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Article de méthode

Mycobacterium tuberculosis Enrichissement extracellulaire des vésicules par chromatographie d’exclusion de taille

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DOI :

10.3791/63895

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19 mai 2022

 ,  , 
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la chromatographie d’exclusion de taille, une technique facile et reproductible pour enrichir les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis à partir de surnageants de culture.

Résumé

Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans le contexte de l’infection bactérienne est apparu comme une nouvelle voie pour comprendre la physiologie microbienne. Plus précisément, les VE de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jouent un rôle dans l’interaction hôte-pathogène et la réponse au stress environnemental. Les VE MTB sont également très antigéniques et présentent un potentiel en tant que composants du vaccin. La méthode la plus courante pour purifier les véhicules électriques vtt est l’ultracentrifugation par gradient de densité. Ce processus présente plusieurs limites, notamment un faible débit, un faible rendement, une dépendance à l’égard d’équipements coûteux, des défis techniques et peut avoir un impact négatif sur la préparation qui en résulte. La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) est une méthode alternative plus douce qui combat bon nombre des limites de l’ultracentrifugation. Ce protocole démontre que SEC est efficace pour l’enrichissement des vtt EV et produit des préparations Mtb EV de haute qualité avec un rendement accru de manière rapide et évolutive. De plus, une comparaison avec l’ultracentrifugation du gradient de densité par des procédures de quantification et de qualification démontre les avantages de la SEC. Bien que l’évaluation de la quantité de VE (analyse de suivi des nanoparticules), du phénotype (microscopie électronique à transmission) et du contenu (Transfert western) soit adaptée aux véhicules électriques vtt, le flux de travail fourni peut être appliqué à d’autres mycobactéries.

Introduction

La libération de vésicules extracellulaires (VE) par des agents pathogènes peut être la clé pour déverrouiller de nouvelles technologies pour contrôler les maladies infectieuses1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un agent pathogène de grande importance, infectant environ un tiers de la population mondiale et coûtant la vie à des millions de personnes chaque année2. La production de VE par Mtb est bien documentée mais insaisissable dans la biogenèse et les rôles variés (c.-à-d. immunostimulant, immunosuppresseur, acquisition de fer et de nutriments) de ces VE dans le contexte de l’infection 3,4,5. Les efforts pour comprendre la composition des VE Mtb ont révélé des sphères enveloppées de membrane lipidique de 50 à 150 nm dérivées de la membrane plasmique contenant des lipides et des protéines d’importance immunologique 3,6. L’étude du rôle des VE VTT dans la physiologie bactérienne a révélé l’importance de la modulation bactérienne ev en réponse au stress environnemental pour la survie5. Les études d’interaction hôte-pathogène ont été plus compliquées à interpréter, mais les preuves indiquent que les VE MTB peuvent influencer la réponse immunitaire de l’hôte et peuvent potentiellement servir de composante vaccinale efficace 3,4,7.

Jusqu’à présent, la plupart des études sur les véhicules électriques VTT se sont appuyées sur l’ultracentrifugation par gradient de densité pour l’enrichissement des vésicules8. Cela a été efficace pour les études à petite échelle; cependant, cette technique présente plusieurs défis techniques et logistiques. Des flux de travail alternatifs associent la centrifugation en plusieurs étapes, pour l’élimination des cellules entières et des gros débris, à une étape finale d’ultracentrifugation pour pelleter les véhicules électriques. Cette méthodologie peut varier en efficacité et entraîne souvent un faible rendement et une co-purification des biomolécules solubles non associées aux vésicules tout en ayant un impact sur l’intégrité des vésicules9. De plus, ce processus prend beaucoup de temps, est manuel et son débit est très limité en raison des contraintes de l’équipement.

Le présent protocole décrit une technique alternative à l’ultracentrifugation par gradient de densité : la chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Cette méthode a été démontrée pour les mycobactéries environnementales, et dans les travaux actuels, elle a été extrapolée à Mtb10. Une colonne disponible dans le commerce et un collecteur de fraction automatique peuvent améliorer la cohérence de la préparation vésicale et réduire la nécessité d’un équipement spécifique et coûteux. Il est également possible de compléter ce protocole en une fraction du temps par rapport à l’ultracentrifugation à gradient de densité, ce qui augmente le débit. Cette technique est moins difficile techniquement, ce qui la rend plus facile à maîtriser, et peut augmenter la reproductibilité inter/intra-laboratoire. Enfin, le SEC a une efficacité de séparation élevée et est doux, préservant l’intégrité des vésicules.

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Protocole

Le Comité institutionnel de biosécurité de l’Université d’État du Colorado a approuvé la présente étude (19-046B). La culture de Mycobacterium tuberculosis et la récolte de surnageants de culture riches en EV ont été effectuées par du personnel qualifié dans un laboratoire à haut confinement. Les matériaux ont été déplacés hors de la zone de confinement élevé après qu’une méthode d’inactivation valide a été effectuée, confirmée et approuvée par les politiques de biosécurité de l’établissement. Lors de la réplication du protocole, si une méthode d’inactivation ou de filtration stérile validée n’est pas réalisable, les procédures suivantes doivent être effectuées dans un laboratoire à haut confinement.

1. Préparation du concentré brut Mtb EV

NOTE: Pour les procédures détaillées relatives à la culture du Mtb et à la préparation de la protéine de filtrat de culture (CFP), voir les références11,12. Il est recommandé que les milieux de culture bactérienne soient exempts de suppléments de croissance contenant des composants contenant du VE ou des composants protéiques, tels que l’albumine oléique dextrose catalase (OADC) et de détergents tels que Tween. Il est également recommandé de dépister la qualité de la culture bactérienne et la CFP récoltée afin d’assurer une mort cellulaire et une lyse limitées13,14.

  1. Préparez un filtre centrifuge à coupure de poids moléculaire (MWCO) de 100 kDa (voir tableau des matériaux) en ajoutant la capacité de volume totale de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS). Centrifuger pendant 5 min à 2 800 x g à 4 °C.
    REMARQUE: Si vous utilisez un filtre sans volume d’arrêt mort, il faut veiller à ce que le volume de l’échantillon ne diminue pas en dessous du niveau du filtre, ce qui entraîne un séchage complet du filtre pendant la centrifugation.
  2. Jetez le fluide et tout PBS restant avant de remplir la chambre d’échantillonnage avec Mtb CFP à sa capacité maximale. Centrifuger à 2 800 x g à 4 °C jusqu’à ce que le volume soit réduit au volume minimal du dispositif d’ultrafiltration. Répétez l’opération au besoin, en ajoutant plus de CFP à l’unité jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été suffisamment réduit.
    REMARQUE: Conserver une partie du matériau d’écoulement de 100 kDa (100F) pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.
  3. Ajoutez 1x PBS à l’unité de filtration contenant le concentré jusqu’à la capacité totale de l’appareil. Réduisez le volume comme décrit à la section 1.2. Répétez cette étape cinq fois pour assurer un lavage complet et un échange de tampon.
  4. Récupérer le rétentat CFP concentré de 100 kDa (100R) selon les spécifications du dispositif d’ultrafiltration (voir tableau des matériaux). Une fois le 100R récupéré, lavez le filtre avec un volume minimal de 1x PBS au moins trois fois, et regroupez le lavage avec le 100R pour maximiser la récupération.
  5. Quantifier le matériau 100R avec un test bicinchoninique (BCA) en suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Pour effectuer le test, utilisez plusieurs dilutions d’échantillons 1:2, 1:5 et 1:10 dans PBS. Testez l’échantillon en trois exemplaires.
    REMARQUE: Conservez une partie du matériau 100R pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.

2. Chromatographie d’exclusion de taille pour l’enrichissement des VE Mtb à partir de CFP

REMARQUE: La procédure suivante est spécifique à l’utilisation de 3 mg de CFP 100R Mtb avec colonne SEC et collecteur de fraction automatique (AFC, voir Tableau des matériaux). Il peut être adapté à d’autres concentrations de départ et types de colonnes en suivant les spécifications du fabricant. En outre, il est recommandé aux utilisateurs de lire et de comprendre le manuel d’utilisation du collecteur automatique de fractions.

  1. Laissez la colonne SEC s’équilibrer à la température ambiante.
  2. Allumez l’AFC à l’aide de l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’unité tour et ajustez les paramètres du capteur de pesage, si nécessaire, en appuyant sur SETUP sur l’écran tactile du menu principal. Le capteur de pesage ne doit être étalonné qu’à la première utilisation, après chaque mise à jour logicielle et si une incohérence dans les volumes de collecte de fractions est remarquée.
  3. Dans l’écran SETUP , alignez le carrousel en sélectionnant CAROUSEL > CALIBRATE. Insérez le carrousel avec les 13 petits trous tournés vers le haut dans la tour AFC et ajustez le carrousel de sorte que la buse de fluide soit directement au-dessus de la position de rinçage en appuyant sur les boutons - et / ou + .
  4. Retirez les majuscules de la colonne SEC équilibrée. Faites glisser la colonne SEC dans le support de colonne approprié et installez-la soigneusement sur la tour AFC. Assurez-vous que l’étiquette d’identification par radiofréquence (RFID) sur la colonne fait face à l’AFC et vérifiez que la connexion entre la colonne et la vanne est sécurisée. Placez le tube de sortie des déchets dans un récipient de collecte.
  5. Dans l’écran SETUP , sélectionnez Planification de la collecte et définissez le nombre sur 13 et la taille sur 0,5 mL en appuyant sur les boutons - et/ou + . Laissez le paramètre « Volume de la mémoire tampon » par défaut de 2,7 mL, puis fermez la fenêtre « Planification de la collecte » en appuyant sur X.
  6. Sélectionnez START COLLECTION dans l’écran d’accueil et confirmez les paramètres de collection en sélectionnant OUI. Chargez 13 tubes de microcentrifugation étiquetés de 1,7 mL avec les couvercles ouverts et pointant vers le centre du carrousel.
  7. Avancez l’AFC en sélectionnant OK, puis montez le réservoir de colonne et avancez à nouveau en appuyant sur OK. Sélectionnez l’option permettant de vider la colonne en appuyant sur OUI et ajoutez un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 μm pour supprimer tout tampon de stockage. Une fois le rinçage terminé, avancez l’AFC en appuyant sur OK.
  8. Placez le capot du carrousel sur l’AFC et appuyez sur OK. Préparer un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 μm. Utilisez une pipette pour éliminer tout excès de tampon de la colonne.
  9. Apporter 3 mg d’échantillon 100R tel que quantifié à l’étape 1,5 à 500 μL avec 1x PBS. Ajouter l’échantillon de 3 mg en haut de la colonne. Avancez l’AFC et laissez l’échantillon couler dans la fritte. Une fois que l’échantillon est complètement entré dans la colonne, ajoutez le PBS préparé à l’étape 2.6 au réservoir.
  10. Surveillez l’exécution de l’AFC pendant qu’il collecte d’abord le volume de vide, puis les fractions spécifiées. Une fois la course terminée et le carrousel remis en position de déchet, retirez le couvercle et retirez les tubes de fraction du carrousel. Conserver les fractions à 4 °C avant la quantification (étape 3) et la qualification (étape 4).
  11. Si la colonne doit être réutilisée, sélectionnez l’option permettant de nettoyer la colonne en appuyant sur OUI ; sinon, appuyez sur NON. Suivez les instructions sur l’AFC.
    REMARQUE: Une fois que la colonne est lavée et que le tampon de stockage est passé, il peut être retiré, bouché et stocké à 4 ° C.

3. Quantification des VTT

  1. Mesurez la concentration en protéines pour chaque fraction à l’aide de BCA et de micro BCA12.
    1. Pour les fractions de 0,5 mL prélevées sur 3 mg de 100R Mtb CFP, utilisez le micro BCA avec une dilution de 1:3 pour les fractions numérotées 1-7 de chaque échantillon en triple exemplaire.
    2. Pour les fractions de 0,5 mL numérotées de 5 à 13, utilisez le BCA sans dilution pour chaque échantillon en triple.
      REMARQUE: Le chevauchement des tests pour les fractions 5 à 7 aidera à s’assurer que toutes les fractions ont une sortie lisible.
  2. Quantifiez la concentration de particules pour chaque fraction à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA).
    1. Diluer les échantillons dans 1 mL de 1x PBS en utilisant les rapports de départ suggérés suivants; pour les fractions 1 à 3, utilisez 1:100, puis pour les fractions restantes, utilisez une dilution 1:10.
    2. Vortex les solutions diluées, puis prélever l’échantillon dans une seringue jetable de 1 mL. Placez la seringue dans une pompe à seringue automatique si disponible.
    3. Réglez la pompe à seringue sur 30 μL/min et utilisez les paramètres de capture vidéo avec un gain d’écran de 10-12 et un niveau de caméra de 10-12. Ajustez la mise au point pour chaque échantillon.
    4. Collectez un minimum de trois vidéos à 30 s chacune en utilisant un flux constant.
    5. Effectuez l’analyse avec le seuil de détection logicielle défini sur cinq.
      REMARQUE: Il peut ne pas être possible d’obtenir des données NTA pour les dernières fractions (>7) sans sacrifier un volume d’échantillon significatif.

4. Qualification des véhicules électriques VTT

  1. Visualisez le profil protéique général de chaque fraction à l’aide d’un gel protéique coloré à l’argent.
    REMARQUE : Les procédures détaillées pour la FDS-PAGE et la teinture d’argent se trouvent dans la référence15.
    1. Ajouter un tampon d’échantillon SDS à 10 μL de chaque fraction et 5 μg de CFP, 100R et 100F. Faire bouillir pendant 5 min à 100 °C, puis charger sur un gel Bis-Tris à 4% -12% avec une échelle de poids moléculaire pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) (voir Tableau des matériaux).
    2. Faites fonctionner le gel à l’aide de 1 tampon d’acide 2-[N-morpholino]éthanesulfonique (MES) (voir tableau des matériaux) et d’un courant de 200 V pendant 35 min.
    3. Retirez le gel de la cassette et procédez à la coloration à l’argent15.
  2. Évaluer la présence ou l’absence de marqueurs EV dans chaque fraction par transfert Western.
    REMARQUE : Les procédures détaillées pour le transfert Western se trouvent dans la référence15.
    1. Exécutez un gel SDS-PAGE comme décrit aux étapes 4.1.1 à 4.1.2.
    2. Retirer le gel de la cassette et transférer les protéines résolues dans une membrane de nitrocellulose de 0,2 μm (voir tableau des matériaux) en appliquant un courant de 50 V pendant au moins 1 h.
    3. Effectuer une analyse western blot pour évaluer les protéines d’intérêt. Les anticorps primaires contre la LpqH, le lipoarabinomannane (LAM) et le GroES (voir tableau des matériaux) sont recommandés.
    4. Fractions de pool basées sur la présence ou l’absence de marqueurs applicables à l’application en aval.
  3. Confirmer la présence de vésicules intactes par microscopie électronique à transmission (TEM).
    1. Fixer 15 μL de l’échantillon de vésicule en ajoutant 15 μL de paraformaldéhyde de qualité EM à 4 % et conserver à 4 °C pendant la nuit.
    2. Préparez une grille TEM en cuivre revêtue de carbone de 200 mailles en nettoyant la surface et en fabriquant un substrat hydrophile.
      REMARQUE: Un nettoyage au plasma avec 95% d’argon, 5% d’oxygène et 30% de puissance plasma pendant 1 min est recommandé.
    3. Déposer 10 μL de l’échantillon fixe sur la grille et laisser l’échantillon adhérer pendant 10 min, puis éponger l’excès de liquide avec du papier filtre.
    4. Faites flotter la grille sur une goutte d’eau ultrapure pendant 30 s, puis épongez l’excès de liquide.
    5. Faites flotter la grille sur une goutte d’acétate d’uranyle de qualité d% EM pendant 2 min, puis épongez l’excès de liquide.
    6. Laissez la grille sécher complètement à l’air.
    7. Image utilisant un TEM (voir tableau des matériaux) à 100 kV ou similaire.
      REMARQUE : D’autres méthodes de quantification et de caractérisation des VE devraient être utilisées en fonction des applications en aval. L’Information minimale pour les études des vésicules extracellulaires18 devrait être consultée pour obtenir des lignes directrices afin d’assurer la rigueur et la reproductibilité de toutes les études sur les VE.

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Résultats

La protéine de filtrat de culture (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a été concentrée, quantifiée, puis 3 mg de matériau ont été appliqués sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Les concentrations de protéines et de particules ont été dénombrées par BCA et NTA, respectivement. Les fourchettes attendues pour la récupération des protéines et des particules ainsi que les valeurs exactes obtenues pour ces résultats sont indiquées dans le tableau 1. Des valeurs beaucou...

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Discussion

Les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis sont des réservoirs hautement antigéniques, ce qui les présente comme une avenue attrayante pour le développement d’outils de diagnostic et de futurs vaccins 4,19,20. Historiquement, l’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour séparer les VÉHICULES VTT d’autres matériaux solubles et sécrétés8. Bien que ce processus...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous aimerions remercier le college of veterinary medicine and biomedical sciences Experiential Award et le College Research Council Shared Research Program à NKG et le financement de l’ATCC (prix # 2016-0550-0002) à KMD. Nous tenons également à remercier Anne Simpson pour son soutien technique et BEI Resources, NIAID, NIH pour les réactifs suivants : Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produit in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produit in vitro), NR-49223, et Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produit in vitro), NR-13811.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
20x MES SDS Running BufferThermoFisher ScientificNP0002
Plaque à 96 puitsCorning15705-066
Collecteur de fractions automatiqueIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark Échelle de protéines pré-coloréeInvitrogen10748010
Centrifugeuse de paillasseBeckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - 70 Filtre centrifuge, coupure 100 kDaMillipore SigmaUFC710008Dispositif d’ultrafiltration utilisé à l’étape 1.1
Système d’électrobuvardageThermoFisher Scientific09-528-135
EM Grade ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu GridsMicroscopie électronique SciencesFCF200H-Cu-TA
Chèvre Anti-Souris IgG H& L (phosphatase alcaline), molécule entière, 1 mLAbCamab6790Anticorps secondaire
JEM-1400 Microscope électronique à transmissionJOEL
Micro BCA Kit de dosage des protéinesThermoFisher Scientific23235
microplaquesBIOTEKEpoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (gène Rv3814c)BEI ResourcesNR-49223Anticorps primaire
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gène Rv3763)Ressources BEINR-13792Anticorps
primaire Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35BEI ResourcesNR-13811Anticorps primaire
NanoClean 1070Fischione InstrumentsPour le nettoyage plasma de la grille TEM
Nanosight équipé d’une pompe à seringue et d’un ordinateur avec logiciel NanoSight NTAMalvern PanalyticalNS300
Membrane nitrocellulosique, Rouleau, 0.2 &mu ; mBioRad1620112
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Protein GelsThermoFisher ScientificNP0323BOX
Saline tamponnée au phosphate, 1X sans calcium ni magnésiumCorning21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
PowerPac Basic AlimentationBioRad1645050
qEV Original 35 nm 5/pkIZON ScienceSP5-USDColonne SEC
Tampon d’échantillon SDSBosterAR1112Recette interne utilisée dans cette procédure, mais ce produit est équivalent à
la chambre de gel SDS-PAGEThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
Silver Stain Plus KitBioRad1610449protocole interne utilisé dans cette procédure, mais ce kit est équivalent à
l’acétate d’uranylemicroscopie électronique Sciences22400
Lecteur de et à la

Références

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