Une approche photodynamique pour étudier la fonction de rupture des vésicules intracellulaires

Résumé

L’inactivation laser assistée par chromophore (CALI) médiée par AlPcS_2a est un outil puissant pour étudier les dommages spatio-temporels des vésicules intracellulaires (IV) dans les cellules vivantes.

Résumé

Les vésicules intracellulaires (IV) sont formées par endocytose des vésicules dans le cytoplasme. La formation IV est impliquée dans l’activation de diverses voies de signal par perméabilisation des membranes IV et la formation d’endosomes et de lysosomes. Une méthode appelée inactivation laser assistée par chromophore (CALI) est appliquée pour étudier la formation des IV et les matériaux dans le contrôle de la régulation IV. CALI est une méthodologie photodynamique basée sur l’imagerie pour étudier la voie de signalisation induite par la perméabilisation membranaire. La méthode permet de perméabiliser la manipulation spatio-temporelle de l’organite sélectionné dans une cellule. La méthode CALI a été appliquée pour observer et surveiller des molécules spécifiques par perméabilisation d’endosomes et de lysosomes. La rupture membranaire des IV est connue pour recruter sélectivement des protéines liant les glycanes, telles que la galectine-3. Ici, le protocole décrit l’induction de la rupture IV par AlPcS_2a et l’utilisation de la galectine-3 comme marqueur pour marquer les lysosomes altérés, ce qui est utile pour étudier les effets en aval de la rupture de la membrane IV et leurs effets en aval dans diverses situations.

Introduction

Les endosomes, un type de vésicule intracellulaire (IV), sont formés par endocytose et mûrissent ensuite en lysosomes. Diverses voies de signal intracellulaires sont impliquées dans la formation des IV; De plus, différents stimuli intrinsèques et extrinsèques peuvent endommager les IV (p. ex., les agents pathogènes peuvent s’échapper de la membrane limitée pendant l’infection et entrer dans le cytoplasme¹). Cela s’accompagne généralement de la rupture des vésicules endocytotiques². Par conséquent, les techniques de ciblage et d’endommagement des IV peuvent être utilisées dans des études connexes³.....

Protocole

1. Préparation du stock AlPcS_2a

1. Dissoudre 10 mg d’AlPcS_2a dans 400 μL de NaOH 0,1 M. Pour améliorer la solubilité, chauffer la solution à 50 °C et vortex.
2. Mélanger la solution avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ensuite, filtrer la solution avec un filtre de 0,22 μm pour éliminer les précipités insolubles.
3. Mesurer la concentration de la solution à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Le coefficient d’extinction de AlPcS_2a à 672 nm est de 4 x 10⁴ cm-1 ^M-1. Diluer la solution AlPcS_2a avec du PBS pour obtenir une solution de ....

Résultats

Une figure schématique représentant les dommages intraveineux induits par AlPcS_2a, y compris l’endosome et le lysosome, a été montrée (Figure 1).

Des marqueurs disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour déterminer les conditions de coloration AlPcS_2a . Par exemple, AlPcS 2a_puncta et colorant fluorescent vert²² colocalisation (Figure 2).

L.......

Discussion

AlPcS_2a se lie à la membrane plasmique, puis est internalisé par endocytose et finit par s’accumuler dans les lysosomes. AlPcS_2a peut ainsi être localisé dans les compartiments subcellulaires en ajustant la durée d’incubation. Une limite de cette méthodologie est que seule une sous-population d’IV pourrait être marquée par AlPcS_2a par endocytose, car il existe de nombreuses autres sources membranaires d’IV, telles que les appareils ER et Golgi. En outre, le marquage sélectif d’AlPcS_2.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactif
Al(III) Chlorure de phtalocyanine Acide disulfonique (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Plat de culture	ibidi	812128-200
Milieu			DMEM complété par 10 % de FBS et 100 U/mL de pénicilline G et 100 mg/mL de streptomycine
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmide	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Vert DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	vert colorant fluorescent
Plaque multiparoi	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140163
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
Cell line
Les			méthodes sont applicables à la plupart des lignées cellulaires attachées. Les conditions doivent être déterminées individuellement.
Équipements
0.22 & micro ; m Filtre	Merck	SLGV013SL
Lumière LED Collimatée  ; (660 nm)	Thorlabs	M660L3-C1 et DC2100	La lumière proche infrarouge est la base idéale sur le spectre d’excitation de l’AlPcS2a.
Microscopie confocale	Carl Zeiss	LSM 780	Un système d’incubation est nécessaire pour l’imagerie à long terme.
Spectrophotomètres NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific
Lumière LED rouge	Tholabs	M660L4-C1

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