Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D

Résumé

Le présent protocole décrit une plate-forme expérimentale pour évaluer les effets des signaux mécaniques et biochimiques sur les réponses chimiothérapeutiques des cellules de glioblastome dérivées de patients dans des cultures mimétiques matricielles 3D à l’aide d’un dispositif d’éclairage UV sur mesure facilitant la photocroision à haut débit d’hydrogels avec des caractéristiques mécaniques accordables.

Résumé

Les interactions cellule-matrice interviennent dans des processus physiologiques complexes par le biais d’indices biochimiques, mécaniques et géométriques, influençant les changements pathologiques et les réponses thérapeutiques. La prise en compte des effets matriciels plus tôt dans le développement de médicaments devrait augmenter la probabilité de succès clinique de nouveaux traitements. Il existe des stratégies basées sur les biomatériaux récapitulant des microenvironnements tissulaires spécifiques en culture cellulaire 3D, mais leur intégration avec les méthodes de culture 2D principalement utilisées pour le dépistage des drogues a été difficile. Ainsi, le protocole présenté ici détaille le développement de méthodes de culture 3D au sein de matrices de biomatériaux miniaturisés dans un format de plaque multi-puits pour faciliter l’intégration avec les pipelines de dépistage de médicaments existants et les tests conventionnels pour la viabilité cellulaire. Étant donné que les caractéristiques matricielles essentielles à la préservation des phénotypes cliniquement pertinents dans les cellules cultivées devraient être hautement spécifiques aux tissus et aux maladies, un dépistage combinatoire des paramètres de la matrice sera nécessaire pour identifier les conditions appropriées pour des applications spécifiques. Les méthodes décrites ici utilisent un format de culture miniaturisé pour évaluer les réponses des cellules cancéreuses à la variation orthogonale de la mécanique matricielle et à la présentation des ligands. Plus précisément, cette étude démontre l’utilisation de cette plate-forme pour étudier les effets des paramètres de matrice sur les réponses des cellules de glioblastome dérivées du patient (GBM) à la chimiothérapie.

Introduction

Le coût prévu du développement d’un nouveau médicament n’a cessé d’augmenter au cours de la dernière décennie, avec plus de 1 milliard de dollars dans les estimations actuelles¹. Une partie de cette dépense est due au taux élevé d’échec des médicaments entrant dans les essais cliniques. Environ 12% des candidats médicaments ont finalement obtenu l’approbation de la Food & Drug Administration (FDA) des États-Unis en 2019. De nombreux médicaments échouent en phase I en raison d’une toxicité imprévue², tandis que d’autres qui réussissent les essais de sécurité peuvent échouer en raison d’un manque d’efficacité³. Cette attrition due à la non-efficacité peut s’expliquer en partie par le fait que les modèles de cancer utilisés lors du développement de médicaments sont notoirement non prédictifs de l’efficacité clinique⁴.

Les disparités fonctionnelles entre les modèles in vitro et in vivo peuvent être attribuées à l’élimination des cellules cancéreuses de leur microenvironnement natif, y compris les cellules non tumorales et l’ECM^{physique 5,6}. Généralement, les groupes de recherche utilisent des matrices de culture disponibles dans le commerce, telles que Matrigel (une matrice de membrane basale protéinée dérivée de sarcomes de souris) pour fournir aux cellules tumorales cultivées un microenvironnement matriciel 3D. Par rapport à la culture 2D, la culture 3D dans une matrice membranaire a amélioré la pertinence clinique des résultats in vitro ^7,8. Cependant, les biomatériaux de culture à partir de tissus décellularisés, y compris la matrice membranaire, présentent généralement une variabilité d’un lot à l’autre qui peut compromettre la reproductibilité⁹. En outre, les matrices dérivées de tumeurs d’origine tissulaire différente de celles étudiées peuvent ne pas fournir les indices physiologiques appropriés¹⁰. Enfin, les cancers à haut degré d’hétérogénéité intratumorale ont des caractéristiques microenvironnementales qui varient sur une échelle submicronique et que la matrice membranaire ne peut pas être réglée pour récapituler¹¹.

Le glioblastome (GBM), une tumeur cérébrale uniformément mortelle avec un temps de survie médian d’environ 15 mois, est un cancer pour lequel le développement du traitement a été particulièrement difficile^12,13. La norme actuelle de soins pour le GBM consiste en une résection de la tumeur primaire, suivie d’une radiothérapie, puis d’une chimiothérapie à l’aide de témozolomide (TMZ)¹⁴. Pourtant, plus de la moitié des tumeurs CLINIQUES GBM présentent une résistance au traitement par divers mécanismes 15,16,17. Il est extrêmement difficile de prédire l’efficacité d’un schéma thérapeutique pour un patient individuel. Les modèles précliniques standard utilisés pour prédire les résultats individuels consistent en des cellules tumorales dérivées de patients xénogreffées orthotopiquement dans des souris immunodéprimées. Bien que les xénogreffes dérivées du patient puissent récapituler de nombreux aspects des tumeurs cliniques GBM et soient précieuses pour les modèles précliniques¹⁸, elles sont intrinsèquement coûteuses, à faible débit, prennent beaucoup de temps et impliquent des préoccupations éthiques¹⁹. Les cultures de cellules dérivées de patients, sur des surfaces en plastique 2D ou sous forme de sphéroïdes, évitent généralement ces problèmes. Alors que les cellules dérivées de patients préservent les aberrations génétiques, leurs cultures en 2D ou sous forme de sphéroïdes en suspension ont été en grande partie de mauvaises représentations de xénogreffes dérivées de patients chez des rongeurs et des tumeurs originales^{de patients 20}. Auparavant, nous, et d’autres, avons montré que les cellules GBM cultivées dans un ECM 3D qui imite les propriétés mécaniques et biochimiques du tissu cérébral peuvent préserver les phénotypes de résistance aux médicaments 10,21,22,23.

Les interactions entre l’acide hyaluronique (HA), un polysaccharide abondant dans l’ECM cérébral et surexprimé dans les tumeurs GBM, et son récepteur CD44 modulent l’acquisition de la résistance aux médicaments in vitro ^{21,24,25,26,27}. Par exemple, l’inclusion de l’AH dans des cultures 3D molles a augmenté la capacité des cellules GBM dérivées du patient à acquérir une résistance thérapeutique. Cette mécano-réceptivité dépendait de la liaison de l’AH aux récepteurs CD44 sur les cellules GBM²¹. De plus, la liaison de l’intégrine aux peptides porteurs de RGD, incorporée dans des matrices de culture 3D, a amplifié la chimiorésistance médiée par CD44 d’une manière dépendante de la rigidité²¹. Au-delà de l’AH, l’expression de plusieurs protéines ECM, dont beaucoup contiennent des régions RGD, varie entre le cerveau normal et les tumeurs GBM²⁸. Par exemple, une étude a rapporté que 28 protéines ECM distinctes étaient régulées à la hausse dans les tumeurs GBM²⁹. Dans ce microenvironnement complexe de la matrice tumorale, les cellules cancéreuses intègrent des indices mécaniques et biochimiques pour produire un phénotype de résistance particulier, qui dépend de différences relativement faibles (par exemple, moins d’un ordre de grandeur) dans le module de Young ou la densité des peptides liant l’intégrine 28,29,30.

Le présent protocole caractérise la façon dont les cellules tumorales interprètent des combinaisons uniques d’indices matriciels et identifient des microenvironnements matriciels complexes et spécifiques au patient qui favorisent la résistance au traitement (Figure 1A). Une méthode photochimique pour générer des matrices miniaturisées et réglées avec précision pour la culture 3D fournit un grand espace variable orthogonal. Une gamme de LED sur mesure, gérée par un microcontrôleur, a été incorporée aux hydrogels de photocroisillon dans un format de plaque à 384 puits pour augmenter l’automatisation et la reproductibilité. L’intensité de l’exposition a varié d’un puits à l’autre pour modifier les propriétés micromécaniques des hydrogels résultants, telles qu’évaluées à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Bien que ce manuscrit ne se concentre pas sur la construction du réseau d’éclairage lui-même, un schéma de circuit (Figure 1B) et une liste de pièces (Table des matériaux) sont fournis comme aides à la reproduction de l’appareil.

Ce rapport démontre la génération rapide d’un ensemble de cellules GBM cultivées dans des microenvironnements 3D uniques dans lesquels le module de Young (quatre niveaux sur un seul ordre de grandeur) et la teneur en peptides liant l’intégrine (dérivés de quatre protéines ECM différentes) ont varié orthogonalement. L’approche a ensuite été utilisée pour étudier les contributions relatives de la mécanique de l’hydrogel et de l’engagement de l’intégrine spécifique à l’ECM sur la viabilité et la prolifération des cellules GBM dérivées du patient à mesure qu’elles acquièrent une résistance à la chimiothérapie au témozolomide (TMZ).

Protocole

Les lignées cellulaires GBM dérivées du patient (GS122 et GS304) ont été fournies par le professeur David Nathanson (notre collaborateur), qui a développé ces lignées selon un protocole approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’UCLA (IRB # 10-000655). Les cellules ont été anonymisées afin que les lignées cellulaires ne puissent pas être reliées aux patients individuels.

1. Préparation de la solution d’hydrogel

1. Préparer la solution tamponnée HEPES en dissolvant la poudre HEPES à 20 mM dans la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank. Ajuster le pH à 7 après la solvatation complète.
2. Dans la solution tamponnée HEPES, dissoudre l’HA thiolé (poids moléculaire nominal de 700 kDa, voir tableau des matériaux), préparé à la suite du rapport précédent³¹, de sorte que 6 % à 8 % des résidus d’acide carboxylique sur chaque acide glucuronique soient modifiés avec un thiol, à une concentration de 10 mg/mL dans une solution tampon.
   REMARQUE: Un flacon ambré est recommandé pour empêcher l’oxydation du thiol par la lumière ambiante.
   1. Remuer à l’aide d’une plaque magnétique (<1 000 tr/min) à température ambiante jusqu’à dissolution complète, généralement autour de 45 min.
3. Pendant la dissolution de l’AH, préparer des solutions séparées de (1) 100 mg/mL de PEG-Norbornène à 8 bras (20 kDa), (2) 100 mg/mL de PEG-Thiol à 4 bras (20 kDa), (3) 4 mM de cystéine ou de peptide contenant de la cystéine (p. ex. GCGYGRGDSPG) et (4) 4 mg/mL de LAP dans des tubes de microcentrifugation (voir tableau des matériaux).
   1. Préparez chacune de ces quatre solutions dans la solution tamponnée HEPES préparée à l’étape 1.1. Vortex les solutions pour assurer la dissolution complète de chaque réactif avant d’effectuer l’étape 4.
      REMARQUE: Si vous testez plusieurs peptides différents, chacun doit contenir une cystéine ou une autre source de fraction thiol pour cette chimie de conjugaison.
   2. Préparer des solutions (4 mM de thiol disponible) de tous les peptides à attacher dans un seul hydrogel à ce stade.
      REMARQUE : Les séquences peptidiques et les protéines ECM à partir desquelles elles ont été dérivées et utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1. La N-acétyl cystéine (voir Tableau des matériaux), à laquelle les cellules ne se lient pas, peut être substituée à un peptide bioactif contenant du thiol pour titrer la concentration d’un peptide adhésif ou agir comme un témoin négatif³¹.
4. Mélanger les solutions individuelles de HA, peg-norbornène, PEG-thiol et peptides contenant de la cystéine/thiol (voir tableau des matériaux) pour obtenir les concentrations finales pour les matrices finales d’hydrogel énumérées dans le tableau 2. Remuer (<1 000 tr/min) sur une plaque magnétique pendant au moins 30 min pour mélanger complètement.
   REMARQUE: Les solutions HA sont très visqueuses et mieux manipulées à l’aide d’une pipette volumétrique (voir tableau des matériaux). Si une pipette volumétrique n’est pas disponible, les solutions visqueuses peuvent également être dispensées d’une micropipette standard en pipetant lentement à l’aide de pointes à orifice large.

2. Éclairage et photocroisillonnage d’hydrogels via un réseau de LED

ATTENTION: Portez des lunettes de protection UV et couvrez le champ d’éclairage avec un matériau absorbant les UV.

REMARQUE: Le réseau de LED décrit dans ce protocole se compose de six ensembles de huit LED placés en série, comme illustré par le schéma de circuit fourni (Figure 1A). Chaque ensemble de LED peut être alimenté indépendamment, ce qui permet jusqu’à six irradiances différentes par course. Le fichier supplémentaire 1 contient des captures d’écran correspondant aux instructions suivantes pour plus de conseils.

1. Téléchargez le fichier illumination device.zip à partir des fichiers de codage supplémentaires. Ce répertoire contient les fichiers suivants : Arduino.zip (fichier de codage supplémentaire 1), Drivers.zip (fichier de codage supplémentaire 2), GUI.zip (fichier de codage supplémentaire 3) et Holder.zip (fichier de codage supplémentaire 4).
   REMARQUE: Imprimez en 3D les parties supérieure et inférieure pour maintenir la carte de circuit imprimé en place (voir Fichiers de codage supplémentaires pour plus de détails).
2. Téléchargez et installez le logiciel du microcontrôleur (voir tableau des matériaux).
3. Téléchargez et installez le logiciel GUI (voir Tableau des matériaux). Reportez-vous au fichier supplémentaire 1 pour obtenir des instructions d’utilisation du logiciel.
4. Ouvrez Traitement et installez la bibliothèque controlIP5 en cliquant sur Esquisse > Importer la bibliothèque > Ajouter une bibliothèque. Ensuite, recherchez controlIP5 dans les bibliothèques et cliquez sur Installer. Effectuez cela pour la toute première fois.
5. Alimentez le dispositif d’éclairage (voir tableau des matériaux) à l’aide de l’alimentation 36 volts et connectez-le à un PC à l’aide d’un câble micro-USB.
   REMARQUE: Certains périphériques n’installeront pas automatiquement les pilotes pour diverses cartes nano Arduino. Un ensemble de pilotes est fourni dans le fichier zip du périphérique.
6. Ouvrez le fichier Arduino.ino, situé dans le dossier Adruino.zip, à l’aide de l’IDE Arduino.
7. Compilez le fichier Arduino.ino en cliquant sur le bouton Coche . Téléchargez le code compilé en cliquant sur le bouton Fléché .
8. Ouvrez le fichier GUI.pde, situé dans le dossier GUI.zip, à l’aide de Traitement.
9. Cliquez sur Exécuter dans le programme de traitement pour lancer l’interface utilisateur graphique pour contrôler le dispositif d’éclairage.
10. Dans la fenêtre de l’interface utilisateur graphique, cliquez sur Intensité pour que la colonne contenant la solution de précurseur d’hydrogel soit réticulée et entre l’intensité souhaitée. Cliquez sur la case Heure et entrez l’heure souhaitée. Pour la solution fournie dans le tableau 2, ce sera 15 s.
    REMARQUE: Les utilisateurs finaux doivent calibrer les valeurs d’intensité numériques en fonction de l’irradiance à l’aide d’un radiomètre. Des exemples d’intensités typiques sont fournis à la figure 2A.
11. Alignez les échantillons avec le dispositif d’éclairage (Figure 2B) avec toutes les autres LED dans une seule colonne des moules en silicone (voir Tableau des matériaux) ou une plaque à 384 puits. Cliquez sur Terminer pour commencer l’illumination. Répétez ce processus si nécessaire pour l’éclairage de plusieurs lames ou d’autres puits d’une plaque de 384 puits.
    REMARQUE: Le support est conçu de telle sorte que la plaque de 384 puits se trouve au ras d’un coin de la chambre intérieure pendant l’éclairage.
    1. Après l’éclairage, lorsqu’il est placé dans un coin, déplacez la plaque de puits vers le coin suivant et répétez. Pour éclairer les puits sur l’autre moitié de la plaque, soulevez la plaque hors du support et faites pivoter de 180 °.
12. Générez des hydrogels avec une mécanique variable pour la caractérisation mécanique en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Nettoyez les lames de verre et les moules en silicone à l’aide de ruban adhésif pour enlever les débris. Collez les moules en silicone à la glissière en verre, appuyez vers le bas pour assurer une bonne étanchéité et déplacez les bulles d’air.
    2. Pipette 80 μL de solution de précurseur d’hydrogel, telle que préparée à l’étape 1.4, dans chaque moule en silicone sur la lame de verre.
    3. Placez la glissière en verre sur le dispositif d’éclairage aligné avec toutes les autres LED dans une seule colonne. Exposez les précurseurs de l’hydrogel à la lumière UV pendant 15 s, comme décrit à l’étape 2, à la photocroisillon.
    4. Une fois l’éclairage arrêté, récupérez les lames et desserrez les gels des moules en traçant la circonférence interne du moule avec une pointe fine (pointe de pipette de 10 μL, aiguille de 30 G, etc.). Retirez les moules en silicone avec une pince à épiler /pince.
    5. Déplacez les hydrogels réticulés dans les puits individuels d’une plaque de 12 puits en mouillant une spatule et en les poussant doucement hors de la glissière de verre. Remplissez chaque puits avec 2 mL de DPBS (voir tableau des matériaux) avant d’ajouter l’hydrogel. Gonfler les gels en solution de DPBS pendant au moins 12 h (généralement pendant la nuit) à température ambiante (pour la caractérisation mécanique du lendemain).

3. Mesures de microscopie à force atomique (AFM)

1. Allumez le microscope à force atomique (AFM) conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Ce protocole fournit de brèves instructions pour l’utilisation de l’instrument et du logiciel associé.
2. Installez la sonde AFM (voir tableau des matériaux).
   NOTE: Pour la présente étude, un porte-à-faux triangulaire en nitrure de silicium avec une constante nominale de ressort de 0,01 N/m a été modifié avec une particule sphérique de dioxyde de silicium de 2,5 μm.
3. Après l’installation, alignez le laser sur le sommet de la sonde triangulaire, puis ajustez la déviation du miroir et du laser pour maximiser la somme du signal (généralement entre 1,5 et 2,2 volts).
4. Immergez la sonde dans DPBS et attendez jusqu’à 15 minutes pour obtenir l’équilibre thermique. Cliquez sur le bouton Calibration et sélectionnez Étalonnage dépendant du contact. Cliquez sur le bouton Collect Thermal Tuning , et après la collecte des données, sélectionnez le pic autour de 3 kHz pour l’étalonnage.
   REMARQUE: Un léger ajustement du miroir et des déflecteurs laser peut être nécessaire après une immersion dans un liquide en raison de changements d’indice de réfraction.
5. Approchez la surface d’une boîte de Petri (plastique) en réglant les paramètres d’approche sur vitesse constante, une hauteur cible de 7,5 μm et une vitesse d’approche de 15 μm/s. Activez la mesure de référence par course pour l’approche afin que l’approche s’exécute en continu et ne s’arrête pas prématurément en raison de la dérive dans le déflecteur.
6. Lors de l’approche, définissez les paramètres d’acquisition pour la cartographie de la force sur des rotations de 4 nN, une distance d’indentation de 2 μm, une vitesse de 1 μm/s et un temps de contact de 0 s. Appuyez sur le bouton Démarrer pour commencer à collecter une courbe de force sur la surface en plastique (par exemple, une plaque de puits).
7. Revenez à la fenêtre d’étalonnage et sélectionnez la partie de la courbe de force correspondant au contact et à l’indentation du plastique. Acceptez les valeurs de sensibilité et de rigidité calculées pour que la sonde termine l’étalonnage.
8. Après l’étalonnage, soulevez la sonde AFM et placez l’échantillon d’hydrogel pour interrogatoire. Approchez l’hydrogel en suivant les paramètres fournis à l’étape 5.
   REMARQUE: Au cours de la procédure d’approche vers la surface de l’hydrogel, l’unité peut déclencher par erreur l’état approché. Pour vérifier l’approche réelle, obtenez une courbe de force comme à l’étape 4.6. Répétez la procédure d’approche si la courbe résultante ne montre pas le contact et l’indentation résultante.
9. Lorsque l’approche de surface réussit, passez en mode De mappage de force et définissez les paramètres d’acquisition sur une carte de taille 8 x 8 avec une longueur de 40 μm par axe. Obtenez des cartes de force dans diverses régions pour évaluer l’uniformité des mesures de rigidité.
   1. Interpréter les courbes de force à l’aide du logiciel JPK SPM Data Processing à l’aide d’un ajustement de modèle Hertz/Sneddon (équations 1 et 2, voir le tableau 3 pour la définition de toutes les variables) avec la géométrie sphérique sélectionnée 32,33,3 ⁴.
      Équation 1³²
      Équation 2³²

4. Mise en place et traitement médicamenteux de cultures 3D intégrées à une matrice

1. Préparez les cellules souhaitées sous forme de solution à cellule unique.
   REMARQUE: Différents types de cellules peuvent nécessiter différentes méthodes de passage. Un protocole typique pour le passage d’une culture en suspension de sphéroïdes GBM à partir d’une fiole T-75 est rapporté à la référence³¹.
2. Recueillir les sphéroïdes GBM (environ 150 μm de diamètre) d’une culture en suspension de flacon T-75 dans un tube conique de 15 mL. Rincez la fiole de culture avec 5 mL de DPBS pour éliminer les cellules et les milieux résiduels et ajoutez ce volume au tube conique.
3. Centrifuger le tube conique contenant des cellules à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Après centrifugation, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire, et remettre en suspension 5 mL de DPBS.
4. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante pour laver les cellules. Aspirer le surnageant avec une pipette sérologique de 5 mL, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire, puis remettre les cellules en suspension dans 2 mL de réactif de dissociation cellulaire (voir Tableau des matériaux).
5. Incuber à température ambiante pendant 10-15 min. Ajouter 3 mL de milieu complet (voir tableau des matériaux) et pipeter doucement 3 à 5 fois pour décomposer les sphéroïdes en une suspension à cellule unique³¹.
6. Centrifuger la suspension monocellulaire à 400 x g (les suspensions à cellule unique peuvent être filées plus rapidement pour la formation de granulés) pendant 5 min pour les cellules à granulés à température ambiante. Aspirer le surnageant avec une pipette sérologique de 5 mL, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu complet.
   REMARQUE: Si les cellules restent en touffes, plutôt que sous forme de cellules individuelles en suspension, après le passage, les cellules peuvent être passées à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour obtenir une suspension à cellule unique.
7. Retirez une partie des cellules pour le comptage à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer cette portion deux fois avec du bleu de trypan, qui imprègne les cellules dont la viabilité est compromise. Ne comptez que les cellules vivantes et incolores. Typiquement, un T-75 ensemencé à 800 000 cellules par flacon donne 2 à 3 millions de cellules après une semaine de culture.
8. Déterminez le nombre de cellules nécessaires à l’encapsulation. Transférer un volume de milieu contenant le nombre total de cellules nécessaires dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,7 mL. Tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE: Par exemple, un minimum de 2,5 millions de cellules remises en suspension dans 1 mL de volume de gel est nécessaire pour encapsuler les cellules à 2,5 millions de cellules / mL. Un volume de gel de 1 mL permet aux utilisateurs de distribuer 100 gouttes de gel, où chaque goutte de gel est de 10 μL de volume. Il est recommandé de préparer un volume supplémentaire d’environ 20% de cellules en suspension dans une solution d’hydrogel pour tenir compte de la perte lors du transfert de la pipette. Ainsi, on préparerait 3 millions de cellules et 1,2 mL de solution précurseur d’hydrogel dans cet exemple. Une densité minimale de 500 000 cellules/mL est recommandée.
9. Aspirer le surnageant avec une micropipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire. Remettre en suspension la pastille de cellule dans la solution de précurseur d’hydrogel, telle que préparée à l’étape 1.4, en mélangeant bien en pipetant de haut en bas avec une micropipette de 1 000 μL 4 à 5 fois.
10. Chargez les cellules dans un pipetteur répétitif (voir Tableau des matériaux) réglé pour distribuer 10 μL. Pour éviter les bulles et la distribution inégale, amorcez le pipetteur répétitif en distribuant 1 à 2 fois de plus dans un conteneur à déchets.
11. Dans chaque puits d’une plaque de 384 puits, distribuer 10 μL de cellules en suspension dans une solution d’hydrogel du pipetteur répétitif. À l’aide du réseau de LED, éclairer chaque puits contenant des cellules (étape 2) pendant 15 s avec des intensités (exemple, résultats de la figure 2A , intensités utilisées de 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm²) pour obtenir les propriétés mécaniques souhaitées.
    REMARQUE : Il est suggéré de commencer par cinq réplications par condition expérimentale et d’augmenter ou de réduire la taille en fonction du débit souhaité et de la variance du test de point de terminaison.
12. Ajouter 40 μL de milieu complet à chaque puits contenant les cellules. Ajouter 50 μL de DPBS aux puits secs non expérimentaux entourant les gels pour minimiser les pertes dues à l’évaporation.
13. Pour les cellules GBM, ajouter 40 μL du médicament contenant du milieu (p. ex., TMZ, voir Tableau des matériaux) pour atteindre la concentration finale souhaitée (10 μM-100 μM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le véhicule (DMSO), en conséquence, à partir de 3 jours après l’encapsulation.

5. Essai de prolifération CCK8

1. Ajouter 10 μL de réactif CCK8 (voir Tableau des matériaux) à chaque puits contenant les cellules.
   REMARQUE: Si vous effectuez ce test pour la première fois, incluez des puits de contrôle négatifs tels que des milieux uniquement ou de l’hydrogel sans cellules dans les milieux.
2. Incuber pendant 1-4 h selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Ce temps peut varier en fonction du type de cellule et de la densité, et les temps d’incubation doivent donc être testés pour chaque application afin que les valeurs d’absorbance se situent dans une plage linéaire, une exigence pour l’application de la loi³⁵ de Beer.
3. Lire les absorbances à 450 nm pour tous les puits après l’incubation.
4. Calculer l’absorbance moyenne à 450 nm obtenue à l’étape 3 pour l’état du véhicule pour chaque groupe. Divisez chaque médicament bien traité par la moyenne du véhicule témoin par groupe.
5. Calculez les intervalles de confiance en générant des distributions bootstrap (N = 10 000) via la méthode du centile³⁶.
   REMARQUE : En général, on peut utiliser des intervalles de confiance à 95 % et interpréter des conditions dont les intervalles de confiance ne dépassent pas 1 comme étant significatives et justifiant une enquête plus approfondie. La définition d’intervalles de confiance à 95 % est compatible avec la définition d’un seuil de signification de p = 0,05. Pour les données présentées dans les résultats, il est utile de distinguer les conditions qui favorisent ou inhibent la résistance aux médicaments à médiation matricielle, ce qui nécessite une analyse bilatérale.

Résultats

Les mesures AFM ont confirmé un contrôle précis de la mécanique de l’hydrogel en fonction de l’irradiance UV (mW/cm²) lors de la photo-réticulation à l’aide d’un réseau de LED personnalisé contrôlé par Arduino (Figure 2A). La formulation d’hydrogel utilisée dans ce protocole se trouve dans le tableau 2. L’espacement des LED sur le gabarit fourni correspond à l’espacement pour tous les autres puits d’une plaque de 384 puits, ce qui permet la formation de gels à l’i...

Discussion

Les travaux actuels présentent des méthodes pour générer des cultures miniaturisées 3D à base d’AH tout en modifiant simultanément la rigidité de la matrice et les peptides disponibles pour l’engagement de l’intégrine. Cette technique permet d’étudier systématiquement comment les paramètres de la matrice affectent les phénotypes cellulaires (par exemple, la viabilité des cellules cancéreuses exposées à la chimiothérapie) avec un débit accru. Les approches précédentes, y compris celle présentée ici, ont réglé la rigidité ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Résistances 1,1 kOhm, 6 W	Digikey	35601k1ft
Tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL	Genesse Scientific	21-108
Tube conique de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C
LED 365 nm Digikey		ltpl-c034uvh365
384 plaque de puits	Bio Greiner One	781090
40 µ ; Filtre à cellules m	MTC bio	C4040
Polyéthylène glycol à 4 bras à terminaison thiol (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm résistances, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene ended polyethylene glycol (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104500	dissociation cellulaire  ; réactif
Sondes AFM	Novascan		0,01 N/m Constante nominale du ressort, 2,5 & micro ; m SiO2 particule
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano Makerfire		Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontrôleur Board
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Centrifugeuse	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Pointes de pipette pour pipette à déplacement positif
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Éthanol anhydre	Fisher Scientific	A405P	Ajouter de l’eau DI à diluer à 70 %
Fisherbrand Classe B Flacons filetés en verre ambré	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Papier de pesée	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Supplément	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	Ajouter de l’eau DI à diluer à 1 M
Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µ ; g/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Pistolet à air chaud	Wagner	HT1000
Peptide de sialoprotéine liant l’intégrine (IBSP)	Genscript	Commande personnalisée	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phényl-2,4,6 triméthylbenzoylphosphinate (LAP) , >95 %	Sigma Aldrich	900889-1G
Plaque d’agitation magnétique	Thermo	SP194715
Microcentrifugeuse	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E pipette monocanal	Gilson	FD10004	Pipette à déplacement positif
Pointes de micropipette Divers	Manufacturs		Différentes tailles
micropipette mLine	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM microscope
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	Ajouter de l’eau DI à diluer à 1 M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid	Drummond	4000102
Lames de microscope simples	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal Isolateur en silicone, 12-4,5 mm de diamètre x 2 mm de profondeur	Grace Bio Labs	664201-A	Coupez de manière à ce que 8 moules individuels soient fabriqués à partir d’une seule feuille
Traitement	Traitement	3.5.4
Répéteur M4	Eppendorf	4982000322
Répéteur Pointes	de pipetteSartorious	30089430	1 mL formats
RGD Peptide	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Pipettes sérologiques	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipettes
Pâte à souder	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Fil
droit pince à dissection	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Lecteur de plaques	Biotek
T-75 Flacon traité pour culture cellulaire	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	Généralement utilisé à partir de 10 µ ; M à 100 & micro ; M
Tenascin-C Peptide	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Acide hyaluronique thiolé (700 kDa), modifié à 6-8 %	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375