Techniques de microscopie pour interpréter la colonisation fongique dans les tissus végétaux mycohétérotrophes et germination symbiotique des graines

Résumé

Ce protocole vise à fournir des procédures détaillées pour la collecte, la fixation et la conservation d’échantillons de plantes mycohétérotrophes, en appliquant différentes techniques de microscopie telles que la microscopie électronique à balayage et à transmission, la microscopie optique, confocale et à fluorescence pour étudier la colonisation fongique dans les tissus et les graines des plantes germées avec des champignons mycorhiziens.

Résumé

La botanique structurale est une perspective indispensable pour bien comprendre l’écologie, la physiologie, le développement et l’évolution des plantes. Lors de la recherche sur les plantes mycohétérotrophes (c’est-à-dire les plantes qui obtiennent du carbone des champignons), des aspects remarquables de leurs adaptations structurelles, les modèles de colonisation des tissus par les champignons et la morphoanatomie des organes souterrains peuvent éclairer leurs stratégies de développement et leurs relations avec les hyphes, la source de nutriments. Un autre rôle important des champignons symbiotiques est lié à la germination des graines d’orchidées; toutes les espèces d’Orchidaceae sont mycohétérotrophes pendant la germination et le stade des plantules (mycohétérotrophie initiale), même celles qui photosynthétisent à l’âge adulte. En raison du manque de réserves nutritionnelles dans les graines d’orchidées, les symbiotes fongiques sont essentiels pour fournir des substrats et permettre la germination. L’analyse des stades de germination par perspective structurelle peut également répondre à des questions importantes concernant l’interaction des champignons avec les graines. Différentes techniques d’imagerie peuvent être appliquées pour dévoiler des champignons endophytes dans les tissus végétaux, comme le proposent cet article. Des sections à main levée et minces d’organes végétaux peuvent être colorées puis observées à l’aide de la microscopie optique. Un fluorochrome conjugué à l’agglutinine de germe de blé peut être appliqué sur les champignons et co-incubé avec Calcofluor White pour mettre en évidence les parois cellulaires végétales en microscopie confocale. En outre, les méthodologies de microscopie électronique à balayage et à transmission sont détaillées pour les orchidées mycohétérotrophes, et les possibilités d’appliquer de tels protocoles dans des plantes apparentées sont explorées. La germination symbiotique des graines d’orchidées (c’est-à-dire en présence de champignons mycorhiziens) est décrite en détail dans le protocole, ainsi que les possibilités de préparer les structures obtenues à partir de différentes étapes de la germination pour des analyses par microscopie optique, confocale et électronique.

Introduction

La recherche structurale en botanique, couvrant la morphologie et l’anatomie des plantes, est fondamentale pour comprendre l’organisme entier^1,2, et fournit des perspectives indispensables pour intégrer et contribuer à la connaissance de l’écologie^, de la physiologie, du développement et de l’évolution des plantes³. Les méthodes en morphologie et anatomie des plantes comprennent actuellement des protocoles, des équipements et des connaissances développés récemment ainsi qu’il y a plus d’un siècle². L’exécution et l’adaptation continues de méthodes classiques (par....

Protocole

1. Collecte, fixation et conservation des échantillons

NOTE: Les plantes entièrement MH peuvent généralement être trouvées dans le sous-étage de la forêt sombre 12,13, principalement dans les zones humides et abondantes en litière, tandis que les plantes partiellement MH peuvent être trouvées dans les forêts plus ouvertes^12,13. Les plantes MH ont généralement des organes souterrains bien développés dans une variété de formes et de tailles.

1. Lors de la collecte d’espèces MH, explorez le sol autour de....

Résultats

Suivre les étapes essentielles de la fixation des tissus végétaux donne des structures cellulaires aussi proches que possible de l’état vivant, compte tenu de la morphologie, du volume et de l’organisation spatiale des composants cellulaires et des tissus¹⁶. Observer de tels traits dans les échantillons après fixation chimique (Figure 4). La figure 4C-F représente des échantillons correctement fixés en mi.......

Discussion

Les analyses d’images en anatomie et morphologie des plantes ont un potentiel important pour atteindre les objectifs et aider à comprendre les relations entre les plantes mycohétérotrophes et leurs endophytes fongiques indispensables, comme le démontrent les études sur les organes souterrains^6,40, les analyses structurelles de la germination symbiotique des graines³⁹ et les structures aériennes et reproductrices ⁴¹ .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétone	Sigma-Aldrich	179124	(pour le montage des talons de MEB)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(pour les tests de germination des graines)
Teinture blanche Calcofluor	Sigma-Aldrich	18909	Colorant fluorescent (détecte la cellulose)
Solution tampon de citrate, 0,09M pH 4,8	Sigma-Aldrich	C2488	(pour coloration au bleu de toluidine O)
Ruban carbone conducteur double face	Fisher Scientific	50-285-81	(pour MEB)
Microscope confocal	Zeiss		(tout modèle)
Grilles en cuivre	Sigma-Aldrich	G4776	(pour MET)
Sécheur de points critiques	Balzers		(tout modèle)
Cryostat	Leica Biosystems		(tout modèle)
Microscope de dissection	Leica Biosystems		(= stéréomicroscope, n’importe quel modèle)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	support de montage rapide pour la microscopie
Alcool éthylique, pur (&ge ; 99,5 %)	Sigma-Aldrich	459836	(= éthanol, pour les procédés de déshydratation)
Solution de formaldéhyde, 37 %	Sigma-Aldrich	252549	(pour la préparation de la solution NBF)
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %	Sigma-Aldrich	HT501128	fixatrice tissulaire histologique
pour TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(pour la polymérisation de résine dans TEM)
Solution de gélatine, 2 % dans H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(diluer pour la préparation des lames - adhérence OCT)
Solution de glutaraldéhyde, 25 %	Sigma-Aldrich	G6257	(pour Karnovsky'
HistoResin	Leica Biosystems	Kit	d’enrobage de méthacrylate de glycol (GMA) 14702231731
iode	Sigma-Aldrich	207772	(pour la préparation de la solution Lugol)
Nitrate de plomb(II)	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (pour coloration de contraste TEM)
Microscope optique	Olympus		(n’importe quel modèle)
LR Résine acrylique blanche	Sigma-Aldrich	L9774	résine acrylique hydrophile pour solution TEM
Lugol	Sigma-Aldrich	62650	(pour coloration)
Embouts métalliques pour supports d’échantillons	Rave Scientific		(pour MEB, différents modèles)
Microtome	Leica Biosystems		ou autre modèle
l’avoine (OMA)	Millipore	O3506	(pour les tests de germination des graines)
Composé OCT, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	Milieu d’enrobage pour tissus congelés
Tétroxyde d’osmium	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (pour postfixation TEM)
Parafilm thermoplastique d’étanchéité
M Sigma-Aldrich P7793Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127	(pour Karnovsky' préparation de la solution)
Solution de poly-L-lysine, 0,1 % dans H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(pour la préparation des lames - adhérence OCT)
Lames Poly-Prep	Lames de verre revêtues de poly-L-L-lysine	Sigma-Aldrich	P0425
Plateaux de tasse de moulage en polyéthylène	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, pour l’enrobage d’échantillons dans de la résine GMA)
Moulage de polyéthylène Gobelets	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, pour l’enrobage d’échantillons dans de la résine GMA)
Iodure de potassium	Sigma-Aldrich	221945	(pour la préparation de la solution Lugol)
Gélose au dextrose de pomme de terre (PDA)	Millipore	70139	(pour les tests de germination des graines)
Microscope électronique à balayage	Jeol		(tout modèle)
Silane [(3-Aminopropyle)triéthoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(pour la préparation des lames - adhérence OCT)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	de verre recouvertes de silane
Gel de silice orange, granulaire	Supelco	10087	(pour les procédés de dessiccation)
Cacodylate de sodium trihydraté	Sigma-Aldrich	C0250	(pour tampon glutaraldéhyde-cacodylate de sodium)
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (pour Karnovsky' préparation de la solution et coloration de contraste TEM)
Solution d’hypochlorite de sodium	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (pour la désinfection de la surface des graines)
Phosphate de sodium dibasique, anhydre	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (pour la solution NBF et la préparation PB)
Phosphate de sodium monobasique monohydraté	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· ; H2O (pour NBF et PB)
Coucheuse par pulvérisation cathodique	Balzers		(n’importe quel modèle)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (pour cryoprotection et test de germination)
Soudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(pour coloration)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(pour la coloration)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(pour la coloration)
Seringue			(3 mL, n’importe quelle marque, pour la coloration de contraste TEM)
Unité de filtre pour seringue, Millex-GV 0.22 & micro ; m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma (pour la coloration par contraste TEM)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	adhésif cyanoacrylate liquide, viscosité moyenne
Bleu toluidine O	Sigma-Aldrich	T3260	(pour la coloration)
Microscope électronique à transmission	Jeol		(tout modèle)
Triphényltétrazolium chlorure	Sigma-Aldrich	T8877	(pour l’essai au tétrazolium dans la germination des graines)
Citrate trisodique dihydraté	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)· ; 2H2O (pour la coloration de contraste TEM)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(tout modèle)
Acétate d’uranyle	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (pour coloration de contraste TEM)
Pompe			(n’importe quel modèle)
Agglutinine de germe de blé, Alexa Fluor 488 Conjugué	TermoFisher Scientific	W11261	lectine conjuguée à un colorant fluorescent (détecte les résidus d’acide sialique et de N-acétylglucosaminyle)

capsules de gélatine rotatif manuel Gélose à lames à vide