Caractérisation des modifications de l’ARN dans des neurones uniques à l’aide de la spectrométrie de masse

Résumé

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN représentent une couche de régulation de la traduction sous-étudiée qui a récemment été liée à la plasticité du système nerveux central. Ici, la préparation des échantillons et l’approche de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem sont décrites pour la caractérisation simultanée de nombreuses modifications de l’ARN dans des neurones uniques.

Résumé

Les modifications post-transcriptionnelles (PTM) de l’ARN représentent un mécanisme sous-étudié impliqué dans la régulation de la traduction dans le système nerveux central (SNC). Des preuves récentes ont lié des modifications spécifiques de l’ARN neuronal aux paradigmes d’apprentissage et de mémoire. Malheureusement, les méthodes conventionnelles de détection de ces caractéristiques épitranscriptomiques ne sont capables que de caractériser des modifications d’ARN très abondantes dans les tissus en vrac, empêchant l’évaluation de profils PTM uniques pouvant exister pour des neurones individuels dans les circuits comportementaux activés. Dans ce protocole, une approche est décrite – l’analyse de modification de l’ARN mononeurone par spectrométrie de masse (SNRMA-MS) – pour détecter et quantifier simultanément de nombreux ribonucléosides modifiés dans des neurones uniques. L’approche est validée à l’aide de neurones individuels du mollusque marin, Aplysia californica, en commençant par l’isolement chirurgical et le traitement enzymatique des principaux ganglions du SNC pour exposer les corps cellulaires des neurones, suivis d’un isolement manuel à un seul neurone à l’aide d’aiguilles pointues et d’une micropipette. Ensuite, le traitement mécanique et thermique de l’échantillon dans un petit volume de tampon est effectué pour libérer l’ARN d’une cellule individuelle pour la digestion ultérieure de l’ARN. Les nucléosides modifiés sont ensuite identifiés et quantifiés à l’aide d’une méthode optimisée de chromatographie liquide-spectrométrie de masse. SNRMA-MS est utilisé pour établir des modèles de modification de l’ARN pour des neurones uniques et identifiés d’A. californica qui ont des morphologies et des fonctions connues. Des exemples qualitatifs et quantitatifs de SNRMA-MS sont présentés qui mettent en évidence la distribution hétérogène des modifications de l’ARN entre les neurones individuels dans les réseaux neuronaux.

Introduction

Les modifications des nucléosides canoniques de l’ARN ont été de plus en plus reconnues pour leur myriade de rôles dans la régulation de la traduction des protéines. Plus de 150 modifications uniques de l’ARN ont été rapportées à ce jour, dont la complexité va de la méthylation, de l’addition hétéroatome à la conjugaison avec les métabolites cellulaires ^1,2. Cet alphabet d’ARN étendu, également connu sous le nom d’épitranscriptome, est généré par des auteurs enzymatiques et est responsable de la modification de la stabilité³, du repliement⁴ et de l’efficacité de traduction ^5,6 des ARN cellulaires. Certaines modifications de l’ARN peuvent également être inversées via des gommes enzymatiques ^7,8, tandis que d’autres sont ajoutées aux ARN substœchiométriquement ^9,10, ce qui rend un paysage complexe de séquences d’ARN modifiées et non modifiées dans les systèmes biologiques.

L’importance des modifications de l’ARN dans la fonction biologique est indiquée par la répartition inégale des modifications entre différents organes et tissus, y compris les sous-régions du système nerveux central (SNC)¹¹. Cette hétérogénéité chimique a été liée au développement du SNC¹², à la réponse au stress¹³ et à la plasticité dépendante de l’activité¹⁴. Les sous-régions du SNC comprennent en outre des populations hétérogènes de cellules dans lesquelles les cellules individuelles présentent des profils chimiques ^{distincts 15,16,17,18}. Même des cellules individuelles du même type peuvent présenter des transcriptomes uniques, en partie à cause des microenvironnements tissulaires¹⁹ et de l’expression génique stochastique²⁰. Cependant, bien que la caractérisation du transcriptome unicellulaire soit quelque peu routinière, il n’existe pas de méthodes analogues pour établir des épitranscriptomes unicellulaires pour de multiples modifications de l’ARN. De nouvelles approches capables de profiler la distribution des modifications de l’ARN dans les cellules individuelles sont nécessaires pour une analyse complète de l’hétérogénéité cellulaire et de l’influence régulatrice des modifications post-transcriptionnelles (PTM) dans le SNC et d’autres systèmes biologiques.

La mesure simultanée de nombreuses modifications de l’ARN dans les cellules / tissus en vrac est facilement réalisée à l’aide de techniques de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS). Pour l’analyse LC-MS/MS des ribonucléosides modifiés, l’ARN est extrait des cellules (généralement 10^{3-10 6} cellules), purifié par précipitation et remise en suspension, puis digéré en nucléosides. Le mélange d’échantillons constitué de nucléosides canoniques et modifiés est ensuite injecté dans le système LC-MS pour la séparation et la détection des analytes, conduisant à la détermination de l’ensemble des modifications de l’ARN dans un organisme 21,22,23. LC-MS/MS a récemment été utilisé pour déterminer 26 modifications de l’ARN dans le SNC du modèle neurobiologique, Aplysia californica (A. californica). L’abondance de certaines de ces marques épitranscriptomiques présentait une dynamique dépendante du temps et de la région qui était en corrélation avec des changements de comportement chez l’animal²⁴. Cependant, il n’a été possible de détecter des modifications de l’ARN que dans des échantillons en vrac contenant >10³ cellules en raison de la sensibilité limitée de la méthode. Ces échantillons plus importants cachaient probablement des profils de modification de l’ARN uniques et fonctionnellement importants de cellules individuelles avec des moyennes de population. Bien qu’un contrôle minutieux des conditions de préparation des échantillons ait amélioré les limites de détection des modifications de l’ARN dans les échantillons de petit volume ^25,26,27,28, il reste nécessaire de disposer de méthodes analytiques capables de détecter et de quantifier plusieurs ribonucléosides modifiés dans des cellules individuelles.

Ce protocole introduit l’analyse de modification de l’ARN mononeurone par spectrométrie de masse (SNRMA-MS), qui permet la détection de plus d’une douzaine de modifications de l’ARN dans des neurones uniques du SNC d’A. californica²⁹. L’approche consiste en un isolement chirurgical de cellules uniques identifiées à partir des principaux ganglions du SNC, suivi d’un flux de travail optimisé de préparation des échantillons impliquant la lyse mécanique des cellules, la dénaturation de l’ARN et l’hydrolyse enzymatique dans un tampon compatible avec la SEP. L’identification et la quantification des nucléosides modifiés post-transcriptionnellement sont ensuite réalisées à l’aide de LC-MS/MS. SNRMA-MS répond à un besoin non satisfait dans le domaine de l’analyse de la modification de l’ARN en facilitant l’acquisition de profils de modification de l’ARN post-transcriptionnel pour des neurones individuels et a un potentiel d’application future à d’autres types de cellules.

Protocole

1. Préparation des matériaux et des solutions

1. Préparer de l’eau de mer artificielle (ASW) avec 460 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 10 mM de CaCl₂, 22 mM De MgCl₂, 26 mM de MgSO₄ et 10 mM d’HEPES dans de l’eau obtenue à partir d’un système de purification rigoureux. Ajuster le pH à 7,8 à l’aide de 1 M NaOH ou HCl. En règle générale, préparer 1 L d’ASW et conserver à 14 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparer une solution ASW-antibiotiques avec 10 000 U/mL de pénicilline G, 10 μg/μL de streptomycine et 10 μg/μL de gentamicine et conserver à -20 °C. Immédiatement avant l’expérience, décongeler et diluer la solution mère d’antibiotiques congelés 1:100 dans 20-40 ml d’ASW. La concentration finale d’antibiotiques dans la solution ASW de travail est de 100 U/mL de pénicilline G, 100 μg/mL de streptomycine et 100 μg/mL de gentamicine.
3. Préparer un tampon de digestion de l’ARN en combinant 1 μL de 10 μg/μL d’albumine sérique bovine, 0,5 μL de 0,5 μg/μL de pentostatine, 0,495 μL de 2 U/μL de phosphatase alcaline, 1 μL de 0,1 U phosphodiestérase I (dans 10 mM MgCl₂) et 0,38 μL d’endonucléase de Serratia marcescens (25 U) par échantillon. Si vous analysez plusieurs échantillons, préparez un mélange maître dans un tube séparé contenant le volume de chaque réactif multiplié par le nombre d’échantillons à analyser, plus un autre pour tenir compte de la perte accidentelle de réactif des étapes de transfert de pipette.
4. Préparez plusieurs aiguilles pointues (en verre ou en métal) pour l’isolement manuel des neurones. Fabriquez des aiguilles métalliques en interne par gravure électrochimique de fil de tungstène comme dans³⁰ ou achetez-les. Préparer des aiguilles en verre à partir de capillaires en verre borosilicate épais ou standard (diamètre extérieur de 1 mm) à l’aide d’un extracteur de micropipette. Pour la présente méthode, maintenir le diamètre de la pointe de l’aiguille entre 1 et 5 μm, avec une longueur de cou de 100 à 150 μm.
   REMARQUE: La fabrication d’aiguilles en métal et en verre peut être optimisée pour produire des outils qui répondent aux besoins individuels du chercheur et au modèle biologique spécifique étudié.

2. Isolement d’un seul neurone

1. Refroidir une solution de 0,33 M_MgCl2 à 14 °C. À l’aide d’une seringue de 50 mL, anesthésier A. californica (150-250 g) en injectant la solution de MgCl₂ dans la cavité corporelle de l’animal. Les meilleurs résultats sont obtenus avec un rapport de 1:3 du volume de la solution (mL) à la masse corporelle animale (g). Attendez environ 3 minutes que l’animal se détende, en veillant à ce qu’il ne présente pas de contractions corporelles en réponse à une stimulation tactile.
2. Placez le côté ventral de l’animal (côté pied) vers le haut dans un plateau de dissection. Disséquez l’animal à l’aide de ciseaux chirurgicaux avec une pointe émoussée positionnée vers l’animal, en faisant soigneusement une coupe longitudinale à travers le pied.
3. Épinglez les côtés rostral, caudal et latéral du corps de l’animal pour exposer les organes internes et les ganglions du SNC situés dans la cavité corporelle. Isoler les principaux ganglions du SNC de l’animal en coupant chirurgicalement les nerfs et certains conjonctifs provenant des ganglions.
4. Immerger les ganglions dans une solution de protéase de type XIV de Streptomyces griseus (10 mg/mL dans une solution ASW-antibiotiques) et incuber à 34 °C pendant 30 min ou 1 h (pour le ganglion cérébral).
   REMARQUE: La durée de l’incubation dépend de la saison, de la taille et de l’état de l’animal, ainsi que des neurones ciblés. L’isolement de certains neurones nécessite une incubation plus longue que d’autres et doit être déterminé expérimentalement.
5. Rincez les ganglions 6x avec une solution d’antibiotiques ASW et transférez tous les ganglions dans un plat recouvert de polymère de silicone rempli de solution d’antibiotiques ASW à l’aide d’une pipette de transfert en polypropylène qui a été coupée à une ouverture d’environ 5 mm. Traiter la pipette avec 1 mg/mL d’albumine sérique bovine dans l’ASW afin de minimiser l’adhérence des ganglions à la pipette (facultatif). Gardez les ganglions immergés dans ASW en tout temps.
   REMARQUE: Le traitement enzymatique réduit la stabilité mécanique des neurones et du tissu conjonctif environnant et, par conséquent, les membranes neuronales peuvent être endommagées en raison de l’exposition à l’air lors du transfert des ganglions.
6. Épinglez les ganglions et utilisez des micro-ciseaux et des pinces fines pour enlever les gaines ganglionnaires. Avec un traitement enzymatique suffisamment fort, utilisez des aiguilles en verre ou en métal pour le dessuffage.
7. Identifier visuellement les neurones d’intérêt d’A. californica . Dans ce travail, les cellules suivantes ont été étudiées: R2 dans le ganglion abdominal, LPl1 dans le ganglion pleural, cellules métacérébrales (MCC) dans le ganglion cérébral et cellules B2 dans le ganglion buccal. Prenez des images optiques de toutes les préparations neuronales et ganglionnaires à l’aide d’un microscope étalonné à un grossissement total de 20x pour déterminer les tailles et les volumes de chaque type de cellule.
8. À l’aide d’un capillaire en verre tiré ou d’aiguilles pointues en tungstène, isolez soigneusement la cellule identifiée du ganglion en vrac.
9. Aspirer une petite quantité (1 μL) d’ASW dans une micropipette en plastique, puis transférer la cellule isolée dans un tube d’échantillonnage PCR contenant 4 μL d’acétate d’ammonium de 0,365 M (pH 9,2). Pour les mesures à blanc, prélever 5 μL d’aliquotes de la solution ASW-antibiotiques de la boîte contenant le ganglion et mélanger avec le tampon de digestion (décrit ci-dessous).

3. Lyse cellulaire et digestion de l’ARN pour SNRMA-MS

1. Lyser les neurones isolés par aspiration répétée et se passer d’une micropipette (~100 μm de diamètre intérieur) dans de l’acétate d’ammonium de 0,365 M. Certaines cellules plus petites peuvent ne pas se rompre immédiatement; pour les lyser, appliquez une pression sur le diamètre de la cellule avec un capillaire en verre tiré.
2. Utilisez un cycleur thermique pour chauffer les échantillons avec le programme de température suivant : 95 °C pendant 3 min, 10 °C pendant 3 min, maintenir à 10 °C. Retirez le tube d’échantillonnage du cycleur thermique.
3. Ajouter 3,375 μL de tampon de digestion de l’ARN pour chaque échantillon et mélanger la solution à l’aide d’une micropipette en retirant et en distribuant la solution plusieurs fois. Utilisez une centrifugeuse de paillasse miniature à 2700 x g pendant 30 s pour faire tourner les gouttelettes de liquide accrochées aux parois du tube PCR.
4. Incuber les échantillons dans le cycleur thermique à 37 °C pendant 3 h, suivi d’une retenue à 10 °C (couvercle chauffé réglé sur ON). Immédiatement après le refroidissement de l’échantillon à 10 °C, transférer 7 μL de la solution dans un flacon d’échantillonneur automatique équipé d’un insert de 250 μL, en prenant soin d’éviter la formation de bulles dans le tube d’échantillonnage automatique.

4. Chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem

REMARQUE: Analysez les digestes à neurone unique et les normes nucléosidiques modifiées authentiques à l’aide d’un système LC-MS / MS équipé d’une source d’ionisation par électropulvérisation et d’une vanne de dérivation à six ports.

1. Pour préparer le système LC à la séparation des nucléosides canoniques et modifiés, équilibrager une colonne C18 (150 mm x 2,1 mm, taille des particules de 2,2 μm, diamètre des pores Å) avec une phase mobile A à 99 % (acétate d’ammonium de 5 mM, pH 5,6) et une phase mobile B à 1 % (phase mobile A/acétonitrile (ACN) à 99 % de phase mobile A/acétonitrile (ACN)) à un débit de 0,2 mL/min pendant 12 min à 36 °C. Utilisez des solvants de qualité LC-MS pour la préparation des phases mobiles.
2. Pendant que le LC s’équilibre, étalonnez le spectromètre de masse en introduisant une solution de 1 mM d’acétate de sodium dans 50/50 ACN/eau dans le spectromètre de masse via une pompe à seringue avec un débit de 5 μL/min. Après l’étalonnage, reconnectez le débit LC au spectromètre massique.
3. Programmer les paramètres de gradient linéaire suivants : 1% B pour 0-5 min, 5% B à 9 min, 7% B à 11 min, 10% B à 13 min, 15% B à 32 min, 40% B à 38 min, 50% B à 43 min, 100% B à 50 min, 100% B à 60 min, 1% B à 61 min, et un rééquilibrage de 12 minutes à 1% B avant la prochaine injection.
4. Utilisez l’instrument MS en mode positif avec les paramètres suivants : tension capillaire réglée sur 4 500 V, température de séchage 275 °C, gaz de séchage N₂ 5 L/min et gaz nébulisant 1 bar. Réglez la vanne de dérivation sur le gaspillage pendant les 2 premières minutes d’analyse et sur la source pour le reste de l’exécution.
5. Collectez des spectres de masse sur une plage m/z de 110 à 600. Sélectionner les ions pour la dissociation induite par collision à 35-40 eV sur un temps de cycle de 3 s en utilisant une liste de masse préférée construite à l’aide de la base de données² et d’une fenêtre d’isolement de ± 0,5. Utilisez l’exclusion active pour exclure les ions de la fragmentation après trois spectres.
6. Définissez l’acquisition dynamique des spectres MS/MS pour les ions dont les intensités sont supérieures et inférieures à 50 000 comptes à 4 Hz et 1 Hz, respectivement, et un seuil minimum pour la sélection d’ions à 1 990 comptes.
7. Pour le SNRMA-MS quantitatif, construire des courbes d’étalonnage à l’aide des zones de crête du chromatogramme ionique extrait (EIC) obtenues pour des étalons nucléosidiques modifiés à un minimum de cinq concentrations pour permettre l’interpolation de concentrations inconnues d’analyte endogène.
   REMARQUE: Les neurones obtenus à partir d’animaux ayant des masses corporelles de 150-250 g nécessitent généralement des courbes d’étalonnage pour des nucléosides modifiés allant de 0,02 pmol à 2 pmol, mais ces valeurs peuvent varier en fonction de la sensibilité de l’instrument.

5. Analyse des données

1. Générer des EIC pour les nucléosides modifiés (m/z à partir des valeurs de base de données²). Vérifier l’identité des nucléosides modifiés putatifs en comparant leurs spectres MS2 et leurs caractéristiques de rétention LC aux valeurs de base de données². Voir le tableau 1 pour une liste des modifications typiques de l’ARN détectées dans des neurones uniques d’A. californica.
2. Intégrez manuellement les pics qui correspondent à des nucléosides modifiés et canoniques et enregistrez ces valeurs dans une feuille de calcul. Normaliser la zone de crête pour chaque nucléoside modifié avec la somme des zones de crête pour la cytidine canonique, l’uridine et la guanosine détectées dans l’échantillon.
   REMARQUE: L’adénosine n’est pas incluse dans la normalisation en raison de son rôle dans le SNC en tant que neuromodulateur dynamique³¹.
3. Construire une matrice de données composée de chaque échantillon de neurone unique et des zones de crête normalisées correspondantes pour les nucléosides modifiés qui présentaient des rapports signal/bruit >10. Effectuez une analyse en composantes principales (ACP) et affichez les deux premières composantes principales dans le diagramme de score. Construire des courbes d’étalonnage linéaires à partir des zones de crête EIC obtenues à partir de la dilution en série des étalons nucléosidiques et calculer les concentrations des analytes détectés.

Résultats

SNRMA-MS implique l’isolement manuel des neurones identifiés en petits volumes d’échantillons pour la lyse, la digestion et l’analyse LC-MS/MS (Figure 1A). Ce flux de travail a systématiquement détecté plus d’une douzaine de modifications de l’ARN dans des neurones individuels du SNC d’A. californica (Figure 1B), ce qui représente une couverture de près de la moitié de l’épitranscriptome connu de cet animal²⁴ dans une seule cellule. Par exemple, soumettre le neurone LPl1 (~ 500 μm de diamètre) à SNRMA-MS a entraîné la détection de modifications de l’ARN 15 ± 1 (n = 3). Les nucléosides modifiés ont été identifiés positivement sur la base de trois attributs : les propriétés de rétention LC, la masse exacte et les profils de fragmentation MS2 par rapport aux valeurs fournies dans la base de données². Le tableau 1 présente une liste de toutes les modifications de l’ARN détectées dans le neurone LPl1. Le spectromètre de masse quadripolaire à haute résolution utilisé pour ces expériences a permis une précision de masse de 4 ppm ainsi que la détection de l’ion fragment MS2 caractéristique à m/z 164 pour le nucléoside modifié N6,6-diméthyladénosine (m⁶⁶A, Figure 1B). Combinée aux données de séparation LC, qui concordent avec les résultats déposés dans la base de données (m⁶⁶A élue après N6-méthyladénosine (m⁶A)), l’approche SNRMA-MS a démontré l’attribution correcte d’identités nucléosidiques modifiées.

La plate-forme SNRMA-MS peut être exploitée pour établir des profils de modification de l’ARN de neurones individuels et étudier leur relation avec les tissus en vrac. Les neurones R2 sont de grandes cellules cholinergiques (~500 μm de diamètre) qui résident dans le ganglion abdominal. SNRMA-MS a été utilisé pour analyser les modifications de l’ARN dans les neurones R2 ainsi que dans le ganglion abdominal en vrac environnant (Figure 2A). Des zones de pic normalisées pour les modifications de l’ARN dans chaque échantillon de neurones / ganglions (n = 7) ont été utilisées comme entrées pour l’APC, révélant que les neurones R2 présentent des profils de modification de l’ARN distincts par rapport aux ganglions dans lesquels ils résident (Figure 2B). Ceci est mis en évidence par des points de données pour les neurones R2 et les ganglions abdominaux occupant différentes régions du diagramme de score PCA. Un soutien supplémentaire pour des modèles nucléosidiques modifiés uniques a été obtenu à partir d’une cohorte distincte d’animaux (n = 7) dans laquelle des comparaisons par paires ont été effectuées pour 13 modifications de l’ARN qui ont été couramment détectées à la fois dans les neurones individuels et les tissus en vrac (Figure 2C). Deux nucléosides modifiés, la pseudouridine (Ψ) et la 2'-O-méthylguanosine (Gm), étaient à une abondance significativement plus élevée dans les ganglions abdominaux par rapport aux neurones R2. Lors de l’examen d’un sous-ensemble des modifications de l’ARN avec des paires neurone-ganglion R2 indiquées, tous les ganglions abdominaux présentaient des niveaux plus élevés de Ψ et de Gm, et tous les neurones R2 sauf un avaient des abondances plus élevées de 2'-O-méthyladénosine (Am) que leur ganglion correspondant (Figure 2D). Dans l’ensemble, les résultats du SNRMA-MS révèlent pour la première fois que les profils de modification de l’ARN des cellules individuelles peuvent diverger des cellules en vrac dans le même tissu.

L’utilisation de SNRMA-MS pour étudier l’animal modèle A. californica offre une occasion unique de caractériser les profils de modification de l’ARN dans des neurones identifiés et fonctionnellement distincts. Les modifications de l’ARN ont été évaluées par SNRMA-MS dans quatre cellules identifiées : R2 et LPl1 (cellules homologues cholinergiques impliquées dans la libération muqueuse défensive)³², MCC (neurones modulateurs sérotoninergiques impliqués dans l’alimentation)³³ et B2 (neurones peptiergiques impliqués dans la motilité intestinale)³⁴. L’APC de six modifications de l’ARN dans ces neurones identifiés, soit isolés immédiatement après un traitement enzymatique, soit cultivés dans une préparation ganglionnaire pendant 48 h, a démontré la stabilité et la dynamique des épitranscriptomes unicellulaires. Les modifications de l’ARN dans des cellules fonctionnellement différentes ont formé des grappes uniques dans le diagramme de score tandis que les neurones homologues R2 / LPl1 ont co-clusterisé (Figure 3A). Le diagramme de charge montre que les différences étaient principalement dues à l’abondance d’isomères positionnels de méthyladénosine, y compris la 2'-O-méthyladénosine (Am) et la N1-méthyladénosine (m¹A) (figure 3B). Dans la même analyse, une comparaison de cellules fraîchement isolées et de cellules cultivées in situ (c.-à-d. dans leurs ganglions respectifs) pendant 48 h a été effectuée. Comme le montre le diagramme de score PCA, des cellules fonctionnellement différentes sont restées distinguables par leurs profils de modification de l’ARN.

Le SNRMA-MS quantitatif peut être utilisé pour déterminer les quantités absolues de modifications d’ARN sélectionnées pour lesquelles des normes authentiques sont disponibles. Des courbes d’étalonnage externes ont été générées pour m¹A, Ψ, 2'-O-méthylcytidine (Cm), Am et m⁶A, et la quantité de chaque nucléoside modifié dans les paires de cellules MCC et R2/LPl1 a été déterminée par interpolation (figure 4A-E). Les quantités intracellulaires de m¹A et Ψ dans deux paires de MCC symétriques semblaient être similaires, tandis que des différences plus importantes dans les quantités de ces modifications ont été observées dans trois paires de cellules R2 / LPl1. Afin de tenir compte des différences dues à la taille physique des cellules étudiées, les quantités de modification de l’ARN ont été normalisées par des volumes cellulaires calculés à partir de la mesure optique des diamètres cellulaires pour produire des concentrations intracellulaires de nucléosides modifiés. Des différences significatives dans les concentrations intracellulaires de Cm et d’Am ont été observées entre les MCC et les neurones R2/LPl1. Dans l’ensemble, SNRMA-MS permet un profilage qualitatif et quantitatif des modifications de l’ARN dans des neurones individuels.

Figure 1 : Flux de travail SNRMA-MS et détection de multiples modifications de l’ARN dans des neurones individuels par LC-MS/MS. (A) Photographies du ganglion buccal desséchauffé et de l’isolement d’un seul neurone dans un tube d’échantillonnage. Barre d’échelle = 200 μm, les flèches indiquent la cellule B1 identifiée. Un diagramme de la procédure de préparation de l’échantillon pour l’analyse LC-MS/MS est également présenté. (B) EIC superposés pour les modifications de l’ARN dans un seul neurone LPl1, avec un encart montrant les spectres MS1 et MS2 pour la N6, N6-diméthyladénosine (m⁶⁶A). Voir le tableau 1 pour les valeurs m/z utilisées pour générer des EIC pour les nucléosides modifiés. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: SNRMA-MS distingue les profils de modification de l’ARN des neurones individuels et des tissus en vrac. (A) Schéma du SNC a. californica et flux de travail pour l’analyse des neurones R2 et du ganglion abdominal environnant. La photographie montre le ganglion abdominal et le neurone R2 (injecté avec du colorant Fast Green pour la visibilité). (B) Les zones de pic relatives de 13 modifications de l’ARN ont été utilisées pour générer les diagrammes de score PCA (en haut) et de chargement (en bas). (C) Comparaison par paires des modifications de l’ARN dans le ganglion abdominal et le neurone R2. Les barres d’erreur représentent ±1 l’écart type (ET), *p < 0,05, ***p < 5 x 10⁻⁴, couplé au test t avec correction de Bonferroni−Holm. (D) Comparaison de certaines modifications de l’ARN du panel C dans lequel les paires de ganglions R2-abdominaux pour chaque animal sont montrées avec des lignes de gouttes. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Profilage des modifications de l’ARN dans des neurones identifiés et fonctionnellement différents du diagramme de score A. californica CNS. (A) PCA pour les MCC et les cellules B2, R2 et LPl1 qui ont été fraîchement isolés ou isolés après une culture in situ pendant 48 h (désignés par cMCC, cB2, cR2, cLPl1) et (B) des diagrammes de charge pour six modifications de l’ARN couramment détectées dans ces cellules. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : SNRMA-MS quantitative dans les neurones d’A. californica. Le SNRMA-MS quantitatif fournit des quantités absolues et des concentrations intracellulaires pour plusieurs nucléosides modifiés dans des neurones A. californica uniques et identifiés. Photographies de (A) MCC gauche et droit (LMCC et RMCC, respectivement) dans le ganglion cérébral et (B) R2 dans le ganglion abdominal et LPl1 dans le ganglion pleural. Les cellules sont encerclées pour améliorer la visibilité. Tracés d’étalonnage linéaires pour (C) m¹A et (D) Ψ (triangles) utilisés pour l’interpolation de quantités nucléosidiques modifiées dans des cellules simples (points colorés). Les paires de cellules de chaque animal sont étiquetées 1-3. (E) Concentrations intracellulaires de cinq nucléosides modifiés dans les paires de cellules MCC et R2/LPl1. Des lignes épaisses relient des paires de cellules. *p < 0,05, **p < 0,005, test t apparié avec correction de Bonferroni−Holm, n = 2 animaux (quatre cellules au total) pour les MCC et n = 3 animaux (six cellules au total) pour R2/LPl1. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Modification de l’ARN	Abréviation	Ordre d’élution (C18)	m/z pour EIC	m/z pour MS2
dihydrouridine	D	1	247.09	115
pseudouridine	Y	2	245.08	209/179/155
3-méthylcytidine	m3C	3	258.11	126
N1-méthyladénosine	m1A	4	282.12	150
5-méthylcytidine	m5C	5	258.11	126
N7-méthylguanosine	m7G	6	298.12	166
2'-O-méthylcytidine	Cm	7	258.11	112
inosine	I6A	8	269.09	137
2'-O-méthylguanosine	Gm	9	298.12	152
N2-méthylguanosine	m2G	10	298.12	166
N2,N2,N7-triméthylguanosine	m227G	11	326.15	194
N2,N2,-diméthylguanosine	m22G	12	312.13	180
2'-O-méthyladénosine	Suis	13	282.12	136
N6-méthyladénosine	m6A	14	282.12	150
N6,N6-diméthyladénosine	m66A	15	296.14	164
N6-isopentenyladenosine	i6A	16	336.17	204/136/148

Tableau 1 : Modifications de l’ARN détectées dans des neurones uniques d’A. californica. Les attributs pour la caractérisation des nucléosides modifiés sont fournis, y compris l’ordre de rétention LC, m /z pour la génération des EIC et les fragments CID correspondants.

Discussion

SNRMA-MS s’appuie sur une approche de préparation d’échantillon optimisée, ce qui se traduit par un petit volume d’échantillons compatible avec MS qui peut être livré à la plate-forme LC-MS. Le prétraitement enzymatique initial des ganglions du SNC dicte à la fois la facilité avec laquelle ils peuvent être desthérés et la durabilité des neurones individuels pendant l’isolement. Le ganglion cérébral nécessite souvent un traitement enzymatique prolongé en raison de sa gaine relativement épaisse par rapport aux ganglions buccaux, pleuraux et abdominaux. Les chercheurs individuels effectuant les isolements de neurones uniques peuvent avoir des préférences différentes quant à la durabilité de la gaine lors de l’utilisation de microcisseurs et de pinces fines. Cependant, il est important que les ganglions ne soient pas trop digérés, car cela peut entraîner une perte de leur intégrité structurelle, une perte d’informations positionnelles essentielles à l’identification des cellules cibles et / ou une lyse cellulaire. Après l’isolement du ganglion, il est important de s’assurer qu’un volume minimal de milieu d’isolement est aspiré lors du transfert du neurone dans le tube échantillon. Le milieu ASW contient une forte concentration de sels qui peuvent interférer avec les enzymes digestives pendant l’hydrolyse de l’ARN et diluera également l’échantillon.

Au cours de l’étape de lyse mécanique, il est fréquent que de gros neurones (>250 μm de diamètre) se rompent en passant à plusieurs reprises à travers une micropipette. Les neurones plus petits peuvent nécessiter une attention supplémentaire pour assurer la lyse cellulaire, ce qui implique généralement de presser un capillaire en verre sur la cellule. Dans ce cas, il est possible qu’un volume partiel du tampon de l’échantillon soit aspiré dans le capillaire en raison des forces capillaires. Ce volume peut être renvoyé dans le tube d’échantillonnage en appliquant une pression à l’extrémité du capillaire en verre pour s’assurer qu’aucun échantillon n’est perdu.

Les meilleurs résultats sont obtenus en incluant une étape de chauffage avant d’ajouter des enzymes pour la digestion de l’ARN. Cela est probablement dû au fait que le chauffage à 95 °C dénature les structures secondaires de l’ARN qui peuvent entraver l’activité des RNases³⁵ et diminuer la quantité de nucléosides libérés par les biopolymères d’ARN. Des expériences de contrôle utilisant des échantillons enrichis de méthionine marquée par des isotopes stables ont déjà été effectuées pour déterminer si les artefacts de modification de l’ARN induits par la chaleur étaient la cause de l’augmentation des zones de crête observées pour les modifications de l’ARN par rapport à un protocole SNRMA-MS^{sans chaleur 29}. Aucun marquage de ce type n’a été observé, ce qui indique que les signaux améliorés pour les modifications de l’ARN à l’aide de la méthode optimisée SNRMA-MS étaient dus à une digestion supérieure de l’ARN.

Les méthodes conventionnelles d’isolement de l’ARN total des cellules impliquent l’extraction liquide-liquide (LLE) avec phénol-chloroforme et la précipitation, le lavage et la remise en suspension ultérieurs de l’ARN. Ces approches se sont avérées utiles pour les expériences de réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse où l’expression de gènes sélectionnés peut être facilement surveillée dans les neurones identifiés d’A. californica ^36,37. Cependant, les méthodes LLE ne peuvent pas récupérer suffisamment d’ARN pour la détection de ribonucléosides modifiés par LC-MS, alors que la méthode SNRMA-MS décrite ici permet de détecter de nombreuses modifications d’ARN²⁹. Afin d’évaluer les profils de modification de types d’ARN spécifiques (p. ex., ARNr, ARNt, ARNm) dans des échantillons de tissus/cellules en vrac, des approches d’extraction en phase solide par échange d’anions²⁴, d’enrichissement par sonde d’hybridation³⁸ et de fractionnement chromatographique³⁹ ont été appliquées, mais des méthodes similaires ne sont pas encore disponibles pour la purification de l’ARN unicellulaire. Le développement d’approches de fractionnement de l’ARN capables d’isoler des types d’ARN spécifiques à partir de cellules individuelles fournirait des informations supplémentaires sur la fonction des modifications de l’ARN.

SNRMA-MS a révélé une hétérogénéité auparavant non caractérisée dans le paysage de modification de l’ARN de neurones uniques chez A. californica et il est concevable que des profils PTM distincts similaires existent dans les cellules de mammifères. Étant donné que les cellules de mammifères sont relativement petites par rapport aux grands neurones d’A. californica analysés dans ce protocole, des améliorations dans la manipulation de petits volumes d’échantillons sont nécessaires pour faciliter l’abaissement des limites de détection. Bien qu’actuellement SNRMA-MS soit limité à des volumes d’environ 5 μL, on s’attend à ce que des améliorations substantielles puissent être obtenues en intégrant des dispositifs de manipulation de liquides microfluidiques dans le flux de travail. De plus, la mise en œuvre d’isolements cellulaires automatisés ou semi-automatisés augmenterait le débit d’échantillons et permettrait l’analyse de la modification de l’ARN unicellulaire de populations cellulaires plus grandes. En s’interfaçant avec les séparations LC^{nanoflow 27}, la caractérisation des marques épitranscriptomiques dans des cellules encore plus petites sera réalisable.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Animals<
em>Aplysia californica	National Resource for Aplysia (Miami, FL)		150&ndash ; 250 g (adulte)
Équipement de paillasse
Extracteur capillaire en verre	Sutter	P-97
Système de purification d’eau Milli-Q Minicentrifugeuse	Millipore
pour tubes PCR	Microscope optique LW Scientific	ZS-1
	Zeiss	Stemi 2000C
Thermocycleur	Techne	EW-93945-01
Colonne HPLC et consommables
Acclaim RSLC 120 C18 Thermo	Scientific	71399
Flacons d’échantillonneur automatique	Thermo Scientific	C4011-13
LC et MS Instrumentation et logiciel
Logiciel DataAnalysis 4.4	Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLC	Thermo Scientific		Équipé d’un dégazeur en ligne, d’un échantillonneur automatique et d’un compartiment à colonne thermostaté
Spectromètre de masse Impact HD UHR QqTOF	Bruker		Équipé d’une source ESI
RStudio	RStudio
Outils de microdissection
Microciseaux extra fins vannas 3.5"	Roboz	RS-5640
Aiguilles en tungstène	Roboz	RS-6065
Réactifs/Matériaux
4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthane-sulfonique (HEPES)	Fisher Scientific	H3375
Phosphatase alcaline	Worthington Biochemical Corp.
Acétate d’ammonium	Honeywell	17836
Benzonase (endonucléase de S. marcescens)	EMD Millipore	70746-4
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A2153
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C4901
Sulfate de gentamycine	Fisher Scientific	G1264
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M9272
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	208094
Nucléosides mélange d’essai	Sigma-Aldrich	47310-U
Pénicilline G	Sigma-Aldrich	P7794
Pentostatine	Sigma-Aldrich	SML0508
Phosphodiestérase I	Worthington Biochemical Corp.
Protéase de type XIV de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S9888
Capillaires en verre standard	A-M Systems	626000	1 mm de diamètre extérieur, 0,5 mm de diamètre intérieur, 4 in
sulfate de streptomycine	Sigma-Aldrich	S9137