Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

Résumé

Les méthodes immunochimiques établies pour mesurer les transmetteurs peptidiques in vivo reposent sur la microdialyse ou le prélèvement de fluide en vrac pour obtenir l’échantillon en vue d’une analyse hors ligne. Cependant, ceux-ci souffrent de limitations spatio-temporelles. Le présent protocole décrit la fabrication et l’application d’un biocapteur capacitif immunoprobe qui surmonte les limites des techniques existantes.

Résumé

La capacité de mesurer in vivo des biomarqueurs pertinents pour l’évaluation de la progression de la maladie est d’un grand intérêt pour les communautés scientifiques et médicales. La résolution des résultats obtenus à partir des méthodes actuelles de mesure de certains biomarqueurs peut prendre plusieurs jours ou semaines, car leur résolution peut être limitée à la fois spatialement et temporellement (p. ex., microdialyse du compartiment fluide du liquide interstitiel analysée par dosage immuno-enzymatique [ELISA], chromatographie liquide à haute performance [CLHP] ou spectrométrie de masse); ainsi, leur orientation du diagnostic et du traitement en temps opportun est perturbée. Dans la présente étude, une technique unique de détection et de mesure des transmetteurs peptidiques in vivo grâce à l’utilisation d’un biocapteur capacitif d’immunosonde (sonde CI) est rapportée. Le protocole de fabrication et la caractérisation in vitro de ces sondes sont décrits. Des mesures de la libération in vivo de neuropeptide Y évoqué par stimulation sympathique (NPY) sont fournies. La libération de NPY est corrélée à la libération sympathique de noradrénaline à titre de référence. Les données démontrent une approche pour la mesure rapide et localisée des neuropeptides in vivo. Les applications futures comprennent l’évaluation peropératoire en temps réel de la progression de la maladie et le déploiement mini-invasif de ces sondes par cathéter.

Introduction

Plusieurs méthodes chimiques de détection et de quantification des biomarqueurs sont couramment utilisées dans la chimie des protéines et le diagnostic clinique, en particulier dans les diagnostics de cancer et l’évaluation de la progression des maladies cardiovasculaires. Actuellement, des méthodes telles que la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), le dosage immuno-enzymatique (ELISA) et la spectrométrie de masse reposent sur la collecte d’échantillons dans le compartiment vasculaire ^1,2,3 par prélèvement de fluide en vrac ou dans le compartiment interstitiel ....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité de recherche animale de l’Université de Californie à Los Angeles et réalisées conformément aux directives établies par le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e édition, 2011). Des porcs mâles adultes du Yorkshire d’environ 75 kg ont été utilisés pour des études in vivo ¹⁰.

1. Fabrication et fonctionnalisation de l’immunosonde capacitive

1. Coupez un fil de platine recouvert de perfluoroalkyoxy (PFA) d’une longueur de 25 cm (voir tableau des matériaux) e....

Résultats

Fabrication et caractérisation d’électrodes
Une immunosonde capacitive flexible (sondes CI) a été fabriquée et une image représentative est représentée à la figure 1A. Le potentiel de l’électrode a été défini par un circuit de serrage de tension contrôlé par ordinateur (Figure 1B), et l’électrode a été immergée dans une solution de polydopamine fabriquée dans du PBS. La polydopamine a été électrodéposée sur la pointe d’électrode conductrice

Discussion

Le présent protocole décrit la fabrication et l’essai d’une immunosonde capacitive (sonde IC) capable de détecter et de mesurer des biomarqueurs d’intérêt in vitro et in vivo . La détection est réalisée en piégeant le biomarqueur à l’extrémité de l’électrode. L’événement de piégeage modifie la jonction capacitive entre une immunosonde capacitive à fil de platine et l’environnement de fluide conducteur environnant, mesurée comme un changement de courant de charge en réponse à un changement potentiel dans.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Électrode disque AgCl	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anticorps monoclonal anti-NPY	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Amplificateur multicanal personnalisé/ 1 M&Omega ; résistance de rétroaction multicanal Headstage	NPI Electronic, (Tamm, Allemagne)	NA	Basé sur NPI VA-10M amplificateur multicanal
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Connecteur mâle plaqué or	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 Dispositif analogique-numérique/numérique-analogique	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	Logiciel
Igor Pro, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Le logiciel pilotant le potentiel de commande et l’acquisition de données a été écrit sur mesure
Pompe péristaltique numérique Masterflex L/S Standard	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
Fil de platine revêtu de PFA	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0,005 » de diamètre nu, 0,008 » de diamètre revêtu
Élastomère de silicone	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Peptide NPY porcin synthétique	Bachem (Torrance, CA)
Peptide NPY porcin synthétique	Bachem (Torrance, CA)	4011654

d’acquisition de données NA 4011654