Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Isolement des préadipocytes à partir d’embryons de poussins de poulet de chair

2.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/63861

⸱

4 août 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, University of Tennessee

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode simple pour isoler les préadipocytes du tissu adipeux dans les embryons de poulets de chair. Cette méthode permet l’isolement avec un rendement élevé, la culture primaire et la différenciation adipogénique des préadipocytes. La coloration à l’huile Red O et la coloration lipidique/ADN ont mesuré la capacité adipogénique des cellules isolées induites par des milieux de différenciation.

Résumé

Les préadipocytes primaires sont un système expérimental précieux pour comprendre les voies moléculaires qui contrôlent la différenciation et le métabolisme des adipocytaires. Les embryons de poulet offrent la possibilité d’isoler les préadipocytes dès le stade le plus précoce du développement adipeux. Cette cellule primaire peut être utilisée pour identifier les facteurs influençant la prolifération des préadipoocytes et la différenciation adipogénique, ce qui en fait un modèle précieux pour les études liées à l’obésité infantile et au contrôle des dépôts de graisse excessifs chez la volaille. La croissance rapide du tissu adipeux postnatal gaspille efficacement les aliments en les allouant loin de la croissance musculaire chez les poulets de chair. Par conséquent, les méthodes permettant de comprendre les premiers stades du développement du tissu adipeux peuvent fournir des indices pour réguler cette tendance et identifier des moyens de limiter l’expansion adipeuse tôt dans la vie. La présente étude a été conçue pour développer une méthode efficace d’isolement, de culture primaire et de différenciation adipogénique des préadipocytes isolés du développement du tissu adipeux d’embryons de poussins de poulets de chair commerciaux (type viande). La procédure a été optimisée pour produire des cellules avec une viabilité élevée (~ 98%) et une capacité accrue à se différencier en adipocytes matures. Cette méthode simple d’isolement, de culture et de différenciation des préadipocytes embryonnaires soutient les analyses fonctionnelles de la croissance et du développement des graisses au début de la vie.

Introduction

L’obésité est une menace pour la santé mondiale des adultes et des enfants. Les enfants en surpoids ou obèses sont environ cinq fois plus susceptibles d’être obèses à l’âge adulte, ce qui les expose à un risque considérablement accru de maladie cardiovasculaire, de diabète et de nombreuses autres comorbidités. Environ 13,4% des enfants américains âgés de 2 à 5 ans souffrent d’obésité1, ce qui illustre que la tendance à accumuler un excès de graisse corporelle peut être déclenchée très tôt dans la vie. Pour des raisons très différentes, l’accumulation d’excès de tissu adipeux est une préoccupation pour les poulets de chair (type viande). Les poulets de chair modernes sont incroyablement efficaces, mais accumulent toujours plus de lipides que ce qui est physiologiquement nécessaire 2,3. Cette tendance commence peu de temps après l’éclosion et gaspille efficacement les aliments, le composant de production le plus coûteux, en les allouant loin de la croissance musculaire. Par conséquent, tant pour les enfants que pour les poulets de chair, bien que pour des raisons très différentes, il est nécessaire de comprendre les facteurs qui influencent le développement du tissu adipeux et d’identifier des moyens de limiter l’expansion adipeuse tôt dans la vie.

Les adipocytes se forment à partir de préadipocytes, des cellules souches dérivées du tissu adipeux qui subissent une différenciation pour développer des cellules graisseuses matures stockant les lipides. En conséquence, les préadipocytes in vitro sont un modèle expérimental précieux pour les études sur l’obésité. Ces cellules, isolées de la fraction vasculaire stromale des dépôts adipeux, peuvent fournir une compréhension fondamentale des voies moléculaires contrôlant la différenciation et le métabolisme des adipocytaires 4,5. Les embryons de poussins sont un modèle expérimental favorable dans les études de développement, car la culture des œufs selon le calendrier souhaité facilite la manipulation expérimentale, car elle permet d’obtenir des embryons sans le sacrifice de la mère pour observer une série de stades de développement des embryons. De plus, des procédures chirurgicales compliquées et de longues périodes de temps ne sont pas nécessaires pour obtenir des embryons par rapport à des modèles animaux plus grands. Par conséquent, l’embryon de poussin présente une opportunité d’obtenir des préadipocytes dès les premiers stades du développement du tissu adipeux. Le tissu adipeux sous-cutané devient visible chez le poussin vers le jour embryonnaire 12 (E12) comme un dépôt clairement défini situé autour de la cuisse. Ce dépôt est enrichi en préadipocytes hautement prolifératifs qui subissent activement une différenciation sous les signaux de développement pour former des adipocytes matures 6,7. Le processus de différenciation adipogène est comparable entre les poulets et les humains. Par conséquent, les préadipocytes isolés à partir d’embryons de poussins peuvent être utilisés comme modèle à double usage pour des études pertinentes pour les humains et la volaille. Cependant, le rendement des préadipocytes diminue avec le vieillissement à mesure que les cellules se développent en adipocytes matures5.

Le présent protocole optimise l’isolement des préadipocytes du tissu adipeux au cours du stade (E16-E18) auquel la différenciation adipogénique et l’hypertrophie adipocytaire sont à leur apogée chez les embryons de poussins de poulet de chair8. Cette procédure peut évaluer les effets des facteurs auxquels l’embryon en développement est exposé in ovo, tels que le régime alimentaire de la poule, sur le développement des adipocytes et le potentiel adipogène ex vivo. Il peut également tester l’impact de diverses manipulations (par exemple, l’hypoxie, les ajouts de nutriments, les agonistes pharmacologiques et les antagonistes) sur l’adipogenèse ou les divers 'omes (par exemple, transcriptome, métabolome, méthylome) des progéniteurs adipocytaires. En tant que représentation du stade le plus précoce de la formation adipeuse, les cellules obtenues à l’aide de ce protocole sont des modèles précieux pour les études pertinentes pour la volaille et les humains.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Tennessee. Des œufs de poulet de chair commerciaux fraîchement fécondés (Cobb 500) ont été obtenus dans un couvoir local. Les œufs ont été incubés à 38 °C avec une humidité relative de 60 % jusqu’à dissection aux jours embryonnaires 16-18 (E16-E18). Le tissu adipeux a été prélevé dans le dépôt sous-cutané (fémoral).

1. Préparation à l’isolement et à la culture

  1. Préparez la culture et les instruments.
    1. Avant de commencer les dissections, installez une zone de travail dans la hotte à écoulement laminaire. Désinfectez la zone de travail et tous les instruments en tamponnant avec de l’éthanol à 70%. Effectuer toutes les procédures en utilisant des matériaux stériles.
      REMARQUE: Toujours écouvillonner les récipients et les instruments avec de l’éthanol à 70% avant de les replacer dans la hotte de culture cellulaire. Il est recommandé de placer un stérilisateur d’instruments de paillasse dans le capot afin que les instruments puissent être facilement stérilisés entre les embryons.
      ATTENTION: Lorsque vous utilisez un stérilisateur d’instrument, refroidissez correctement l’instrument chaud pour éviter les brûlures et les lésions tissulaires. Un temps de refroidissement minimum de 3 min est recommandé. Écouvillon avec de l’éthanol à 70% avant utilisation.
    2. Assemblez les instruments et récipients suivants dans le capot: pinces droites (120 mm), pinces à épiler (110 mm), deux paires de pinces incurvées (100 mm), deux paires de ciseaux droits (140 mm), ciseaux chirurgicaux incurvés (115 mm), passoire à tissu (maille en nylon de 250 μm), crépine à cellules (maille en nylon de 40 μm), tubes centrifuges coniques (15 mL et 50 mL), boîtes de Petri (60 mm et 100 mm), petit bécher (100 mL), pulvérisation d’éthanol à 70 % et gaze stérile, serviette en papier et essuie-glace de paillasse (voir tableau des matériaux).
  2. Préparez la solution enzymatique, les supports de collecte et les supports de culture en suivant les étapes ci-dessous.
    REMARQUE: Préparer les solutions à l’avance et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Les supports doivent être placés sur de la glace avant le prélèvement de tissus. Tous les réactifs utilisés à cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
    1. Préparer les milieux utilisés à la fois pour la collecte du tissu adipeux et la préparation de la solution enzymatique en complétant le DMEM/F12 (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 2,50 mM de L-glutamine et 15 mM de tampon HEPES) avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1x pénicilline/streptomycine (P/S), 100 U/mL. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: Ce support reste stable pendant 1 an lorsqu’il est stocké à 4 ° C.
    2. Préparer la solution de stérilisation en diluant la bétadine à 20 % (v/v) dans 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate ayant un pH de 7,4, sans rouge de calcium, de magnésium ou de phénol) avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: La solution est stable pendant 2 ans lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.
    3. Préparer une solution enzymatique en dissolvant la collagénase de type 1 (1 mg/mL) dans du DMEM/F12 avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1x P/S (étape 1.2.1). Faites une solution de collagénase fraîche et maintenez-la sur de la glace pendant les dissections. Environ 10 min avant utilisation, préchauffer en incubant cette solution à 37 °C au bain-marie pour initier son activité enzymatique.
      REMARQUE: Environ 1 mL de solution de collagénase (1 mg / mL) est nécessaire pour 100 mg de tissu adipeux.
    4. Préparer les milieux de croissance utilisés pour le placage et la propagation en complétant les milieux DMEM/F12 avec 1x P/S et 10% FBS. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: La solution est stable pendant 1 an lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.
    5. Préparer la solution de lavage en complétant 1x PBS avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B. Ajuster la solution au pH souhaité de 7,4. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: La solution est stable pendant 2 ans lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.

2. Collecte et digestion des tissus adipeux

  1. Euthanasier l’embryon.
    1. Le jour embryonnaire 16, retirez les œufs de l’incubateur. La principale source potentielle de contamination microbienne est la surface de l’œuf; par conséquent, écouvillonnez les œufs avec une gaze stérile imbibée d’éthanol à 70% avant de les craquer. Après l’écouvillonnage, placez l’œuf verticalement avec l’extrémité pointue vers le bas sur un petit bécher (100 ml) tapissé d’essuie-tout pour amortir l’œuf du verre.
    2. À l’aide de la poignée de la pince, cassez un œuf en tapotant l’extrémité émoussée de l’œuf. Retirez soigneusement la coquille d’œuf pour créer une ouverture suffisamment grande pour retirer l’embryon (étape 2.1.3). Déchirez doucement la membrane blanche de la coquille pour exposer l’embryon (Figure 1A). Percer soigneusement l’amnion à l’aide d’une pince à épiler stérile (Figure 1B).
      REMARQUE: Le sac amniotique est une membrane transparente remplie de liquide amniotique qui entoure l’embryon.
    3. Retirez l’embryon de l’œuf en saisissant légèrement le cou de l’embryon à l’aide d’une pince droite. Coupez le sac vitellin pour le déconnecter de l’embryon et transférez l’embryon dans une boîte de Petri de 100 mm.
    4. Décapiter immédiatement à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces.
  2. Effectuer la collecte de tissu adipeux.
    1. Écouvillonnez le corps de l’embryon avec 70% d’éthanol et frottez doucement la surface de la peau avec une gaze stérile pour enlever les plumes, car elles peuvent interférer avec la filtration à des étapes ultérieures après la digestion. Utilisez des essuie-glaces de paillasse pour empêcher la peau et les plumes de toucher les tissus collectés.
    2. Coupez la peau entre les jambes et la région abdominale pour révéler la paire de dépôts adipeux fémoraux.
    3. Tenez la peau autour de la jambe à l’aide d’une pince incurvée d’une seule main. Retirez doucement la graisse sous-cutanée fémorale avec l’autre main, à l’aide d’une pince incurvée pour éloigner doucement le dépôt de la jambe.
      REMARQUE: Il y a relativement peu de tissu conjonctif qui adhère au coussinet adipeux à la jambe, et l’ensemble du coussinet adipeux doit être amovible en une seule pièce en utilisant uniquement des pinces. Cela peut être facilité en maintenant la pince vers l’arrière afin que les parties incurvées (plutôt que les extrémités) serrent le coussinet de graisse pour l’enlever.
      1. Si nécessaire, coupez le tampon de graisse avec des ciseaux incurvés. Répétez avec l’autre coussinet de graisse et des embryons supplémentaires au besoin.
        REMARQUE: Un total de 80 mg de graisse sous-cutanée peut être obtenu à partir de la plupart des embryons à E16 (Figure 1C). Cela donne généralement ~ 1 x 106 cellules, suffisant pour plaquer une fiole T-25. Il pourrait être utile à cette étape de peser les coussinets de graisse de quelques embryons pour évaluer la quantité de matière première, car le poids des coussinets de graisse peut varier d’une lignée de poulets de chair spécifique et en raison de facteurs incontrôlables, tels que l’âge et le régime alimentaire des poules reproductrices. La graisse sous-cutanée était systématiquement prélevée sur cinq œufs afin d’assurer un rendement adéquat en cellules pour le placage dans plusieurs flacons.
    4. Transférer les tissus dans environ 5 mL de milieux de collecte dans un tube de 15 mL et répéter la dissection pour les œufs restants.
    5. Rincez brièvement les coussinets de graisse collectés en les transférant dans une boîte de Petri de 60 mm contenant une solution de stérilisation et en faisant tourbillonner le plat plusieurs fois.
    6. Rincez la solution de stérilisation en transférant les tampons graisseux dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 1x PBS. Tourbillonnez doucement. Répétez cette étape en transférant dans une deuxième boîte de Petri de 60 mm contenant 1x PBS.
  3. Effectuez la digestion enzymatique et l’isolement des préadipocytes en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Transférer les tissus adipeux dans un tube de 15 mL contenant environ 1 mL de solution enzymatique préchauffée pour 100 mg de tissu. Immerger une paire de longs ciseaux droits dans le tube et hacher finement les tissus adipeux de la solution en aussi petits morceaux que possible (~1 mm3) (Figure 2A).
      REMARQUE: Le rendement cellulaire sera réduit si les tissus ne sont pas complètement hachés.
    2. Transférer le tissu haché et la solution enzymatique dans une fiole autoclavée de 25 mL. Envelopper la fiole avec un film de paraffine. Placer sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur et agiter à 37 °C pendant l’étape de digestion.
      REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un bain-marie secouant. Avec l’une ou l’autre approche, la vitesse doit être suffisante pour empêcher les morceaux de tissu de se déposer au fond de la fiole, mais ne doit pas être si rapide que les morceaux sont propulsés vers le haut de la fiole et collent au verre, ou que le liquide s’accumule sur le couvercle du film de paraffine.
    3. Après ~30 min, couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 mL à un diamètre d’environ 3 mm. Pipettez le mélange de tissus de haut en bas plusieurs fois pour aider à libérer les cellules du tissu adipeux. Remettre la fiole dans l’incubateur/bain-marie et reprendre l’agitation.
    4. Après 15 minutes supplémentaires, vérifiez l’exhaustivité de la digestion dans la fiole. Après avoir retiré la fiole du shaker, une couche de cellules blanchâtres se formera au sommet de la couche de liquide. S’il reste encore des fragments de tissu, coupez l’extrémité d’une autre pointe de pipette et pipettez doucement le mélange de haut en bas, puis continuez à agiter pendant 15 minutes supplémentaires.
      REMARQUE: Le mélange de tissus / collagénases complètement digéré ressemble à du chyme laiteux. En règle générale, les tissus sont suffisamment digérés après 1 h de secousses douces. S’il reste de nombreux fragments à ce stade, cela peut indiquer un problème avec l’enzyme collagénase utilisée. Une secousse constante peut augmenter le rendement; cependant, une exposition prolongée à l’enzyme et le stress physique peuvent également endommager les cellules.
    5. Après la digestion, pipetter doucement de haut en bas pour bien mélanger. Filtrer à travers une passoire tissulaire de 250 μm dans un tube de 15 mL par pipetage pour éliminer les morceaux de tissu non digéré et les débris.
      1. Rincez la fiole avec 4 mL de milieu de croissance par pipetage pour éliminer les cellules qui peuvent adhérer au verre et filtrez dans le même tube de 15 mL. Rincez la passoire avec un milieu de croissance supplémentaire par pipetage pour desserrer les cellules piégées, jusqu’à un volume total de 14 mL.
    6. Pastillez la fraction cellulaire par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à RT (7 min pour un tube de 50 mL).
      REMARQUE: Toujours écouvillonner les tubes avec 70% d’éthanol avant de retourner à la hotte de culture cellulaire.
    7. Aspirer le surnageant. Veillez à ne pas déloger la pastille de cellule. Remettre doucement la pastille dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir Tableau des matériaux) en pipetant de haut en bas, et incuber pendant 5 min à TA. La solution deviendra rougeâtre à mesure que les globules rouges seront lysés (Figure 2B).
      REMARQUE: Placez le tampon de lyse RBC à RT avant utilisation. Les poulets ont nucléé les globules rouges9, et ils se fixent à des boîtes de culture tissulaire avec des préadipocytes. Le tampon de lyse RBC est utilisé pour lyser ces cellules afin d’éviter qu’elles n’interfèrent avec un nombre précis de cellules.
    8. Ajouter 5 mL de milieu de croissance au tube contenant les cellules pour diluer le tampon de lyse et mélanger doucement en pipetant de haut en bas. À l’aide d’une pipette, filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube de 50 mL et rincer la crépine avec 5 mL supplémentaires de milieu de croissance.
    9. Cellules à granulés par centrifugation à 300 x g pendant 7 min à RT. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule restante dans 1 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas.
      1. Utilisez un hémocytomètre, un compteur de cellules et une coloration Trypan Blue pour compter les cellules et déterminer la viabilité cellulaire. Prélever 10 μL d’échantillon et mélanger avec 10 μL de Trypan Blue par pipetage. Chargez 10 μL du mélange sur l’hématocytomètre et mesurez10.
        REMARQUE: Les vitesses de centrifugation peuvent être augmentées à 600 x g si suffisamment de pastilles de cellules ne sont pas facilement visibles après la rotation initiale.

3. Ensemencement et culture de préadipocytes

  1. Semez ~1 x 106 cellules dans 4 mL de milieu de croissance préchauffé dans une fiole T-25. Suivez la même densité de placage si vous utilisez d’autres types de récipients de culture. Placer dans l’incubateur de culture tissulaire et laisser s’attacher pendant la nuit.
    REMARQUE: Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 38 ° C avec une atmosphère humidifiée de 5% de CO2. La température optimale pour la croissance des cellules aviaires11 est de 38 °C, et elles se développent lentement à 37 °C.
  2. Le lendemain, aspirez les milieux et lavez doucement les cellules avec 1x PBS par pipetage pour éliminer les cellules non attachées ou mortes. Remplacer par 4 mL de milieux de croissance frais. Vérifiez les cellules au microscope. Les cellules doivent être de forme filiforme, comme des fibroblastes (Figure 2A).
    REMARQUE: En règle générale, les préadipocytes se fixent assez rapidement (en quelques heures). Le succès ou l’échec de l’isolement cellulaire peut être confirmé à ce moment (après 24 h).
  3. Remplacer par 4 mL de milieux de croissance frais tous les 2 jours et sous-cultiver ou cryoconserver les cellules lorsqu’elles atteignent une confluence de 70 % à 80 % (figure 3C).

4. Subculturation et cryoconservation

  1. Aspirer les vieux milieux et laver doucement les cellules avec 4 mL de 1x PBS par pipetage. Aspirer le PBS, ajouter 2 mL de trypsine à 0,1 % pour couvrir la surface cellulaire dans une fiole T-25 (ajuster le volume en conséquence pour les autres récipients de culture), puis incuber pendant 3-4 min à 38 °C.
    REMARQUE: Observez si les cellules sont détachées de la plaque de culture. Tapotez doucement la plaque de culture pour faciliter le détachement cellulaire. L’incubation de cellules avec de la trypsine pendant trop longtemps endommagera les cellules.
  2. Ajouter un volume équivalent de milieu de croissance préchauffé pour inhiber la réaction de la trypsine. Pipette sur la surface de la cellule plusieurs fois, en inclinant la plaque pour desserrer les cellules restantes.
  3. Transférer la suspension de la cellule dans un tube de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à RT (7 min pour un tube de 50 mL). Aspirer le surnageant.
  4. En cas de sous-culture, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas. Compter les cellules comme décrit à l’étape 2.3.9.1, puis recoller en utilisant la même densité de placage que celle utilisée initialement à l’étape 3.1.
  5. En cas de cryoconservation, préparer 4 mL de milieu de congélation pour une fiole T-25 avec une confluence de 90 %.
    REMARQUE : Le support de congélation se compose de 10 % de DMSO, de 30 % de FBS et de 60 % de DMEM/F12.
  6. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu de congélation et transférer 1 mL de milieu de congélation dans un produit cryovial. Congelez lentement les cryoviales jusqu’à -1 °C/min à l’aide d’un récipient de congélation. Placez le récipient dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit, puis transférez-le dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
    REMARQUE: Les préadipocytes correctement cryoconservés maintiennent leur viabilité pendant au moins 3 ans et fonctionnent généralement comme des cellules fraîchement isolées lorsqu’ils sont décongelés et plaqués.

5. Différenciation adipogénique

REMARQUE: Des plaques revêtues de gélatine à 2% peuvent être utilisées pour améliorer l’adhérence des cellules.

  1. Préparer une solution de gélatine à 2 % (p/v) (voir tableau des matériaux) dans de l’eau distillée. Autoclave à 121 °C, 15 psi pendant 30 min pour stériliser. Surface de culture enrobée avec 5-10 μL de solution de gélatine/cm2 (c.-à-d. 100-200 μg/cm2). Tourbillonnez doucement pour recouvrir uniformément la surface.
  2. Vérifiez les plaques pour un étalement uniforme de la solution de gélatine, car certaines régions peuvent rester non revêtues au départ. Laisser la plaque enduite de gélatine rester à RT pendant au moins 1 h. Retirer tout le volume de solution de gélatine des puits.
    REMARQUE: Cela laissera une fine couche de gélatine au fond des puits / plats. La solution de gélatine peut être réutilisée plusieurs fois (au moins 10 fois) sans altérer l’adhérence et la croissance des cellules. Laissez les plats enduits de gélatine rester dans la hotte de culture tissulaire pendant au moins 30 minutes avant de plaquer les cellules.
  3. Induire les préadipocytes de poulet à subir une différenciation adipogénique en complétant les milieux de croissance avec des acides gras. Pour préparer un milieu de différenciation adipogène (SMA), complétez le DMEM/F12 avec 10 % de sérum de poulet, 1x acide linoléique-acide oléique-albumine (9,4 μg/mL) et 1x P/S (voir tableau des matériaux). Rendre ADM frais et chaud avant utilisation.
    REMARQUE: Les préadipocytes de poulet sont généralement induits à subir une différenciation adipogène en complétant les milieux avec des acides gras plutôt que des cocktails hormonaux généralement utilisés pour les adipocytes d’autres espèces12.
  4. Induire la différenciation en remplaçant les milieux de croissance par des milieux de différenciation adipogéniques lorsque les cellules atteignent environ 90% de confluence. Maintenir les cellules dans ce milieu, en les remplaçant tous les 2 jours. Évaluez visuellement la différenciation au microscope (20x) en fonction de la formation de gouttelettes lipidiques, qui deviennent facilement visibles dans les 48 heures suivant l’induction de la différenciation.

6. Évaluation de l’adipogenèse

  1. Effectuez la coloration Oil Red O en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Plaquez les cellules dans une plaque à six puits et induisez une différenciation adipogène à ~ 90% de confluence.
    2. Préparez une solution de travail d’Huile Rouge O en combinant six parties de la solution mère Huile Rouge O avec quatre parties d’eau distillée dans un tube de 50 mL. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas et laisser reposer pendant 10 min à TA, puis filtrer à travers un papier filtre de grade 1 (voir Tableau des matériaux) à l’intérieur de l’entonnoir en versant lentement la solution dans un tube de 50 mL.
      REMARQUE: La solution mère d’huile Red O est obtenue en dissolvant 0,7 g d’huile Rouge O (voir tableau des matériaux) dans 200 mL d’isopropanol à 100% dans une bouteille autoclavée. Bien mélanger et laisser reposer pendant 20 min. Conserver à 4 °C et tenir à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation. Ceci est stable pendant 1 an. La solution de travail peut être utilisée pendant 3 h; cependant, il est recommandé de l’utiliser dans les 2 h.
    3. Retirez le média et lavez doucement les puits deux fois avec 2 mL de PBS préchauffé 1x à l’aide d’une pipette. Retirez complètement le PBS en le faisant sauter. Fixez les cellules avec 2 mL de formol tamponné à 10% et enveloppez la plaque avec un film de paraffine. Laisser à TA pendant au moins 1 h et jusqu’à 2 jours avant la coloration.
      REMARQUE: Pour obtenir 1 L de solution de formol tamponnée à 10 %, mélanger 100 mL de formaldéhyde à 37 %, 4,09 g de NaH2PO4, 6,5 g de Na2HPO4 (voir tableau des matériaux) et 900 mL d’eau distillée. Ne pas pipeter le formol directement sur les cellules. Distribuer doucement sur le flanc près du fond du puits.
    4. Retirer le formol et laver doucement les puits avec 2 mL d’eau distillée. Remplacer par 2 mL d’isopropanol à 60 %. Après 5 min, retirez l’isopropanol et laissez les puits sécher complètement pendant environ 10 min. Effectuez toutes les étapes de coloration à RT.
    5. Ajouter 1 mL de solution de travail Oil Red O aux cellules et incuber pendant 10 à 20 min à TA. Enlever la tache en pipetant et laver cinq fois en trempant dans l’eau du robinet jusqu’à ce qu’aucun excès de tache ne soit visible. Après le rinçage final, ajoutez 1 mL d’eau aux cellules avant de visualiser la coloration et de recueillir des images au microscope.
    6. Pour quantifier l’accumulation de lipides par plat, retirez l’eau et extrayez le colorant Oil Red O des cellules en ajoutant 1 à 2 mL d’isopropanol à 100% qui est suffisant pour recouvrir complètement les cellules d’une plaque de six puits. Incuber en secouant doucement sur un agitateur à plaque pendant 10 min à RT.
    7. Transférer 200 μL de l’extraction dans un puits de la plaque d’essai de 96 puits. Quantifier la quantité relative de tache à l’aide d’un lecteur de plaque spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance à 495 nm.
  2. Effectuer le test de coloration des gouttelettes lipidiques intracellulaires et du noyau.
    1. Les cellules de plaque dans les plaques noires de fond de 96 puits et induisent une différenciation adipogène comme décrit à l’étape 5.3.
    2. Pour colorer les cellules, ajouter 200 μL de la solution de coloration contenant une coloration lipidique fluorescente et une coloration fluorescente de l’ADN (voir tableau des matériaux) dans 1x PBS par puits. Après avoir calculé le volume total de la tache nécessaire, ajouter deux gouttes de la tache d’ADN et 25 μL de la tache lipidique par mL de PBS préchauffé 1x à l’aide d’un tube enveloppé de papier d’aluminium pour protéger la solution de la lumière. Incuber à RT pendant 20 min et protéger de la lumière.
    3. Lisez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes (voir Tableau des matériaux). Détecter la tache lipidique (Excitation: 485 nm / Émission: 572 nm) à l’aide d’un filtre rouge et la tache d’ADN (Excitation: 359 nm / Emission: 450 nm) à travers un filtre bleu / cyan.
      REMARQUE: La coloration peut également être visualisée et les images capturées sous un microscope fluorescent.
    4. Normaliser les intensités de coloration lipidique par rapport aux intensités de coloration de l’ADN pour quantifier l’accumulation de lipides par rapport à la cellule numéro13.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les préadipocytes primaires sont morphologiquement similaires aux fibroblastes, avec des formes irrégulières en forme d’étoile et un noyau central (Figure 2A-C). Les cellules adhèrent facilement au plastique de culture tissulaire et commencent à proliférer peu de temps après la fixation. Ils se différencient et accumulent rapidement des gouttelettes lipidiques (Figure 3D) lorsqu’ils sont fournis avec des acides gras dans le mili...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Bien que plusieurs protocoles bien décrits aient rapporté l’isolement des préadipocytes 14,15,16,17, l’isolement des préadipocytes embryonnaires a été optimisé, ce qui peut être utilisé pour les analyses fonctionnelles de la croissance et du développement des graisses au début de la vie chez les poussins de poulet de chair. Ce protocole produit des progéniteurs adipocytaires embryonnaires à hau...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient UT AgResearch et le Département des sciences animales d’avoir soutenu et optimisé ce protocole. Ce travail a été financé par une subvention de l’USDA.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pipette de 1 mLEppendorfZ683825Pipette monocanal, 100 - 1000 & micro ; L
1 mL Pointe de pipetteFisher Scientific02-707-402
100 % isopropanolFisher ScientificA426P4
1x PBSGibco10010023
25 mL FlaconPyrex4980-25
37 % FormaldéhydeFisher ScientificF75P-1GAL
Plaque 6 puitsFalcon353046
Plaque d’essai 96 puitsCostar3632
Plaque 96 puits, fond noirCostar3603
AdipoRedLonzaPT-7009
Amphotéricine BGibco15290026
Essuie-glace de paillasse (Kimtechwiper)Kimberly-Clark34155
BétadineDebout & Jusqu’àNDC 116730033420 % de solution de travail
Compteur de cellulesCorning6749
Crépine de cellules, 40 & micro ; mSPL93040
CentrifugeEppendorf5702
Sérum de pouletGibco16110082
Tubes à centrifuger coniques, 15 mLVWR10025-690
Tubes à centrifuger coniques, 50 mLFalcon352098
CryovialNunc343958
Pince courbée, 100 mmRoboz SurgicalRS-5137
Ciseaux chirurgicaux incurvés, 115 mmRoboz SurgicalRS-6839
Millipored’eau distilléeSYNSV0000distribué au besoin
DMEM/F12HyCloneSH30023.01
DMSOSigmaD2650
EthanolDecon Labs270170 % Solution de travail
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco10437028
Microscope fluorescentEVOSM7000
Lecteur de plaques fluorescentesBiotekSynergy H1
FeuilleReynoldsReynolds Wrap Feuille d’aluminium robuste, 125 pieds carrés.
Conteneur de congélationThermo Scientific5100-0001
GélatineMillipore4055solution de travail à 2 %
(chambre de comptage)Corning4802000,1 mm de profondeur
Fisher Scientific6845
Stérilisateur d’instrumentsVWRB1205
Acide linoléique-oléique Acide-albumineSigmaL96551x Microscope de solution de travail
EvosAMEX1000
Pipette multicanauxThermo Scientific4661070Pipettes 12 canaux, 30 - 300 µ ; L
Na2HPO4SigmaS-7907
NaH2PO4SigmaS-3139
NucBlueInvitrogenR37605
Oil Red OSigmaO-0625
Orbital ShakerIKAKS130BS1
Serviette en papierTorkRK8002
ParafilmParafilmM PM996
Pénicilline/Steptomycine (P/S)Gibco151401221x Solution de travail
Falcon351029de 100 mm
Agitateurde plaques Falcon 351007de 60 mm
VWR200
RBCRoche11814389001
Réactif ReservorVWR89094-680
Petit bécher, 100 mLSpectrophotomètre Pyrex1000-100
Lecteur de plaquesBiotekSynergy H1
Gaze stérileMcKesson762703
Pince droite, 120 mmRoboz SurgicalRS-4960
Ciseaux droits, 140 mmRoboz SurgicalRS-6762
T-25 FlaskCorning430639traité pour culture tissulaire
Thermo Scientific50144906
Strainer, 250 µ ; mPierce87791
Trypan Blue StainGibco15250061
TrypsinGibco154000540,1 % Solution de travail
Pince à épiler, 110 mmRoboz SurgicalRS-5035
Type 1 CollagénaseGibco17100017
Bain-marieFisher Scientific15-462-10
Papier filtre Whatman Grade 1Whatman1001-110
traitée par culture tissulaire Hématocytomètre de Incubateur de Boîtes de Pétri, Boîtes de Pétri , Incubateur de culture tissulaire

Références

  1. Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
  2. Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
  3. Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
  4. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  5. Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
  6. Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
  7. Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
  8. Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
  9. Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
  10. Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
  11. Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
  12. Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
  13. Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
  15. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
  16. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).
  18. Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
  19. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
  20. Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906(2018).
  21. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Isolement des pr adipocytesembryons de pouletdiff renciation adipog niquetissu adipeuxculture cellulaireaccumulation lipidiqueprolif ration cellulairecoloration au Oil Red Oexpression g niqueviabilit cellulaire
Isolement des préadipocytes à partir d’embryons de poussins de poulet de chair
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.