Microbroyage à commande numérique par ordinateur d’un dispositif acrylique microfluidique avec restriction échelonnée pour les immunoessais à base de nanoparticules magnétiques

Summary

La microfluidique est un outil puissant pour le développement de tests diagnostiques. Cependant, des équipements et des matériaux coûteux, ainsi que des techniques de fabrication et de manutention laborieuses, sont souvent nécessaires. Ici, nous détaillons le protocole de fabrication d’un dispositif microfluidique acrylique pour les immunoessais magnétiques à base de micro et nanoparticules dans un environnement peu coûteux et simple d’utilisation.

Abstract

Les systèmes microfluidiques ont grandement amélioré les techniques d’immunoessais. Cependant, de nombreuses techniques de microfabrication nécessitent un équipement spécialisé, coûteux ou compliqué, ce qui rend la fabrication coûteuse et incompatible avec la production de masse, ce qui est l’une des conditions préalables les plus importantes pour que les tests au point de service (DPS) soient adoptés dans les milieux à faibles ressources. Ce travail décrit le procédé de fabrication d’un dispositif acrylique (polyméthacrylate de méthyle, PMMA) pour les tests immunologiques enzymatiques conjugués aux nanoparticules à l’aide de la technique de microbroyage à commande numérique par ordinateur (CNC). Le fonctionnement du dispositif microfluidique est démontré en effectuant un dosage immunologique pour détecter un anticorps commercial utilisant le lysozyme comme antigène modèle conjugué à des nanoparticules magnétiques de 100 nm. Ce dispositif intègre une restriction physique échelonnée de seulement 5 μm de hauteur, utilisée pour capturer les microparticules magnétiques qui composent un piège magnétique en plaçant un aimant externe. De cette façon, la force magnétique sur l’immunosupport des nanoparticules conjuguées est suffisante pour les capturer et résister à la traînée d’écoulement. Ce dispositif microfluidique est particulièrement adapté à la production de masse à faible coût sans perte de précision pour les performances des immunoessais.

Introduction

Ces dernières années, la microfluidique a joué un rôle important dans les techniques d’immunoessais¹. La technologie de miniaturisation présente de nombreux avantages exceptionnels par rapport aux immunoessais traditionnels, tels qu’une consommation réduite d’échantillons et de réactifs, des temps d’incubation plus courts, un échange de solution efficace et une intégration et une automatisation accrues².

De plus, les systèmes microfluidiques dans les essais immunologiques, associés à des nanoparticules magnétiques comme immunosupport, réduisent considérablement les temps d’incubation, atteignant une sensibilité de détection élevée en raison de l’augmentation du rapport surface/volume³. Le mouvement brownien des particules améliore la cinétique de réaction lors de la formation du complexe antigène-anticorps ^4,5. De plus, les propriétés magnétiques des nanoparticules offrent la polyvalence nécessaire pour être intégrées dans différentes configurations de dispositifs microfluidiques, ce qui en fait un candidat idéal pour la signalisation et la capture de molécules dans les systèmes de biodétection miniaturisés^{sur puce 5}. Cependant, les forces magnétiques sont significativement plus faibles que les forces de traînée à l’échelle nanométrique en raison du rapport surface/volume élevé⁶. Par conséquent, la capture de nanoparticules pour des étapes cruciales d’immunodosage telles que le lavage et la détection peut être difficile, et un aimant conventionnel est insuffisant⁴.

Un moyen efficace de manipuler les nanoparticules est l’utilisation d’un piège magnétique microfluidique formé de microparticules de fer, qui sont emballées dans une structure microfluidique³. Par conséquent, lorsqu’un aimant externe s’approche, une interaction complexe est créée dans le milieu poreux magnétisé entre les forces magnétiques et de flux. La force magnétique agissant sur les nanoparticules est suffisamment forte pour les capturer et résister à la traînée d’écoulement ^3,4,7. Cette approche nécessite des techniques de microfabrication qui atteignent des résolutions de l’ordre de quelques micromètres pour générer des structures micrométriques qui retiennent les microparticules.

Les techniques actuelles de microfabrication permettent la fabrication à haute résolution de structures allant de quelques microns à des centaines de nanomètres⁸. Cependant, bon nombre de ces techniques nécessitent un équipement spécialisé, coûteux ou compliqué. L’une des principales difficultés est la nécessité d’une salle blanche pour la fabrication des moules, qui reste coûteuse et chronophage ^8,9. Récemment, les ingénieurs en microfluidique ont surmonté cet inconvénient en développant une variété de méthodes de fabrication alternatives, avec divers avantages tels que des coûts réduits, des délais d’exécution plus rapides, des matériaux et des outils moins chers et des fonctionnalités accrues⁸. De cette façon, le développement de nouvelles techniques de microfabrication a apporté des méthodes peu coûteuses, non salles blanches, qui atteignent des résolutions aussi basses que 10 μm⁸. Le modelage peut être utilisé directement sur un substrat sans générer un motif de moulage coûteux, évitant ainsi un processus fastidieux. Les méthodes de fabrication directe comprennent le fraisage CNC, l’ablation laser et la lithographie directe⁸. Toutes ces méthodes sont adaptées à la production de canaux à rapport d’aspect élevé dans une large gamme de matériaux, quelle que soit leur dureté⁹, permettant des géométries, des comportements physiques et des qualités nouveaux et avantageux dans les dispositifs microfluidiques⁸.

Le microfraisage CNC crée des structures à l’échelle microscopique à l’aide d’outils de coupe qui éliminent le matériau en vrac d’un substrat et constitue une méthode de fabrication efficace pour les dispositifs microfluidiques^10,11. La technique de microfraisage peut être utile dans les applications microfluidiques pour créer des microcanaux et des caractéristiques directement sur la surface de travail, offrant un avantage clé : une pièce peut être fabriquée en peu de temps (moins de 30 min), ce qui réduit considérablement le délai d’exécution entre la conception et le prototype¹². En outre, la grande disponibilité d’accessoires de coupe de différents matériaux, tailles et formes fait des fraiseuses CNC un outil approprié qui a permis la fabrication de différentes caractéristiques dans de nombreux types de matériaux jetables à faible coût¹³.

Parmi tous les matériaux couramment utilisés dans le microbroyage, les thermoplastiques restent un choix de premier plan en raison de leurs nombreuses propriétés favorables et de leur compatibilité avec les applications biologiques^10,14. Les thermoplastiques sont un substrat attrayant pour les systèmes microfluidiques en raison de leurs avantages significatifs pour le développement de systèmes analytiques jetables à faible coût⁹. En outre, ces matériaux se prêtent très bien aux processus de fabrication à grand volume, ce qui les rend adaptés à la commercialisation et à la production de masse. Pour ces raisons, les thermoplastiques tels que le PMMA sont considérés comme des matériaux fiables et robustes depuis les premières années de la microfluidique¹⁰. Différents protocoles ont été décrits pour fabriquer des canaux fermés dans les thermoplastiques, tels que le collage par solvant¹⁵, le collage thermique 16 et le collage de surface ultraviolet (UV)/ozone¹⁷.

Dans de nombreux cas, la résolution de positionnement obtenue avec les microfraiseuses conventionnelles n’est pas suffisante pour certaines applications microfluidiques nécessitant des structures inférieures à 10 μm. Le microfraisage haut de gamme a une résolution suffisante. Malheureusement, en raison des prix élevés, son utilisation est limitée à une poignée d’utilisateurs¹². Auparavant, notre groupe de recherche a rapporté la fabrication et la manipulation d’un outil à faible coût qui permet d’usiner des structures de moins de 10 μm, surmontant la résolution des fraiseuses conventionnelles¹². Le luminaire est une plate-forme fabriquée par impression 3D avec une électronique simple, contenant trois actionneurs piézoélectriques. La surface contient des joints en forme de charnière qui permettent de la soulever lorsque les éléments piézoélectriques agissent simultanément. Le déplacement de l’axe Z peut être contrôlé avec une résolution de 500 nm et une précision de ±1,5 μm¹².

Cet article présente les étapes du processus de fabrication d’un dispositif acrylique (PMMA) à travers une technique de microfraisage. La conception de la puce se compose d’un canal principal de 200 μm de large et 200 μm de haut et d’un canal latéral avec les mêmes dimensions pour purger le flux des réactifs. Dans la région centrale, le canal est interrompu par une restriction physique de seulement 5 μm de hauteur, fabriquée avec la plate-forme piézoélectrique imprimée en 3D réalisée par ce groupe¹², pour capturer les microparticules magnétiques qui constituent un piège magnétique pour les nanoparticules en plaçant un aimant externe. Nous montrons le fonctionnement du dispositif microfluidique en effectuant un dosage immunologique pour détecter un anticorps commercial en utilisant le lysozyme comme antigène modèle conjugué à des nanoparticules magnétiques de 100 nm. Ce dispositif combine différentes caractéristiques qui le rendent unique⁴: l’utilisation de nanoparticules magnétiques comme support immunitaire réduit le temps total de test de quelques heures à quelques minutes; l’utilisation d’une enzyme fluorogénique pour la détection permet d’obtenir des limites de détection comparables à celles des tests immuno-enzymatiques standard (ELISA); et l’utilisation d’un thermoplastique comme matériau de fabrication le rend compatible avec la production de masse, ce qui n’était pas le cas pour les précédents pièges magnétiques de nanoparticules microfluidiques³, et en fait un excellent candidat pour développer le POCT.

Protocol

1. Microfraisage

1. Rectification de surface
   1. Allumez la microfraiseuse et le contrôleur piézoélectrique. Démarrez leur logiciel de contrôle respectif¹².
   2. Sélectionnez les taillants d’extrémité requis (diamètres 200 μm et 800 μm). Placez-les dans le compartiment approprié de la fraiseuse (Figure 1).
   3. Découpez des rectangles de 9 mm x 25 mm en PMMA de 1,3 mm d’épaisseur avec le taillant d’extrémité de 800 μm. Fixez soigneusement l’un de ces rectangles à l’aide de ruban adhésif double face à la plate-forme piézoélectrique (Figure 2).
      REMARQUE: Assurez-vous de toujours placer le rectangle acrylique dans la même position afin que l’un des coins coïncide avec les coordonnées d’origine sur les axes x et y pour l’usinage.
   4. Connectez et placez le capteur z sur la surface du rectangle en PMMA. Sélectionnez la broche de détection et déplacez-la sur la surface du capteur. Abaissez la broche manuellement sans entrer en contact avec le capteur. Activez le mode de détection Z0 (Figure 3).
   5. Sélectionnez le taillant d’extrémité de 200 μm et déplacez-le vers l’origine x, y. Retirez le capteur z. Abaissez le taillant avec précaution sans entrer en contact avec la surface acrylique.
   6. Faites tourner le taillant d’extrémité de 200 μm à 14 500 tr/min. Abaissez-le lentement jusqu’à la coordonnée d’origine sur l’axe z (z = 0). Réinitialisez l’axe z à 30 μm au-dessous de l’origine. Définissez cette coordonnée comme nouvelle origine z.
      REMARQUE: Ne baissez jamais le bit s’il ne tourne pas. Sinon, il risque de se briser.
   7. Cliquez sur le bouton Couper dans le logiciel de la microfraiseuse pour activer le panneau Couper . Cliquez sur le bouton Ajouter et sélectionnez le fichier .txt (fichier de codage supplémentaire 1) avec un code créé précédemment pour le meulage de la surface acrylique. Cliquez sur le bouton Sortie pour démarrer le processus.
   8. Amenez le taillant d’extrémité du fraisage à la coordonnée où la restriction sera usinée. Empêchez le taillant d’extrémité de soulever la surface du sol une fois cette coordonnée atteinte en cliquant sur le bouton Pause . Sinon, repositionnez manuellement le taillant de fraisage d’extrémité sur cette coordonnée (Figure 4A).
2. Fraisage de la restriction de 5 μm
   1. Réglez la vitesse de rotation du taillant d’extrémité du fraiseur à 11 000 tr/min. Élever la plate-forme de 6,5 μm avec l’interface de la plate-forme piézoélectrique (Figure supplémentaire S1). Déplacez le taillant d’extrémité le long de l’axe des y de 500 μm. Ramener la plate-forme piézoélectrique à sa valeur initiale sur l’axe z avec l’interface de contrôle.
3. Fraisage des microcanaux
   1. Ouvrez le fichier de conception créé précédemment à partir du logiciel de conception (fichier de conception supplémentaire 1). Cliquez sur le bouton Imprimer . Accédez au menu Propriétés et cliquez sur la fenêtre de couleur correspondant au calque contenant le dessin à usiner. Définissez les paramètres de fabrication dans le panneau Outil comme indiqué dans la figure supplémentaire S2.
   2. Désactivez les calques indésirables en sélectionnant l’option Aucun dans le menu déroulant Outils .
4. Fraisage des trous
   1. Passez au taillant de fraisage d’extrémité de 800 μm. Activez la couche de conception des trous de 1,2 mm de diamètre en cliquant sur la fenêtre de couleur correspondante.
   2. Répétez l’étape 1.3.2., mais dans ce cas, définissez les paramètres de fabrication correspondants comme décrit à la figure supplémentaire S3A pour les trous.
      REMARQUE: La profondeur des trous usinés est la moitié de l’épaisseur acrylique.
   3. Usinez deux trous supplémentaires sur les coins controlatéraux du rectangle pour aligner l’acrylique de manière inversée sur une nouvelle plate-forme (figure 4B). Décollez le rectangle en acrylique de la plate-forme piézoélectrique. Retournez l’acrylique et collez-le avec du ruban adhésif double face sur l’adaptateur avec les montants usinés (Figure 4C,D).
   4. Ouvrez le fichier avec la conception des trous pour la face opposée du logiciel de conception (fichier de conception supplémentaire 2). Définissez les paramètres de fabrication correspondants comme décrit à la figure supplémentaire S3B. Broyer la moitié restante des trous d’entrée et de sortie du réactif d’un diamètre de 1,5 mm et d’une profondeur de 0,7 mm (figure supplémentaire S3C).

Figure 1 : Emplacement du taillant d’extrémité du broyeur. (A) Les taillants d’extrémité de 200 μm et 800 μm sont placés et fixés à l’aide d’une vis au support en acier. (B) Chaque taillant d’extrémité est placé dans le compartiment spécifique de la microfraiseuse pour une sélection automatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Plateforme piézoélectrique. La plate-forme est fabriquée par impression 3D et se compose de deux bases hexagonales reliées par des charnières qui permettent un déplacement fin dans l’axe z contrôlé par trois actionneurs piézoélectriques. Un adaptateur acrylique est également observé, sur lequel est fixé le rectangle en PMMA, et qui permet de régler le coin d’alignement des coordonnées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Étalonnage de l’axe Z. Les étapes de l’étalonnage de l’axe z sont détaillées. (A) Le capteur z comprend un câble qui se branche sur la microfraiseuse. (B) Le capteur est placé directement sur la surface à usiner. (C) La goupille de détection est constituée d’une barre métallique placée dans un compartiment spécial à côté des taillants d’extrémité du broyeur. (D) Lorsque les deux accessoires entrent en contact, la microfraiseuse calcule automatiquement les coordonnées d’origine sur l’axe z. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Surface acrylique rectifiée. (A) Le taillant d’extrémité de train de 200 μm de diamètre balaie toute la surface du rectangle acrylique, enlevant une couche d’environ 30 μm de haut. (B) L’image montre les différentes structures fraisées sur la face de l’acrylique précédemment rectifié. Des canaux et des trous pour l’entrée et la sortie du réactif sont observés. La restriction de 5 μm ne peut pas être vue à l’œil nu. (C) Surface microfraisée avec trous d’alignement et adaptateur avec piliers d’alignement aux angles opposés. (D) L’acrylique est aligné à l’envers sur l’adaptateur avec des piliers, dans lesquels les trous d’alignement s’insèrent. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Étanchéité des canaux

1. Nettoyage acrylique
   1. Retirez le rectangle en acrylique de la plate-forme de l’adaptateur de pilier. Prenez un autre rectangle acrylique non usiné. Lavez les deux feuilles d’acrylique avec de l’alcool isopropylique (IPA) et rincez à l’eau distillée. Portez des gants et évitez tout contact avec l’IPA.
   2. Plongez l’acrylique dans un bain à ultrasons pendant 10 min (Figure 5A,B).
2. Exposition gazeuse au chloroforme
   1. Sécher parfaitement les deux feuilles d’acrylique. Collez-les à l’intérieur d’un couvercle en verre de la boîte de Petri avec du ruban adhésif double face. Veillez à exposer le côté du canal usiné (Figure 5C). Portez des gants et évitez de toucher directement la surface en acrylique.
   2. Placez la base de la boîte de Petri en verre à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre plus grande (Figure 5D). Verser 1 mL de chloroforme à la base de la boîte de Pétri. Placez rapidement le couvercle avec les feuilles d’acrylique attachées à la face intérieure.
   3. Ajouter immédiatement de l’eau distillée à la base de la plus grande boîte de Petri jusqu’au niveau du couvercle de la boîte de Pétri. Laisser l’acrylique exposé au gaz chloroforme pendant 1 min (figure 5E).
      REMARQUE : Considérez qu’un temps d’exposition plus long au chloroforme attaquera la surface de l’acrylique et que la restriction de 5 μm fondra, modifiera sa hauteur ou disparaîtra complètement.
   4. Inclinez la boîte de Petri pour briser le joint d’eau créé. Retirez immédiatement l’acrylique du chloroforme en découvrant la boîte de Pétri. Veillez à ne pas renverser l’eau.
      ATTENTION : Faites ce procédé dans la hotte et utilisez des gants puisque le chloroforme est très toxique.
3. Collage par pressage et chauffage
   1. Décollez les deux plaques d’acrylique du ruban adhésif double face.
   2. Aligner les deux acryliques avec les côtés qui ont été exposés au chloroforme gazeux face à face, formant un sandwich. Placer les acryliques dans la presse à 18 kgf/^cm2 et à une température de 90 °C (figure 5F,G).
      NOTE: Il est recommandé de placer l’acrylique aligné longitudinalement et de changer son alignement après 2 min pour une meilleure étanchéité. Si, après ce temps, le joint est insuffisant, replacez-le dans la presse à des intervalles ne dépassant pas 1 min. À l’aide du stéréoscope, vérifiez l’état des canaux et la restriction. Considérez qu’en cas de dépassement du temps de pressage, il existe un risque d’élimination de la restriction.
4. Fixation de tuyau
   1. Couper 2-3 cm longueurs de tuyau. Faites une coupe complètement droite. Fixez chaque tuyau aux trous de l’appareil à l’aide d’un adhésif liquide à séchage instantané (Figure 6A). Empêchez l’adhésif de pénétrer à l’intérieur de la puce.

Figure 5 : Processus d’étanchéité de l’appareil. (A) Chacune des feuilles d’acrylique est placée dans un sac refermable avec de l’eau distillée et immergée dans le bain à ultrasons. (B) L’image de gauche montre les canaux juste après la fabrication, et l’image de droite montre le même appareil après le lavage avec de l’IPA et le bain à ultrasons, qui élimine toutes les impuretés et les résidus acryliques du microcanal. Les bords de la restriction qui interrompt le canal central de 200 μm sont observés, ce qui confirme le succès du processus de fraisage. Barres d’échelle = 500 μm. (C) Les deux acryliques sont séchés et collés à la plate-forme en verre sur le couvercle. (D) La base de la boîte de Petri est placée à l’intérieur d’une autre boîte de plus grand diamètre. (E) Lors de la fermeture de la boîte de Pétri, le joint d’étanchéité empêche le chloroforme gazeux de s’échapper. F) Description des éléments du levier d’un poids de 5 kg. (G) Image du levier ouvert, montrant en rouge la zone où l’acrylique est placé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation de l’appareil

1. Remplissez les canaux avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites ou de résistance à l’écoulement. Immergez l’appareil dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes pour éliminer tout acrylique, adhésif ou matériau indésirable restant à l’intérieur des canaux.
2. Videz l’eau à l’intérieur des canaux de l’appareil. Utilisez une seringue pour introduire une solution bloquante préparée avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % (p/v) diluée dans 1x solution saline tamponnée Tris (TBS) et préalablement filtrée à travers un filtre de seringue en polyéthersulfone (PES) de 0,2 μm.
3. Préparer une suspension de microparticules de fer de 7,5 μm de diamètre dans 5% BSA.
   NOTE: Les microparticules sont préalablement fonctionnalisées avec une couche silice-polyéthylèneglycol (PEG) qui confère une résistance à l’absorption des protéines⁴.
4. Incuber la puce et la suspension de microparticules avec la solution de blocage pendant au moins 1 h à température ambiante. Si possible, laisser bloquer pendant la nuit à 4 °C.

4. Formation de pièges à microparticules

1. Insérez les microparticules dans la puce à l’aide d’une aiguille de seringue à travers le tuyau de sortie du canal latéral. Placez la puce verticalement et laissez les microparticules s’écouler sous l’effet de la gravité à travers le canal latéral. Faites pivoter la puce de 180° en deux étapes de 90° et laissez les microparticules cibler et compacter à la restriction de 5 μm.
2. Éliminer les microparticules en excès par gravité en tournant de 45° vers le canal latéral.
3. Gardez l’appareil debout pour éviter de défaire le piège à microparticules. Voir la figure 6B pour un résumé du processus de formation des pièges à microparticules.

5. Dosage immunologique

1. Préparation des nanoparticules
   1. Prélever 2 μL de la suspension de nanoparticules de 100 nm préalablement conjuguées avec du lysozyme (modèle antigénique). Ajoutez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL avec 100 μL de solution bloquante. Incuber pendant une nuit à 4 °C.
   2. Ajouter 150 μL de tampon de lavage (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Placez le tube microcentrifuge de 1,5 mL dans un séparateur magnétique. Conserver 15 min pour permettre la séparation des nanoparticules (Figure supplémentaire S4).
      REMARQUE: Le volume minimum pour le séparateur magnétique est de 200 μL. Évitez d’utiliser un volume plus petit.
   4. Retirez le liquide du tube à l’aide d’une micropipette. Évitez tout contact avec la paroi du tube où la pastille de nanoparticules a été formée.
   5. Ajouter 250 μL de tampon de lavage frais. Maintenir le tube sous agitation pendant 15 min.
   6. Répétez les étapes 5.1.3.-5.1.5. 2x de plus, en secouant seulement pendant 5 min.
   7. Ajouter la concentration désirée d’anticorps anti-lysozyme primaire (voir le tableau des matériaux). Ajuster à un volume final de 100 μL dans un diluant d’anticorps (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incuber pendant 15 min à 37 °C. Continuez à agiter pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante.
   9. Répétez les étapes de lavage 5.1.2.-5.1.6.
   10. Ajouter 100 μL de diluant d’anticorps. Ajouter l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP-AbII) (voir le tableau des matières) à une dilution de 1:500.
   11. Répétez les étapes de lavage 5.1.2.-5.1.6.
   12. Conserver les nanoparticules dans un volume final de 50 μL de diluant d’anticorps.

6. Montage expérimental

1. Remplissez les deux seringues en verre de 100 μL avec de l’eau, connectez un tuyau de 6,5 cm de long à chaque seringue, insérez une goupille métallique à l’extrémité du tuyau et placez les deux seringues sur la pompe à seringue contrôlée par ordinateur.
2. Scellez tous les tuyaux de l’appareil en acrylique avec de la chaleur.
3. Coupez le tuyau d’entrée et ne gardez que quelques millimètres. Remplissez l’aiguille de distribution avec un tampon de lavage et insérez-la dans le tuyau coupé. Laissez la solution s’égoutter avant de connecter l’aiguille à l’appareil pour empêcher l’accès de l’air à l’appareil.
4. Coupez le tuyau de sortie du canal latéral. Connectez-vous à la pompe à seringue. Ensuite, effectuez la même procédure pour le tuyau de sortie du canal principal.
   Remarque : Il est essentiel d’effectuer les étapes 6.3.-6.4. dans cet ordre pour éviter de déballer le piège à microparticules. Si possible, vérifiez l’état du piège au cours de ces étapes à l’aide d’une loupe.
5. Placez une lame de verre sur la platine du microscope. Fixez l’aimant à la lame avec du ruban adhésif double face et placez un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté pour fixer les bords de la puce au verre.
6. Réglez un débit de 50 μL/h via les onglets Débit et Unités du contrôleur de la pompe à seringues. Sélectionnez le mode Retrait et cliquez sur le bouton Démarrer pour activer le flux du tampon de lavage.
7. Approchez soigneusement l’appareil vers la glissière avec l’aimant de manière horizontale de sorte que la zone de la puce contenant le piège entre en contact avec l’aimant.
8. Collez les bords de l’appareil au verre avec du ruban adhésif double face pour empêcher tout mouvement. Éviter d’obstruer le chemin optique pour la microscopie (Figure 6C).

Figure 6 : Configuration finale du dispositif. (A) Dispositif acrylique avec les tuyaux fixés aux entrées et sorties correspondantes. L’échelle montre les dimensions de l’appareil en centimètres. B) Protocole pour la formation du piège à microparticules. Les microparticules circulent dans le canal par gravité lorsque l’appareil est placé en position verticale. Les microparticules sont concentrées à la restriction de 5 μm. Les microparticules en excès sont facilement éliminées en faisant tourner la puce dans le canal latéral. La puce est maintenue verticale pour préserver le piège avant le dosage immunologique. (C) Dispositif microfluidique monté sur une lame de verre contenant l’aimant, sur la platine du microscope à fluorescence inversée. On observe l’aiguille de distribution à travers laquelle les réactifs sont ajoutés, ainsi que les tuyaux de sortie qui se connectent à une pompe à seringue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Immunodétection

1. Laissez le tampon de lavage couler pendant 10 minutes à 50 μL/h pour éliminer l’excès de BSA.
2. Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette. Ajouter 50 μL de la suspension de nanoparticules.
3. Écoulement de la suspension de nanoparticules pendant 7 min à un débit de 100 μL/h. Ensuite, modifiez le débit à 50 μL/h et le débit pendant encore 15 minutes.
4. Changez l’aiguille de distribution. Écouler le tampon de lavage pendant 10 min à 50 μL/h. Préparer le substrat fluorogénique selon les spécifications du fabricant pendant l’étape de lavage.
5. Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette. Ajouter 100 μL du substrat fluorogénique (voir le tableau des matériaux). Écoulement du substrat fluorogénique pendant 6 min à 50 μL/h.
6. Réglez les paramètres de mesure du débit (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h et 10 μL/h ) et du temps (6 min) dans les onglets Débit et Réglage de la minuterie correspondants de l’interface qui contrôlent la pompe à seringue. Assurez-vous de sélectionner le mode de retrait pour chacune des mesures à effectuer.
7. Réglez une languette de débit supplémentaire à 50 μL/h et réglez la minuterie à 3 min pour l’étape de lavage.
8. Allumez la fluorescence du microscope 15 s avant l’arrêt du substrat à 50 μL/h. Démarrez la capture d’image avec le logiciel de la caméra de microscope 10 s avant que le substrat ne s’arrête avec un temps d’exposition de 1 000 millisecondes. Effectuez des images pendant 6 min à 1 image/s (FPS).
9. Cliquez sur le bouton Démarrer du paramètre de débit souhaité immédiatement après l’arrêt du débit de lavage du substrat à 50 μL/h. Cliquez sur le bouton Démarrer du débit de lavage (50 μL/h) immédiatement après l’arrêt du débit de mesure sélectionné.
10. Arrêtez la capture d’image et désactivez la fluorescence du microscope pour éviter le photoblanchiment du substrat.
11. Répétez les étapes 7.8.-7.10. pour chaque débit de mesure utilisé.

Results

Il a été possible d’établir un protocole de fabrication hautement reproductible qui améliore la résolution de la technique de microfraisage conventionnelle. En utilisant ce protocole, la fabrication d’un canal aussi petit que 5 μm de hauteur qui fonctionne comme une restriction échelonnée dans un canal de 200 μm de haut est réalisée. La conception simple de la restriction décalée capture les microparticules de fer de 7,5 μm de diamètre qui, lorsqu’elles sont compactées dans le microcanal, permettent la création d’un pièg...

Discussion

Un dispositif microfluidique acrylique pour des dosages immunologiques utilisant des nanoparticules comme immunosupport a été fabriqué à l’aide d’une technique de microbroyage. La méthode de fabrication directe sur le substrat a l’avantage d’éviter l’utilisation d’un moule maître et le temps et les coûts que cela implique. Cependant, il est limité au prototypage rapide et à la fabrication de dispositifs à haut volume.

Ici, nous avons utilisé une plate-forme piézoélectrique accessoire précédemm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Fraise en bout	KYOCERA SGS  ;	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032	Fraise KYOCERA SGS  ;	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
Microparticules de carboneyle-fer  ;	Sigma-Aldrich	44890	7 &mu ; m  ;
Chloroforme	Fermont	6201	Danger pour la santé : Modéré Inflammabilité : Aucun Réactivité : Aucun Danger de contact : Modéré
Caméra CMOS Moment	Teledyne Photometrics		Technologie du capteur : CMOS Efficacité quantique : 73 % Taille des pixels : 4,5 & micro ; m x 4,5 et micro ; m Interfaces prises en charge : USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Logiciel de gravure pour concevoir et créer le chemin de gravure sur la surface
Hotte d’extraction	Inconnu	Inconnu
Tube en plastique flexible	Tygon	AAD04103	ID = 0,020, OD = 0,060
Microsople de fluorescence  ;	ZEISS	Axio Vert.A1
Aiguille de distribution de haute précision	Loctite	98612
Application de contrôleur piézoélectrique maison	LabView  ;		Voir la référence 12 pour plus de détails.
Loctite 495 adhésif instantané	Henkel	49503	Appliquer avec la pointe d’une micropipette ou une aiguille de distribution  ;
MagJET Rack	de séparation thermoscientifique		12 x 1,5 mL
Presse mécanique	Fraiseuse
	Roland	MDX-50
piézoélectrique  ;	Fait		Voir la référence 12
Polyméthacrylate de méthyle - Feuille - PMMA, Acrylique	Goodfellow	ME303018/1	Epaisseur : 1,3 mm, Transparence : PV clair/
transparentLogiciel	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107  ;	Logiciel d’acquisition d’images
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyle Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Pompe à seringue	kd Scientific	; KDS200	Peut contenir jusqu’à deux seringues
Bain Utrasonic	Branson	2800
Logiciel VPanel  ;	Système d’exploitation Windows	version 1.0.3.0	Logiciel pour la commande de la microfraiseuse