (1:500)) avec 0,5% de BSA. Ajouter un anticorps secondaire approprié à chaque puits (0,2 mL pour chaque puits). Incuber pendant 45 min à RT.
   12. Aspirer l’anticorps secondaire des lames de chambre, laver 3x avec 1x DPBS (1 mL pour chaque puits) pendant 30 s chacun, puis aspirer 1x DBPS du puits.
   13. Retirez le joint de la glissière de la chambre à 4 puits à l’aide d’un dissolvant de joint. Essayez de ne pas laisser d’adhésif sur la glissière car cela interfère avec l’application du couvercle. Ajouter une goutte de milieu de montage avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Vous pouvez également contre-tacher les puits avec du DAPI et utiliser un support de montage ne contenant pas d’étiquettes.
   14. Placez soigneusement le couvercle sur la glissière en verre en évitant les bulles d’air et scellez l’extrémité du couvercle avec de la colle. Observez les schémas de coloration par immunofluorescence par microscopie (Table des matériaux) à un grossissement de 10x et/ou 20x.

Le prépuce néonatal normal a été utilisé pour l’isolement des kératinocytes épidermiques primaires et des SC et fibroblastes dermiques. Les cellules primaires isolées ont été cultivées dans des milieux de culture cellulaire respectifs contenant des facteurs de croissance. Après l’ensemencement des SC et des fibroblastes dans des flacons de culture, la plupart des cellules ont adhéré au fond de la fiole en 2 h. Dans le cas des kératinocytes, la plupart des kératinocytes ont adhéré de 24 h. Les kératinocytes primaires épidermiques isolés ont atteint 85 % de confluence au jour 7 et présentaient une morphologie cellulaire caractéristique (forme pavée) (figure 1A). Les SC ont atteint 95 % de confluence au jour 5 et semblaient bipolaires ou tripolaires (figure 1B). Les cultures de fibroblastes ont atteint 95 % de confluence au jour 4 et la plupart des cellules présentaient une morphologie en forme de fuseau (Figure 1C). L’expression protéique spécifique du type cellulaire a été confirmée dans ces cultures par coloration par immunofluorescence. Les kératinocytes étaient positifs pour les protéines K10 (marqueur de différenciation) et K14 (marqueur de prolifération) (figure 2A); de même, les SC étaient positifs pour S100 et p75-NTR (figure 2C). Les fibroblastes ont exprimé positivement la vimentine, mais n’ont pas exprimé le marqueur myofibroblastique, l’actine musculaire alpha lisse (α-SMA) (Figure 2E).

Les images fusionnées de l’immunofluorescence de la kératine et de la coloration nucléaire DAPI (figure 2A) ont indiqué que 97,8 % des cellules des cultures étaient des kératinocytes (figure 2B). Les cellules de Schwann doubles S100 et p75-NTR positives suggèrent une pureté de 95,2 % de SC en culture selon le protocole (Figure 2C,D). De même, 97,2 % des cellules des cultures de fibroblastes ont exprimé positivement la vimentine (figure 2E,F). Ainsi, l’expression protéique caractéristique se trouve dans les types de cellules respectifs, et le protocole permet l’isolement de populations de cellules relativement pures.

Figure 1 : Isolement des kératinocytes primaires dérivés du prépuce humain, des cellules de Schwann et des fibroblastes. (A) Kératinocytes, (B) cellules de Schwann et (C) Fibroblastes au microscope à contraste de phase; barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Caractérisation des kératinocytes primaires dérivés du prépuce humain, des cellules de Schwann et des fibroblastes. (A) Les kératinocytes ont été identifiés à l’aide de kératine 14 (K14, kératinocytes prolifératifs) et K10 (kératine 10, marqueur de différenciation des kératinocytes); barre d’échelle = 100 μm. (B) Analyse statistique de la pureté des kératinocytes cultivés à l’aide d’immunofluorescences à double coloration de cellules. (C) Les cellules de Schwann ont été identifiées à l’aide de S100 et de p75-NTR (récepteur du facteur de croissance nerveuse); barre d’échelle = 100 μm. (D) Analyse statistique de la pureté des SC cultivés à l’aide d’immunofluorescences à double coloration de cellules. (E) Les fibroblastes ont été identifiés à l’aide de la vimentine (fibroblaste) et de l’actine musculaire α lisse (différenciation des fibroblastes, myofibroblaste); barre d’échelle = 100 μm. (F) Analyse statistique de la pureté des fibroblastes cultivés à l’aide d’immunofluorescences vimentine cellules colorées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tous les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.