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Isolement et culture de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse à partir de la mandibule humaine

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DOI :

10.3791/63811

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13 avril 2022

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1State Key Laboratory of Military Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2College of Life Sciences, Northwest University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une procédure efficace d’isolement et de culture de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse mandibulaire humaine en utilisant la méthode d’adhérence de la moelle osseuse entière. Les cellules cultivées ont été identifiées par des tests de prolifération cellulaire, la cytométrie en flux et l’induction de différenciation multilignée.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) ont montré un grand potentiel dans la régénération osseuse, la modulation immunitaire et le traitement des maladies chroniques réfractaires. Diverses origines ont été trouvées pour obtenir des hMSC récemment, alors que la moelle osseuse était encore considérée comme la principale source. Les CSM dérivées de la moelle osseuse (CSM) provenant de différents sites osseux de donneurs présentent des caractéristiques distinctes en raison de facteurs microenvironnementaux. Des études ont montré que les BMSC de l’os maxillo-facial peuvent avoir de plus grandes capacités prolifératives et ostéogéniques que les BMSC des os longs ou de la crête iliaque. Et les BMSC maxillo-faciales ont été considérées comme plus appropriées pour la thérapie par cellules souches dans les tissus maxillo-faciaux. La mandibule, en particulier la zone ramale ascendante avec suffisamment de moelle, était un site donneur réalisable pour la récolte des BMSC. Cette étude a décrit un protocole pour la récolte, l’isolement et la culture de CSM dérivées de la moelle osseuse mandibulaire humaine (CSMBm). De plus, l’immunophénotypage des hmBMSC, les tests de prolifération et l’induction in vitro de la différenciation ostéogénique, adipogène et chondrogénique ont été effectués pour identifier les cellules cultivées. L’application de ce protocole peut aider les chercheurs à obtenir suffisamment de hmBMSC de haute qualité, ce qui est nécessaire pour des études ultérieures de la fonction biologique, des effets microenvironnementaux et des applications cliniques.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) sont des cellules multipotentes qui peuvent être différenciées en différents types de cellules, telles que les ostéocytes, les adipocytes et les chondrocytes de la lignée mésodermique, les hépatocytes et les pancréocytes de la lignée endodermique et les neurocytes de la lignée ectoddermique1. Ainsi, les hMSC ont montré un grand potentiel dans la régénération tissulaire. De plus, les hMSC sont de puissants immunomodulateurs qui peuvent réguler le microenvironnement dans les tissus de l’hôte et traiter efficacement les maladies chroniques réfractaires2. Par conséquent, les hMSC ont été largement utilisées dans la thérapie cellulaire des études cliniques. Par conséquent, il est important d’obtenir avec succès un nombre suffisant de CSMh de haute qualité.

Depuis que les CSMh ont été signalées pour la première fois dans la moelle osseuse, de nombreuses sources alternatives de CSM ont été trouvées, telles que le tissu adipeux, le liquide synovial, le muscle squelettique, le liquide amniotique, l’endomètre, les tissus dentaires et le cordon ombilical 1,3. Cependant, la moelle osseuse reste la principale source de CSMh pour la plupart des études précliniques et cliniques, et les CSM dérivées de la moelle osseuse (CSM) sont considérées comme une norme pour comparer les CSM provenant d’autres sources4. Pendant des années, la crête iliaque ou les os longs (le tibia et le fémur) ont été les localisations anatomiques les plus populaires pour obtenir de la moelle osseuse 1,5. Cependant, la crête iliaque ou les os longs ont des origines embryonnaires et des schémas de développement différents de ceux des os maxillo-faciaux 5,6. De nombreuses études cliniques, de laboratoire et de développement ont prouvé que les BMSC de différentes origines présentaient des propriétés spécifiques au site, et que les BMSC greffés conservaient les propriétés du site donneur après l’implantation sur le site receveur 5,6,7,8,9. Du point de vue de l’origine développementale, les tissus maxillo-faciaux, tels que le maxillaire, la mandibule, la dentine, l’os alvéolaire, la pulpe et le ligament parodontal, proviennent exclusivement des cellules de la crête neurale. En revanche, la crête iliaque et les os longs sont formés par le mésoderme. De plus, les mandibules sont créées par ossification intramembraneuse, tandis que les squelettes axiaux et appendiculaires subissent une ossification endochondrale. De plus, par rapport à la crête iliaque et aux os longs, certaines études cliniques ont montré que les CSMh dérivées de la moelle osseuse maxillo-faciale avaient une meilleure activité proliférative cellulaire et une meilleure capacité de différenciation 6,8. Par conséquent, les BMSC des zones maxillo-faciales devraient être un meilleur choix pour la régénération du tissu maxillo-facial et le traitement des maladies réfractaires chroniques maxillo-faciales.

La mandibule est composée d’os corticaux épais à deux couches avec une moelle osseuse spongieuse entre les deux afin qu’elle puisse charger le pouvoir de la mastication. Par conséquent, la mandibule, en particulier la zone ramale ascendante, est généralement utilisée comme site donneur pour obtenir des greffes osseuses autologues dans les chirurgies cranio-maxillo-faciales10. Et dans les chirurgies telles que l’ostéotomie de la branche fendue sagittale mandibulaire et la plastie de réduction de l’angle mandibulaire, des parties de l’os cortical et spongieux mandibulaire doivent être retirées pour obtenir un contour facial agréable. Ces os spongieux jetés pourraient être une ressource potentielle pour les hMSC. Cependant, peu d’études publiées ont décrit le protocole permettant d’isoler rapidement et de cultiver des CSM de haute qualité dérivées de la moelle osseuse mandibulaire humaine (HMBsC).

La présente étude utilise une méthode modifiée d’adhérence de la moelle osseuse entière afin d’introduire un protocole fiable et reproductible pour l’isolement et la culture des hmBMSC. Et les cellules souches ont été identifiées par immunophénotypage cytométrique en flux des CSM, tests de prolifération et induction de différenciation multilignée. L’application de cette procédure standard pourrait aider les chercheurs à obtenir des CSM de haute qualité dérivées de la moelle osseuse mandibulaire humaine, ce qui est important dans les études ultérieures de la fonction biologique, des effets microenvironnementaux et des applications cliniques.

Protocole

La procédure de prélèvement d’échantillons d’os mandibulaires humains a été approuvée par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de la quatrième université de médecine militaire. L’étude a suivi les lignes directrices éthiques de la Déclaration d’Helsinki de 1975. Tous les donateurs de la présente étude ont été informés des risques possibles et des objectifs de l’étude. L’âge des donneurs variait entre 18 et 40 ans, et il n’y avait pas de préjugés sexistes. Le consentement écrit a été obtenu de tous les participants humains.

1. Préparation à l’opération

  1. Sélectionnez le donateur approprié.
    1. Sélectionnez comme donneurs les patients qui prévoient de subir des interventions chirurgicales telles qu’un recul mandibulaire après une ostéotomie de la branche sagittale fendue et une plastie de réduction de l’angle mandibulaire.
  2. Préparez la solution de conservation.
    1. Compléter 30 ml de solution saline tampon phosphate (1x PBS) avec 1 % de pénicilline et de streptomycine dans un tube à centrifuger stérile et sans enzyme de 50 ml la veille de la chirurgie. Conservez-le au réfrigérateur à 4 °C.
    2. Le jour de l’opération, mettez le tube de centrifugation avec la solution de conservation dans une glacière et conservez-le dans la salle d’opération 1 h avant l’opération.
  3. Stérilisez les instruments pour isoler la moelle osseuse la veille de l’opération, y compris les ciseaux, les pinces à épiler et les couteaux à 120 °C et à une pression de 0,27 MPa pendant 20 min.
  4. Préparez le milieu de culture α-MEM en mélangeant le milieu essentiel minimum alpha (α-MEM) avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline et de streptomycine.
  5. Préparez un milieu de différenciation ostéogénique en mélangeant un milieu de culture α-MEM avec 50 mM d’acide ascorbique, 10 mM de phosphate de β-glycérol et 0,1 mM de dexaméthasone (voir le tableau des matériaux).
  6. Préparez le milieu de différenciation adipogénique A en mélangeant le milieu de culture α-MEM avec 1 mM de dexaméthasone, 0,2 mM d’indométacine, 10 μg/mL d’insuline et 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (voir le tableau des matériaux).
  7. Préparez le milieu de différenciation adipogénique B en mélangeant le milieu de culture α-MEM avec 10 μg/mL d’insuline.
  8. Préparez le milieu de différenciation chondrogénique en mélangeant le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose (HG-DMEM) et 100 nM de dexaméthasone, 100 g/mL de pyruvate de sodium, 25 mg/mL de vitamine C, 40 mg/mL de proline, 10 ng/mL de TGF-β3 et 1 % d’ITS (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Le milieu de différenciation ostéogénique, adipogène et chondrogénique peut être préparé en interne, comme mentionné ci-dessus. Cependant, des kits disponibles dans le commerce pour la même chose ont été utilisés (voir la table des matériaux) dans la présente étude.

2. Prélèvement d’un échantillon d’os mandibulaire humain

  1. Avant la chirurgie, étudiez attentivement les images tomographiques informatisées tridimensionnelles et la planification de la simulation chirurgicale des donneurs (Figure 1).
  2. Sélectionnez le site mandibulaire que le donneur prévoit d’enlever lors d’une intervention chirurgicale et qui est riche en os spongieux avec de la moelle osseuse comme site donneur.
  3. Désinfectez et drapez le patient avant de l’opérer.
  4. Réséquez le site donneur sélectionné de la mandibule à l’aide de la lame d’ostéotome à ultrasons (voir tableau des matériaux), en évitant les lésions du nerf alvéolaire inférieur et les lésions osseuses du donneur.
  5. Placez les échantillons d’os mandibulaire dans la solution de conservation (étape 1.2) dès que possible.
  6. Placez la solution de conservation avec les échantillons d’os dans une glacière jusqu’à ce que l’isolement des CSM commence en laboratoire.
    REMARQUE : L’isolement des CSM doit être commencé le plus tôt possible après la récolte afin de préserver la viabilité des cellules. Si l’isolement des CSM ne peut pas être effectué immédiatement, la solution de conservation avec des échantillons d’os peut être stockée dans une glacière ou réfrigérée à 4 °C pendant un maximum de 2 h.

3. Isolement et culture de mBMSC humaines

  1. Sortez les échantillons d’os de la solution de conservation et trempez-les dans 1x PBS avec 1 % de pénicilline et de streptomycine pendant 5 min sur un banc propre de l’armoire à flux laminaire.
    REMARQUE : Cette étape vise à éliminer le caillot sanguin et les fluides buccaux résiduels et à éliminer davantage le micro-organisme, car la bouche n’est pas un environnement complètement stérile. Avant l’isolement et la culture des cellules, lavez-vous et désinfectez-vous les mains avec de l’alcool et portez des gants et des masques stériles jetables.
  2. Nettoyez les tissus mous adhérents et la tache de sang à la surface de l’os à l’aide d’une gaze humide stérile.
  3. Remplissez une boîte de culture stérile de 6 cm avec 5 ml de milieu de culture α-MEM.
  4. Mettez l’os dans la boîte de culture stérile et coupez-le en petits morceaux (près de 2-3 mm3 volumes) avec un couteau ou des ciseaux stérilisés.
    REMARQUE : Tenez les échantillons d’os avec une pince à épiler pour éviter de vous couper le doigt.
  5. Aspirer le milieu de culture α-MEM dans la boîte de culture à l’aide d’une seringue stérile jetable de 1 ml.
  6. Insérez l’aiguille de la seringue avec le milieu de culture α-MEM profondément dans la cavité de la moelle osseuse des morceaux d’échantillon d’os spongieux.
  7. Rincer la moelle osseuse dans la boîte de culture avec la seringue de tous les côtés des morceaux d’échantillon d’os, au moins 5 à 10 fois de chaque côté.
  8. Répétez les étapes 3.5 à 3.7 jusqu’à ce que tous les morceaux d’échantillon d’os deviennent d’un blanc pur pour s’assurer que la plus grande quantité de moelle osseuse soit rincée dans le milieu de culture.
    REMARQUE : Le temps total de fonctionnement des étapes ci-dessus de 3.1 à 3.8 doit être contrôlé dans les 30 minutes sur glace.
  9. Retirez et jetez tous les morceaux d’échantillon d’os à l’aide d’une pince à épiler. Éliminez les autres petits fragments à l’aide d’un filtre cellulaire de 70 μm de pores.
  10. Secouez doucement la boîte de culture pour que les cellules rincées soient uniformément réparties.
  11. Placez la boîte de culture dans un incubateur cellulaire et cultivez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.
  12. Le troisième jour de culture, vérifiez la morphologie cellulaire et l’état de croissance au microscope optique. Retirer la moitié du milieu de culture sans cellules adhérentes ni fragments de tissu ; ajouter 3 ml de milieu de culture frais α-MEM.
  13. Au 7e jour de culture, retirer tout le milieu de culture et ajouter 5 ml de milieu de culture α-MEM frais.
  14. Ensuite, rafraîchissez le milieu de culture α-MEM tous les 3 jours.
  15. Vérifiez la morphologie et la croissance des cellules tous les jours.
    REMARQUE : Lorsque les cultures cellulaires primaires (P0) atteignent 70 %-80 % de confluence après 7-10 jours de culture, effectuez le passage cellulaire.

4. Passage cellulaire

  1. À 70 % à 80 % de confluence, retirer tout le milieu de culture des cellules P0. Lavez doucement le plat de culture avec 1x PBS deux fois pour nettoyer le milieu de culture résiduel.
  2. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % avec 0,02 % d’EDTA dans la boîte de culture pour digérer les cellules. Secouez doucement le plat de culture pour vous assurer que la trypsine est uniformément répartie. Placez la coupelle de culture à 37 °C pendant 3 min.
  3. Vérifiez les cellules au microscope. Lorsque 70 à 80 % des cellules sont contractées et arrondies, ajoutez 2 ml de milieu de culture α-MEM pour arrêter la réaction digestive.
  4. Soufflez doucement plusieurs fois sur la surface de la parabole avec une pipette pour souffler les cellules.
  5. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension avec un milieu de culture α-MEM. Semez les cellules P0 dans des flacons de culture (25 cm) pour l’expansion avec un rapport de séparation de 1:2. Les premières cellules de passage ont été appelées cellules P1.
  7. Lorsque les cellules P1 atteignent 70 % à 80 % de confluence, répétez le passage cellulaire en suivant les étapes de 4.1 à 4,6. Les cellules de deuxième génération ont été appelées cellules P2.
  8. Modifiez le rapport de division de l’expansion à 1:3 après le passage de la cellule de troisième génération.
  9. Utilisez des cellules P3 à P5 pour mener des expériences d’identification.

5. Analyse par cytométrie en flux

  1. Digestion des CSM P3 à P5 en utilisant 0,25 % de trypsine et 0,02 % d’EDTA, en suivant les étapes 4.1 à 4.5.
  2. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1x PBS à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
  3. Transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugation avec 100 μL de suspension cellulaire par tube.
  4. Ajoutez des anticorps monoclonaux anti-humains de souris immunomarqués dans les tubes de la microcentrifugeuse.
    REMARQUE : Pour la présente étude, des anticorps conjugués à la phycoérythrine (PE) contre CD45, des anticorps conjugués à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) contre CD90, CD34 et CD44 ontété utilisés 4,11 (voir le tableau des matériaux), et les dilutions des anticorps étaient toutes de 1:100. Les dilutions des anticorps doivent suivre les instructions du fabricant. PBS sera servi de contrôle.
  5. Incuber les anticorps et le contrôle PBS à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min.
  6. Centrifugez les tubes à 800 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez la suspension et remettez les cellules en suspension dans 0,5 mL de 1x PBS. Répétez cette étape deux fois.
  7. Chargez les tubes dans le cytomètre en flux (voir Tableau des matériaux). Comptez le nombre de cellules marquées par fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux avec un minimum de 10 000 événements.
    REMARQUE : Il est préférable de commencer le processus de numération cellulaire du cytomètre en flux immédiatement après la procédure de marquage par immunofluorescence. Si ce n’est pas le cas, les cellules doivent être fixées dans du paraformaldéhyde à 1 %, stockées à 4 °C dans l’obscurité, et terminer le processus dans les 24 heures.

6. Essai de prolifération cellulaire

  1. Utilisez des cellules P3 pour effectuer le test de prolifération cellulaire. Digestion des CSM P3 avec 0,25 % de trypsine, en suivant les étapes 4.1 à 4.5.
  2. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension avec un milieu de culture α-MEM.
  3. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ensemencez les cellules sur des plaques de culture à 96 puits à une densité de 3 x 103 cellules par puits, soit un total de 35 puits, 5 puits pour chaque jour de comptage (au jour 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Rafraîchir le milieu de culture des cellules tous les 3 jours.
  4. À chaque jour de comptage, jetez le milieu de culture α-MEM des cinq puits pour le jour du comptage, puis ajoutez 100 μL de milieu de culture et 10 μL de solution CCK-8 (voir le tableau des matériaux). Incuber à 37 °C pendant 1 h.
  5. Placez les plaques de culture dans un spectrophotomètre à microplaques (voir Tableau des matériaux) et mesurez la valeur de densité optique de cinq puits pour chaque jour de comptage (soit un total de 7 jours de comptage) à une longueur d’onde de 450 nm. Utilisez cinq puits du milieu de culture sans cellules comme blancs.
  6. Enregistrez la valeur de densité optique de chaque puits, calculez la valeur moyenne et l’écart-type de cinq puits pour chaque jour de comptage, et tracez la courbe de croissance cellulaire 5,12.

7. Différenciation multilignée

  1. Effectuez l’induction de la différenciation ostéogénique en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Digérez les cellules P3 avec de la trypsine en suivant les étapes 4.1 à 4.5. Ensemencez les cellules à 2 x 105 cellules/cm2 dans une plaque à 6 puits. Ajouter 2,5 ml de milieu de culture α-MEM par puits.
    2. Lorsque les cellules atteignent 60 % à 70 % de confluence, changez le milieu de culture en milieu d’induction ostéogénique (étape 1.5). Ensuite, changez le milieu d’induction tous les 3 jours.
    3. Vérifiez les cellules au microscope tous les 3 jours après l’induction. Observer la morphologie cellulaire et rechercher des nœuds de minéralisation évidents.
    4. Après 7 jours d’induction, effectuez la coloration à la phosphatase alcaline (ALP) pour évaluer la calcification des cellules.
    5. Utilisez 1x PBS pour laver les cellules deux fois en douceur. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde pour fixer les cellules à température ambiante pendant 30 min. Ensuite, utilisez 1x PBS pour laver les cellules deux fois.
    6. Ajouter la solution de coloration ALP (voir le tableau des matériaux) et incuber à température ambiante pendant 10 min.
      REMARQUE : Différents types de solution de coloration ALP peuvent colorer les cellules avec différentes couleurs, telles que le gris foncé, le rouge et le bleu. Dans ce protocole, les cellules étaient colorées en bleu. Le temps d’incubation peut être prolongé si la couleur de la coloration n’est pas évidente. Certains kits de coloration en solution ALP peuvent être toxiques ; Lisez attentivement les instructions avant utilisation, portez des gants et un masque pendant l’expérience et lavez-vous soigneusement les mains après utilisation.
    7. Lavez les cellules avec de l’eau pour arrêter la réaction de coloration ALP. Observez les granules pigmentés bleus dans les cellules au microscope optique et capturez les photos. Utilisez le logiciel Image J pour analyser quantitativement le degré de coloration.
    8. Effectuer une coloration au rouge d’alizarine (voir Tableau des matériaux) pour évaluer la capacité de minéralisation des cellules.
      REMARQUE : La formation évidente de nœuds de minéralisation des cellules différenciées peut généralement être observée après 21 jours d’induction.
    9. Utilisez 1x PBS pour laver les cellules deux fois en douceur. Ensuite, ajoutez 4 % de paraformaldéhyde pour fixer les cellules à température ambiante pendant 30 min.
    10. Lavez les cellules avec 1x PBS deux fois, ajoutez une solution de coloration rouge d’alizarine à 0,1 % (voir le tableau des matériaux) et incubez pendant 20 min. Encore une fois, lavez deux fois les cellules avec 1x PBS.
    11. Observez les nodules rouges parmi les cellules fixées au microscope optique, indiquant les dépôts de calcium de la différenciation ostéogénique des cellules cultivées, et capturez les photos.
    12. Pour quantifier la quantité de rouge d’alizarine, ajoutez 10 % de chlorure de cétylpyridinium (CPC, voir le tableau des matériaux) aux cellules colorées au rouge d’alizarine et incubez à température ambiante pendant 30 min.
    13. Aspirez 50 μL de la solution CPC et mesurez la densité optique (DO) à une longueur d’onde de 540 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques.
  2. Effectuer l’induction de la différenciation adipogénique.
    1. Ensemencez les cellules P3 dans une plaque à 6 puits en suivant la procédure décrite ci-dessus (étape 7.1).
    2. Lorsque les cellules ont une confluence de 80 % à 90 %, changez le milieu de culture en milieu de différenciation adipogénique A (étape 1.6).
    3. Incuber les cellules avec le milieu de différenciation adipogénique A à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 3 jours.
    4. Changez le milieu d’induction en milieu de différenciation adipogénique B (étape 1.7) et incubez pendant 1 jour.
    5. Changez le milieu pour revenir au milieu de différenciation adipogénique A et incubez pendant 3 jours. Ensuite, remplacez par le moyen B pendant 1 jour. Répétez ce cycle 3 à 5 fois jusqu’à ce que les gouttelettes de lipides soient visibles au microscope.
      REMARQUE : Les gouttelettes lipidiques peuvent être observées environ 21 jours après l’induction.
    6. Utilisez le milieu de différenciation adipogénique B pour cultiver les cellules pendant 7 jours supplémentaires ; Ensuite, de grosses gouttelettes de lipides rondes peuvent être observées au microscope. Rafraîchissez le medium B tous les 3 jours.
    7. Retirez le milieu d’induction et utilisez 1x PBS pour laver doucement les cellules. Ensuite, ajoutez 4 % de paraformaldéhyde pour fixer les cellules à température ambiante pendant 10 min.
    8. Lavez les cellules avec 1x PBS deux fois ; ensuite, incuber les cellules avec une solution de coloration au rouge d’huile O (1 mL par puits, voir le tableau des matériaux) pendant 15 min. Encore une fois, lavez deux fois les cellules avec 1x PBS.
    9. Placez les cellules sous un microscope et observez les gouttelettes lipidiques rouges pour évaluer l’adipogenèse des cellules différenciées.
  3. Effectuer l’induction de différenciation chondrogénique.
    1. Digérer et transférer les cellules P3 dans un tube à centrifuger de 15 mL avec un nombre de cellules de 5 x 105.
    2. Centrifugez le tube à 250 x g pendant 4 min à température ambiante. Jetez le surnageant en transvasant soigneusement la solution supérieure.
    3. Ajoutez 0,5 mL de milieu de différenciation chondrogénique (étape 1.8) dans le tube pour remettre les cellules en suspension, et centrifugez à nouveau le tube à 150 x g pendant 5 min à température ambiante. Répétez cette étape deux fois.
    4. Desserrez le capuchon du tube de centrifugation pour faciliter l’échange d’air. Placez le tube dans l’incubateur et induisez les cellules avec 0,5 mL de milieu de différenciation chondrogénique à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.
    5. Gardez le tube de centrifugation stable sans le retirer ou le secouer dans les 24 ou 48 heures, jusqu’à ce que les cellules commencent à granuler. Agitez le bas du tube de centrifugation pour suspendre la pastille de cellule dans le milieu de différenciation (étape 1.5).
    6. Renouveler le milieu de différenciation chondrogénique à l’aide d’une pipette tous les 3 jours. Évitez d’aspirer la pastille cellulaire.
    7. Induire les cellules au moins pendant 21 jours jusqu’à ce que la pastille s’accumule à un diamètre de 2 mm.
    8. Lavez le granulé avec 1x PBS et fixez-le avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 30 min. Après déshydratation et incorporation de la paraffine13, sectionner la pastille d’une épaisseur de 3 μm à l’aide d’un microtome (voir tableau des matériaux).
    9. Placez les sections sur des diapositives en verre. Colorer les lames avec une solution de bleu d’Alcian (voir tableau des matériaux) pendant 1 h à 37 °C. Lavez les lames tachées à l’eau. Placez les lames sous un microscope optique et prenez des photos du mucopolysaccharide acide coloré en bleu indiquant les tissus cartilagineux.

Résultats

Un échantillon d’os mandibulaire a été prélevé avec succès sur le patient. Et le temps entre la coupe avec la lame d’ostéotome à ultrasons et le placement du fragment d’os dans le tube de centrifugation est d’environ 5 minutes. Aucune des complications potentielles ne s’est produite pendant et après la procédure de résection, y compris des lésions du nerf alvéolaire inférieur ou de la racine dentaire, une infection, une rupture vasculaire et un saignement, une lésion de la muqueuse, une fracture osseuse accidentelle, etc. Les hmBMSC ont été cultivés, passés et différenciés avec succès sans contamination.

Dans la présente étude, de nombreuses cellules adhérentes ont été observées au microscope le troisième jour après la culture initiale. Le septième jour, la plupart des cellules adhérentes étaient déjà attachées à la boîte de culture. Normalement, les cellules cultivées ont atteint une confluence de 70 à 80 % après 7 à 9 jours de culture initiale. Après le passage, on pensait généralement que les cellules P3 étaient des CSM purifiées, qui présentaient une morphologie en forme de fuseau, adhérente au plastique et semblable à celle d’un fibroblaste (Figure 2). Et les expériences d’identification ont été menées dans des cellules P3 à P5. Dans le cadre d’un test de prolifération cellulaire, le taux de croissance cellulaire a augmenté rapidement à partir du troisième jour de culture, et le taux accru a ralenti le jour 6 (Figure 2).

Selon la définition donnée par la Société internationale de thérapie cellulaire, les CSM ont une expression positive et négative de molécules de surface particulières. Dans cette étude, l’analyse cytométrique en flux des cellules de culture a montré une expression positive de CD44, CD90 et une expression négative de CD45, CD34, ce qui est cohérent avec la définition 4,11 (Figure 3). Dans les expériences de capacité de différenciation multilignée, les cellules cultivées ont montré une forte capacité de différenciation ostéogénique, adipogène et chondrogénique. Après 7 jours d’induction ostéogénique, le dépôt de calcium de la matrice extracellulaire est apparu au microscope. Après 21 jours d’induction ostéogénique, les cellules cultivées ont montré des nœuds de minéralisation évidents, et les nœuds ont été colorés en rouge avec une coloration en rouge d’alizarine (Figure 4). Pour l’adipogenèse, de nombreuses gouttelettes lipidiques rondes accumulées colorées en rouge par coloration Oil-Red-O ont été observées dans le cytoplasme après 21 jours d’induction adipogénique (Figure 4). Après 21 jours d’induction de la différenciation chondrogénique, les lames de la pastille cellulaire montrant un tissu cartilagineux avec une lacune cartilagineuse peuvent être colorées en bleu (Figure 4).

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Figure 1 : Sélection du site donneur sur une image CT 3D. (A) Image CT 3D de la mandibule du donneur d’une patiente de 21 ans. (B) Simulation chirurgicale de l’ostéotomie bilatérale de la mandibule sagittale. (C) La planification chirurgicale montre le recul d’une mandibule fendue. (D) Image CT 3D montrant l’os cortical (la partie translucide), l’os spongieux riche en moelle osseuse et le nerf alvéolaire inférieur (rouge) basé sur différentes valeurs CT, qui peut guider les chirurgiens dans la sélection du site donneur et éviter les lésions nerveuses. Des éclats d’os spongieux ont été récoltés dans la région dans le rectangle noir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Morphologie microscopique et courbe de croissance des cellules souches de moelle osseuse dérivées de la mandibule humaine P3 (hmBMSC). (A-C) Morphologie fusiforme, adhérente au plastique et semblable à un fibroblaste des hmBMSC P3 (barre d’échelle = 200 μm, 100 μm, 50 μm pour A, B, C, respectivement). (D) La courbe de croissance cellulaire a montré que le taux de croissance des hmBMSC augmentait rapidement à partir du troisième jour de culture et que le taux d’augmentation ralentissait le sixième jour de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : L’expression de l’antigène de surface cellulaire sur les hmBMSC a été détectée par cytométrie en flux. L’analyse par cytométrie en flux a montré que les hmBMSC étaient négatifs pour CD45 (A) et CD44 (C), positifs pour CD44 (B) et CD90 (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Différenciation ostéogénique, adipogène et chondrogénique des hmBMSC. (A) Coloration ALP des hmBMSC après 7 jours de culture sans induction de différenciation ostéogénique (barre d’échelle = 100 μm). (B) Coloration ALP des hmBMSC après 7 jours d’induction de la différenciation ostéogénique (barre d’échelle = 100 μm). (C) Résultats quantitatifs de la coloration ALP de la zone positive (***P < 0,001). (D) Coloration au rouge d’alizarine des hmBMSC sans différenciation ostéogénique (barre d’échelle = 100 μm). (E) La formation de nœuds de minéralisation évidents peut être observée après 21 jours de différenciation ostéogénique des hmBMSC, et elle peut être colorée en rouge avec une coloration au rouge d’alizarine (barre d’échelle = 100 μm). (F) Résultats quantitatifs de la coloration au rouge d’alizarine (***P < 0,001). (G) Coloration O rouge d’huile des hmBMSC sans différenciation adipogénique (barre d’échelle = 50 μm) ; (H) Des gouttelettes lipidiques rondes ont été observées après 21 jours de différenciation adipogénique des hmBMSC, et les gouttelettes lipidiques ont été colorées en rouge avec une coloration O rouge d’huile (barre d’échelle = 50 μm). (I) La coloration au bleu d’Alcian était positive après 21 jours d’induction de la différenciation chondrogénique (barre d’échelle = 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Récemment, la thérapie hMSCs s’est révélée très prometteuse dans la régénération des tissus et le traitement de nombreuses maladies réfractaires, telles que les maladies dysfonctionnement immunitaire, les maladies hématologiques systémiques, les cancers ou les traumatismes, dans de nombreux essais cliniques 1,14,15,16,17. Parmi les diverses sources de CSM, la moelle osseuse reste la source la plus largement utilisée et la plus facilement accessible. Nous avons utilisé des puces osseuses spongieuses mandibulaires humaines pour cultiver avec succès des BMSC en utilisant la méthode d’adhérence de la moelle osseuse entière décrite dans le présent protocole. À ce jour, il existe quatre approches principales pour isoler les cellules souches de la moelle osseuse, notamment la méthode d’adhérence de la moelle osseuse entière, la méthode de centrifugation par gradient de densité, la méthode de tri cellulaire fluorescent et la méthode de tri cellulaire activée magnétiquement10. La méthode d’adhérence de la moelle osseuse est simple, facile à utiliser, bon marché et peut obtenir de grandes quantités de cellules adhérentes. Cependant, la limitation de cette méthode était la faible pureté des BMSC cultivées primaires, qui étaient mélangées à des cellules hématopoïétiques et à des fibroblastes. Après avoir rafraîchi régulièrement le milieu de culture des cellules primaires, les cellules hématopoïétiques non adhérentes ont été éliminées avec le milieu jeté. De plus, les fibroblastes peuvent être éliminés par le passage cellulaire, et les cellules P3 étaient des BMSC hautement purifiés. Ainsi, les cellules P0 à P2 ne peuvent pas être utilisées pour la thérapie cellulaire, ce qui signifie qu’il a fallu plus de temps pour purifier les cellules souches. En utilisant des méthodes de tri cellulaire fluorescent et de tri cellulaire activée magnétiquement, on peut obtenir des BMSC plus purifiés, tandis que les deux méthodes sont coûteuses et qu’un long temps de sélection peut nuire à la viabilité cellulaire11. Pour prouver que les cellules cultivées étaient des CSM, nous nous sommes référés à la définition des CSM humaines proposée par le Comité des cellules souches mésenchymateuses et tissulaires de la Société internationale de thérapie cellulaire, qui incluait le caractère adhérent plastique, l’expression positive et négative de certains phénotypes, tels que CD45, CD90 et ainsi de suite, et la capacité de différenciation multilignée18.

Dans la plupart des études, les fémurs et la crête iliaque étaient les principales sources de BMSC, par rapport aux os maxillo-faciaux, tels que la mandibule et le maxillaire 9,16. Cependant, la théorie des caractéristiques spécifiques au site des hBMSC dans des études récentes a montré que les hBMSC de différents os avaient des caractères différents en termes de capacité de différenciation, d’activité proliférative, d’ostéogenèse et d’immunité 6,8. La différence spécifique au site peut être liée à des origines embryologiques différentes, à l’adaptation aux exigences fonctionnelles de chaque site squelettique, au microenvironnement, à l’approvisionnement vasculaire local, aux effets hormonaux, etc. De plus, des études ont montré que l’os iliaque greffé présentait une perte verticale plus rapide que l’os de la mâchoire dans les 6 mois suivant la greffe osseuse8. Sinon, des études ont montré que l’activité proliférative des CSM de la moelle mandibulaire était supérieure à celle de la moelle iliaque 5,8,19,20. Et cette différence d’activité proliférative a été attribuée aux caractères que la mandibule avait plus d’apport sanguin et un taux de renouvellement osseux plus rapide que l’ilium 5,6,8. Des études ont également révélé que les BMSC de la mandibule exprimaient un niveau plus élevé de Runx-2 et d’OCN que ceux des fémurs, et que la capacité ostéogénique des BMSC de la mandibule était égale ou supérieure à celle des fémurs et de l’ilium 5,19,21. L’adhérence à la capacité titanique des hmBMSC s’est également avérée plus forte que celle des HMBscs des fémurs, ce qui suggère que les hmBMSC étaient plus appropriées pour être utilisées en implantologie orale5. De plus, une étude clinique de 3 ans visant à reconstruire le défaut alvéolaire a révélé que l’os régénéré des CSM à partir de la pulpe dentaire était composé d’un os entièrement compact avec une densité matricielle plus élevée, tandis que les BMSC hm régénéraient l’os spongieux similaire à la structure osseuse alvéolaire humaine normale22. En conclusion, les hmBMSC étaient des cellules souches thérapeutiques idéales pour la régénération maxillo-faciale et d’autres maladies en raison de la même origine embryologique et de leurs caractéristiques supérieures.

Cependant, la mandibule a moins de moelle osseuse que les fémurs et l’ilium, il est donc important d’obtenir suffisamment de moelle osseuse et de BMSC à partir de la mandibule pour un usage clinique. Les chercheurs ont également utilisé les aspirations mandibulaires pour obtenir des CSM, tandis que le rendement initial des CSM à partir des aspirations mandibulaires était trois fois inférieur à celui des aspirations iliaques21. Des incisions supplémentaires ont été nécessaires pour recueillir suffisamment d’aspirations de moelle mandibulaire, ajoutant un traumatisme chirurgical supplémentaire. De plus, des études ont montré que le potentiel prolifératif des CSM provenant des éclats d’os de la mandibule peut être supérieur à celui des aspirations de moelle mandibulaire 8,21. Par conséquent, dans cette étude, les éclats d’os spongieux de la mandibule jetés ont été utilisés pour isoler les CSM. Parce que les deux côtés de la mandibule ont été inclus dans l’ostéotomie de la branche fendue sagittale ou la plastie de réduction de l’angle mandibulaire, nous pouvons obtenir suffisamment de moelle mandibulaire des patients sans aucun dommage supplémentaire. Récemment, la technologie assistée par ordinateur a été largement utilisée en chirurgie buccale et maxillo-faciale pour améliorer l’effet chirurgical et réduire les complications chirurgicales23. Pour éviter de lécher la mandibule et le nerf lors du prélèvement de la moelle osseuse de la mandibule, l’image CT 3D de la mandibule des donneurs a été obtenue, et la planification chirurgicale des donneurs a été analysée pour décider des sites donneurs et mettre en œuvre une simulation chirurgicale dans l’étude ; Ainsi, aucune des complications chirurgicales ne s’est produite. La lame d’ostéotome à ultrasons, un dispositif spécifique aux tissus permettant aux chirurgiens de faire des ostéotomies précises tout en protégeant les tissus mous adjacents24, a également été utilisée pour éviter les lésions des tissus mous et préserver l’activité de la moelle osseuse obtenue.

En résumé, cette étude a décrit un protocole fiable, simple, sûr et peu coûteux pour isoler et cultiver des CSM mandibulaires humaines adéquates, qui peuvent être utilisées dans les thérapies cellulaires des tissus dentaires et maxillo-faciaux.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L’étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81903249) et le Programme de recherche fondamentale en sciences naturelles de la province du Shaanxi (n° 2019JQ-701, n° 2022JZ-50).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % ParaformaldéhydePlantChemMedPC-00005
Milieu de différenciation adipogéniqueOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90031
Solution de bleu d’alcianOriCell, Cyagen BiosciencesALCB-10001
AlcoolMackline809056
Solution de coloration rouge d’alizarineSolarbioG1452
Solution de coloration ALPBeijing ComWin Biotech Co., Ltd.
AutoclaveALP Co., Ltd., JaponCL-40L
CCK-8 solutionYeasen Biotech Co., Ltd.40203ES80
Filtre à cellules (70 &mu ; taille des pores)BD Biosciences352350
Incubateur de cellulesThermo Fisher Scientific41334177
CentrifugeuseEppendorf5805ZP761456
Tube à centrifuger (50 mL, 15 mL)Sangon BiotechF600888-9001
Chlorure de cétylpyridiniumAladdinH108696
Milieu de différenciation de la chondrogenèseOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90041
Banc propre/Armoire à flux laminaireBIOBASEBBS-DDS00030
Plat de culture (6 cm)Thermo150462
Flacons de culture (25 cm)Thermo156367
Plaques de culture (96 puits, 6 puits)Corning-Costar352350
Gants et masques stériles jetablesSangon BiotechF516018-9001 ; F516038-9001
Seringue stérile jetable (1 mL)Shaanxi longkangxin Medical Instrument Co., Ltd1.00009E+11
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose (HG-DMEM)HycloneSH30022.01B
EDTASolarbioE8040-500g
Sérum fœtal bovin (FBS)PlantChemMedPC-00001
Cytomètreen flux Beckman CoulterEPICS XL
Anticorps monoclonal anti-humain monoclonal de souris conjugué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) contre CD34Biolegend343503
Anticorps monoclonal anti-humain de souris conjugué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) contre CD44Biolegend338804
anticorps monoclonal anti-humain conjugué à la souris à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) contre CD90Biolegend328108
HémocytomètreKoraba30119480698
IceboxSangon BiotechF615002-0001
Image J softwareNational Institute of Mental Health
Microscope optiqueOLYMPUSIX71-2L20944
Tubes à centrifugerSangon BiotechF601620-0010
Spectrophotomètre à microplaquesBioTek-EPOCH259091
MicrotomeFeica1003001
Mimics logicielMaterialise
Minimum essential medium alpha (&alpha ;-MEM)HycloneSH30265.01
Solution de coloration O rouge d’huileSolarbioG1261
Milieu de différenciation ostéogéniqueOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMA-90021
Pénicilline et streptomycinePlantChemMedPC-86115
Tampon phosphate salin (PBS)PlantChemMedPC-00003
Anticorps monoclonal anti-humain de souris conjugué à la phycoérythrine (PE) contre CD45Biolegend304008
PipetteSORFA
ProPlan CMF 3.0Materialise
Ciseaux, pinces à épiler et couteauxShanghai Jinzhong Surgical instrument Co., LtdZJA030,YAA110,J11010
Gaze humide stérileHENAN PIAOAN GROUP Co., Ltd
TrypsinGibco17075029
Lame d’ostéotome à ultrasonsStryker InstrumentsTél. : 5450-815-107
CW0051S320511

Références

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Mots-clés

CSM de la moelle osseusemoelle osseuse mandibulaireisolement de cellules souchesculture de cellules souchesimmunoph notypagediff renciation ost og niquediff renciation adipog niquediff renciation chondrog niquecellules souches maxillofaciales
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