Article de méthode

Induction d’une inflammation de la surface oculaire et collecte de tissus impliqués

DOI :

10.3791/63890

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4 août 2022

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1Department of Internal Medicine 3-Rheumatology and Immunology, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen, 2Deutsches Zentrum für Immuntherapie, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen

Dans cet article

Résumé

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L’inflammation de la surface oculaire endommage les tissus de la surface oculaire et compromet les fonctions vitales de l’œil. Le présent protocole décrit une méthode pour induire une inflammation oculaire et recueillir des tissus compromis dans un modèle murin de dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les maladies de la surface oculaire comprennent une gamme de troubles qui perturbent les fonctions et les structures de la cornée, de la conjonctive et du réseau de glandes de surface oculaire associé. Les glandes de Meibomius (MG) sécrètent des lipides qui créent une couche de couverture qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal. Les neutrophiles et les pièges à ADN extracellulaire peuplent la MG et la surface oculaire dans un modèle murin de maladie oculaire allergique. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) forment une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire qui obstrue les sorties de MG et conditionne le dysfonctionnement de MG. Ici, une méthode pour induire une inflammation de la surface oculaire et un dysfonctionnement MG est présentée. Les procédures de collecte des organes liés à la surface oculaire, tels que la cornée, la conjonctive et les paupières, sont décrites en détail. En utilisant des techniques établies pour le traitement de chaque organe, les principales caractéristiques morphologiques et histopathologiques du dysfonctionnement MG sont également montrées. Les exsudats oculaires offrent la possibilité d’évaluer l’état inflammatoire de la surface oculaire. Ces procédures permettent d’étudier des interventions anti-inflammatoires topiques et systémiques au niveau préclinique.

Introduction

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Chaque clignement d’œil reconstitue le film lacrymal lisse dispersé sur la cornée. L’épithélium de la surface oculaire facilite la distribution et l’orientation correcte du film lacrymal sur la surface oculaire. Les mucines sont fournies par la cornée et les cellules épithéliales conjonctives pour aider à positionner la partie aqueuse du film lacrymal provenant des glandes lacrymales à la surface des yeux. Enfin, le MG sécrète des lipides qui créent une couche de revêtement qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal 1,2,3. De cette façon, les fonctions coordonnées de tous les organes oculaires protègent la surface oculaire contre les agents pathogènes envahissants ou les blessures et soutiennent une vision cristalline sans douleur ni inconfort.

Dans une surface oculaire saine, la décharge oculaire ou le rheum oculaire balaye la poussière, les cellules épithéliales mortes, les bactéries, le mucus et les cellules immunitaires. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) formulent une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire et incorporent ces composants dans le rhume oculaire. Les TNEG résolvent l’inflammation par la dégradation protéolytique des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines4. Cependant, lorsqu’elles deviennent dysfonctionnelles, ces aggNET aberrantes entraînent la pathogenèse de maladies telles que les occlusions vasculaires dans COVID-195, les calculs biliaires6 et la sialolithiase7. De même, les aggNET sur la surface oculaire jouent un rôle protecteur et contribuent à résoudre l’inflammation de la surface fortement exposée8. Une formation exagérée ou l’absence d’aggNET dans la surface oculaire peut altérer la stabilité du film lacrymal et / ou causer des plaies cornéennes, une conjonctivite cicatrisante et une sécheresse oculaire. Par exemple, l’obstruction de la MG est l’une des principales causes de sécheresse oculaire9. Les AggNET sont également connus pour boucher le flux de sécrétion lipidique des canaux de MG et provoquer un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD). La congestion des orifices MG par les AGGNET provoque un manque de liquide gras enveloppant la surface oculaire et un liquide embouteillé rétrograde, entraînant un dysfonctionnement de la fonction glandulaire et des lésions acineuses. Ce dysfonctionnement peut entraîner l’évaporation du film lacrymal, la fibrose des marges sur les paupières, l’inflammation des yeux et des dommages néfastes au MG10,11.

Plusieurs modèles animaux ont été développés au fil des ans pour imiter le processus pathologique de MGD chez l’homme. Par exemple, des souris C57BL/6 âgées de 1 an ont aidé à étudier les effets liés à l’âge sur la sécheresse oculaire (DED) et la MGD, reflétant la pathologie de la maladie oculaire chez les patients âgés de 50 ans et plus12,13,14. En outre, les lapins sont des modèles appropriés pour étudier les effets des interventions pharmacologiques. Par conséquent, l’induction de MGD chez le lapin a été rapportée soit par l’administration topique d’épinéphrine, soit par l’introduction systémique d’acide 13-cis-rétinoïque (isotrétinoïne)15,16,17,18,19.

Bien que ces modèles animaux aient été adéquats pour déterminer les différents facteurs contribuant à la physiopathologie de la MGD, leur utilisation a été limitée. Par exemple, le modèle murin de MGD liée à l’âge était idéal pour déchiffrer des éléments chez les personnes âgées seulement, et par conséquent, les lapins semblaient être le modèle animal le plus approprié pour étudier les maladies de la surface oculaire, car ils permettent l’étude de multiples mécanismes physiopathologiques. Cependant, en raison du manque d’outils analytiques complets pour détecter les protéines à la surface oculaire et parce que de nombreuses parties du génome du lapin ne sont pas annotées, elles sont limitées pour les recherches20,21.

De plus, ces modèles animaux utilisés pour étudier la pathogenèse de la sécheresse oculaire n’ont pas fourni suffisamment de détails pour analyser le bras immunologique de la maladie qui provoque l’inflammation de la surface oculaire. En conséquence, le modèle murin de MGD développé par Reyes et al. a montré une association entre la maladie oculaire allergique chez la souris et la MGD chez l’homme et a mis en évidence l’étiologie immunitaire responsable de MGD21 obstructif. Ce modèle associe la maladie oculaire allergique à une réponse TH17 qui recrute des neutrophiles à la conjonctive et à la paupière, provoquant MGD et inflammation oculaire chronique21. L’induction de MGD et d’inflammation oculaire dans ce modèle murin est un outil précieux pour étudier les événements en amont lors du développement d’une inflammation locale entraînée par une réponse immunitaire continue21. Le protocole actuel décrit l’inflammation de la surface oculaire accompagnée d’une MGD obstructive. Dans cette méthode, les souris sont immunisées et, après 2 semaines, défiées sur la surface oculaire avec l’immunogène pendant 7 jours. En outre, les étapes pour isoler l’exsudat oculaire et les organes oculaires associés lors de l’inflammation aiguë et de la dissection de la cornée, de la conjonctive et des paupières sont décrites.

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Protocole

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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été menées conformément aux directives institutionnelles sur le bien-être animal et approuvées par la commission du bien-être animal de l’Université Friedrich-Alexander d’Erlangen-Nuremberg (FAU) (numéro de permis: 55.2.2-2532-2-1217). Des souris C57Bl/6 femelles, âgées de 7 à 9 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques avec des cycles jour/nuit de 12 h.

1. Induction de l’inflammation de la surface oculaire murine

  1. Effectuer la préparation immunogène pour l’immunisation.
    1. Préparer l’immunogène fraîchement le jour de l’immunisation, en mélangeant l’ovalbumine (OVU, 50 mg/mL) et la toxine de la coqueluche (100 μg/mL) dans une solution saline et l’adjuvant hydroxyde d’aluminium (40 mg/mL) (voir le tableau des matières) dans une proportion de 1:1.
      ATTENTION : Effectuer l’ouverture, la reconstitution et la préparation immunogénique de la toxine coqueluche dans une enceinte de sécurité laminaire. Portez des vêtements de protection et évitez tout contact avec la peau.
    2. Incuber l’immunogène et le mélange adjuvant à température ambiante pendant 30 minutes et charger 100 μL dans une seringue de 1 mL.
    3. Effectuer une injection intrapéritonéale de la solution immunogène chez une souris non anesthésiée.
      1. Tenez doucement la souris par la queue tout en saisissant la grille de la cage. Tenez fermement la peau du dos et de la région du cou entre le pouce et l’index et fixez la queue et les membres inférieurs entre l’anneau et le petit doigt contre la paume de la main.
      2. Gardez la souris fixe avec sa tête vers le bas.
      3. Injecter 100 μL de la solution d’immunogène préparée dans le quadrant droit ou gauche de la cavité abdominale inférieure.
  2. Effectuer une provocation de la surface oculaire 2 semaines après la vaccination.
    1. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (2,5%).
    2. Appliquer 5 μL d’OVA (50 mg/mL) ou de solution saline (0,9 % NaCl) par œil sur les deux yeux et attendre que la goutte soit absorbée par l’œil. Cela prend ~5 min.
    3. Répétez la procédure 1x par jour pendant 7 jours.
      NOTE: L’administration topique de médicaments peut se faire de la même manière.

2. Collecte d’exsudats oculaires

  1. Récupérer les exsudats oculaires formés pendant la phase de provocation en appliquant 50 μL de solution saline stérile sur l’œil immédiatement après la provocation.
  2. Pour obtenir une suspension unicellulaire, traiter la décharge oculaire recueillie avec de la MNase recombinante (2 x 106 gel U/mL, voir tableau des matières) contenant le cofacteur calcium (5 mM) à 37 °C pendant 20 min.
  3. Centrifuger à 400 x g pendant 7 min à température ambiante.
  4. Isoler le surnageant et mesurer les cytokines et les chimiokines à l’aide d’ELISA multiplexé conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: Le surnageant obtenu peut être utilisé pour l’analyse des protéines et la pastille pour des tests fonctionnels tels que l’immunophénotypage, la phagocytose, la dégranulation et l’expression génique.

3. Excision des tissus de surface oculaire

  1. Disséquez les paupières et le globe oculaire en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 et luxation cervicale.
    2. Placez la souris sur une surface plane.
    3. Désinfectez la zone orbitaire autour de l’œil avec un écouvillon imprégné d’éthanol à 70%.
    4. Faites une incision entre l’oreille et le sinus rétro-orbitaire et le long de la surface au-dessus de l’os pavimenteux verticalement, en étendant l’incision horizontalement sous la paupière inférieure le long de l’os maxillaire et au-dessus de la paupière supérieure le long de l’os frontal. Cela forme une incision autour de l’œil (Figure 1).
    5. Tenez soigneusement le tissu disséqué autour de l’œil à l’aide d’une pince incurvée et retirez le tissu et le globe oculaire.
    6. Placer les organes excisés dans du PBS stérile.
    7. Couper l’excès de tissu musculaire facial autour des paupières supérieures excisées à l’aide d’un scalpel et sous le stéréomicroscope.
  2. Collectez la conjonctive en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Placez la paupière supérieure sur une boîte de Petri sèche sous le stéréomicroscope.
    2. À l’aide d’une fine pince à épiler et d’un scalpel, décollez très doucement la couche blanchâtre-muqueuse de la surface interne de la paupière.
  3. Ensuite, disséquez la cornée en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Placez le globe oculaire sur une nouvelle boîte de Petri sèche sur de la glace sèche pendant 3 min.
    2. Prenez la boîte de Petri sur la surface du banc dans une position stable.
    3. Faites une petite incision au bord de la cornée à côté du limbe à l’aide de fins ciseaux tranchants.
    4. Prolongez l’incision avec le scalpel autour du globe oculaire, en séparant la sclérotique de la cornée.
    5. Enlevez les restes de l’iris et du cristallin de l’arrière de la cornée en rinçant généreusement avec une solution saline.

4. Documentation de l’obstruction de la glande de Meibomius (MG)

  1. Pour évaluer le MG et ses orifices, placer les paupières excisées en position verticale sous le stéréomicroscope (Figure 2).
  2. Capturez des images avec un éclairage épi à lumière blanche en fonction du temps d’exposition de l’appareil photo et des paramètres ISO.
    NOTE: L’analyse morphométrique de ces images fournit une quantification fiable de la taille du bouchon à la sortie des glandes. La quantification peut être effectuée en décrivant avec l’outil de baguette les bouchons oculaires et en exécutant la commande « Analyser les particules » du logiciel Image J (voir Tableau des matériaux).

5. Transillumination des paupières (morphologie de la glande de Meibomius)

  1. Pour évaluer la zone MG, placez les paupières excisées en position horizontale et allumez le rétroéclairage du stéréomicroscope équipé d’une caméra infrarouge (Figure 3).
  2. Capturez des images en ajustant le temps d’exposition en fonction de l’ISO de l’appareil photo (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: L’imagerie infrarouge de ces paupières transilluminatées au stéréomicroscope peut aider à mesurer la forme et la taille de chaque acini. L’analyse morphométrique de ces images fournit une quantification fiable de la taille et du nombre de MG. La quantification peut être effectuée en décrivant le MG avec l’outil baguette et en exécutant la commande « Analyser les particules » du logiciel Image J.

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Résultats

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Le présent protocole décrit les étapes séquentielles pour établir un modèle murin d’inflammation de la surface oculaire. Les protocoles visent à montrer comment appliquer localement des traitements, obtenir des exsudats oculaires et exciser les organes accessoires associés tels que les paupières saines et enflammées (Figure 2), la cornée et la conjonctive. Une attention particulière doit être accordée lorsque les paupières supérieures sont disséquées pour l’isolement de la conjonctive, et el...

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Discussion

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La sécrétion huileuse des glandes de Meibomius est d’une grande importance pour un œil sain22. Cependant, l’obstruction de ces glandes sébacées par des pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) qui s’alignent sous forme de brins parallèles situés sur les plaques tarsiennes des deux paupières peut perturber le filmlacrymal 23. Cette perturbation entraîne un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD)1 et une évaporation lacrymale...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été partiellement soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, et par la Volkswagen-Stiftung (subvention 97744) à MH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x PBSGibco
Hydroxyde d’aluminiumImject alun Adjuvant7716140 mg/ mL
Concentration finale : in vivo : 1 mg/ 100 µ ; L
C57Bl/6 souris, âgées de 7 ans ; 9 semainesCharles River Laboratories  ;
CalciumCarl rothCN93.11 M
Concentration finale : 5 mM
Pince courbeFST by Dumont SUISSE5/45 11251-35
Ciseaux fins et tranchantsFST Acier inoxydable, Allemagne15001-08
Armoire de sécurité laminaireHerasafe
Appareil photo de macrophotographieCanonEOS6D
(sans filtre IR)NikonD5300
MnaseNew England biolabsM0247S2 x 106 gel U/mL
Kit de dosage à flux multi-analytes (souris personnalisée panneau 13-plex)BiolegendCLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9 % (salin)B.Braun
Ovalbumine (OVA)Endofit, Invivogen9006-59-110 mg/200 & micro ; L dans la
toxine coqueluche saline  ;ThermoFisher Scientific  ;PHZ117450 et micro ; g/ 500 et micro ; L in saline
Concentration finale : in vivo : 100 & micro ; g/ 100 et micro ; L
PetridishGreiner bio-one628160
ScalpelFeather scalpeljetable n° 21  ;Concentration finale : in vivo :  ; 300 ng/ 100 µ ; L
StéréomicroscopeZeissStemi508
Seringue (lavage de la cornée/de l’iris)BD Microlane27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Seringue (immunisation i.p)BD Microlane24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm
Appareil photo macrophotographie

Références

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Mots-clés

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