Ce protocole décrit la chromatographie d’exclusion de taille, une technique facile et reproductible pour enrichir les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis à partir de surnageants de culture.
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Article de méthode
Mycobacterium tuberculosis Enrichissement extracellulaire des vésicules par chromatographie d’exclusion de taille
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans le contexte de l’infection bactérienne est apparu comme une nouvelle voie pour comprendre la physiologie microbienne. Plus précisément, les VE de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jouent un rôle dans l’interaction hôte-pathogène et la réponse au stress environnemental. Les VE MTB sont également très antigéniques et présentent un potentiel en tant que composants du vaccin. La méthode la plus courante pour purifier les véhicules électriques vtt est l’ultracentrifugation par gradient de densité. Ce processus présente plusieurs limites, notamment un faible débit, un faible rendement, une dépendance à l’égard d’équipements coûteux, des défis techniques et peut avoir un impact négatif sur la préparation qui en résulte. La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) est une méthode alternative plus douce qui combat bon nombre des limites de l’ultracentrifugation. Ce protocole démontre que SEC est efficace pour l’enrichissement des vtt EV et produit des préparations Mtb EV de haute qualité avec un rendement accru de manière rapide et évolutive. De plus, une comparaison avec l’ultracentrifugation du gradient de densité par des procédures de quantification et de qualification démontre les avantages de la SEC. Bien que l’évaluation de la quantité de VE (analyse de suivi des nanoparticules), du phénotype (microscopie électronique à transmission) et du contenu (Transfert western) soit adaptée aux véhicules électriques vtt, le flux de travail fourni peut être appliqué à d’autres mycobactéries.
Introduction
La libération de vésicules extracellulaires (VE) par des agents pathogènes peut être la clé pour déverrouiller de nouvelles technologies pour contrôler les maladies infectieuses1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un agent pathogène de grande importance, infectant environ un tiers de la population mondiale et coûtant la vie à des millions de personnes chaque année2. La production de VE par Mtb est bien documentée mais insaisissable dans la biogenèse et les rôles variés (c.-à-d. immunostimulant, immunosuppresseur, acquisition de fer et de nutriments) de ces VE dans le contexte de l’inf....
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Protocole
Le Comité institutionnel de biosécurité de l’Université d’État du Colorado a approuvé la présente étude (19-046B). La culture de Mycobacterium tuberculosis et la récolte de surnageants de culture riches en EV ont été effectuées par du personnel qualifié dans un laboratoire à haut confinement. Les matériaux ont été déplacés hors de la zone de confinement élevé après qu’une méthode d’inactivation valide a été effectuée, confirmée et approuvée par les politiques de biosécurité de l’établissement. Lors de la réplication du protocole, si une méthode d’inactivation ou de filtration stérile validée n’est pas réalisable, les procédures suivantes doivent être effectué....
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Résultats
La protéine de filtrat de culture (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a été concentrée, quantifiée, puis 3 mg de matériau ont été appliqués sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Les concentrations de protéines et de particules ont été dénombrées par BCA et NTA, respectivement. Les fourchettes attendues pour la récupération des protéines et des particules ainsi que les valeurs exactes obtenues pour ces résultats sont indiquées dans le tableau 1. Des valeurs beaucou.......
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Discussion
Les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis sont des réservoirs hautement antigéniques, ce qui les présente comme une avenue attrayante pour le développement d’outils de diagnostic et de futurs vaccins 4,19,20. Historiquement, l’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour séparer les VÉHICULES VTT d’autres matériaux solubles et sécrétés8. Bien que ce processus.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous aimerions remercier le college of veterinary medicine and biomedical sciences Experiential Award et le College Research Council Shared Research Program à NKG et le financement de l’ATCC (prix # 2016-0550-0002) à KMD. Nous tenons également à remercier Anne Simpson pour son soutien technique et BEI Resources, NIAID, NIH pour les réactifs suivants : Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produit in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produit in vitro), NR-49223, et Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produit in vitro), NR-13811.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| Plaque à 96 puits | Corning | 15705-066 | |
| Collecteur de fractions automatique | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Échelle de protéines pré-colorée | Invitrogen | 10748010 | |
| Centrifugeuse de paillasse | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Filtre centrifuge, coupure 100 kDa | Millipore Sigma | UFC710008 | Dispositif d’ultrafiltration utilisé à l’étape 1.1 |
| Système d’électrobuvardage | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldéhyde | Microscopie électronique Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Microscopie électronique Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Chèvre Anti-Souris IgG H& L (phosphatase alcaline), molécule entière, 1 mL | AbCam | ab6790 | Anticorps secondaire |
| JEM-1400 Microscope électronique à transmission | JOEL | ||
| Micro BCA Kit de dosage des protéines | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| microplaques | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (gène Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Anticorps primaire |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gène Rv3763) | Ressources BEI | NR-13792 | Anticorps |
| primaire Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Anticorps primaire |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | Pour le nettoyage plasma de la grille TEM | |
| Nanosight équipé d’une pompe à seringue et d’un ordinateur avec logiciel NanoSight NTA | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Membrane nitrocellulosique, Rouleau, 0.2 &mu ; m | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Saline tamponnée au phosphate, 1X sans calcium ni magnésium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Alimentation | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | Colonne SEC |
| Tampon d’échantillon SDS | Boster | AR1112 | Recette interne utilisée dans cette procédure, mais ce produit est équivalent à |
| la chambre de gel SDS-PAGE | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | protocole interne utilisé dans cette procédure, mais ce kit est équivalent à |
| l’acétate d’uranyle | microscopie électronique Sciences | 22400 |
Références
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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Réimpressions et autorisations
