Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre

3.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/63972

⸱

2 juin 2022

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les métabolites microbiens dérivés de l’intestin ont des effets multiformes conduisant à un comportement complexe chez les animaux. Notre objectif est de fournir une méthode étape par étape pour délimiter les effets des métabolites microbiens dérivés de l’intestin dans le cerveau via une administration intrarébroventriculaire via une canule guide.

Résumé

L’impact du microbiote intestinal et de ses métabolites sur la physiologie et le comportement de l’hôte a été largement étudié au cours de cette décennie. De nombreuses études ont révélé que les métabolites dérivés du microbiote intestinal modulent les fonctions physiologiques à médiation cérébrale par des voies complexes intestin-cerveau chez l’hôte. Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites dérivés de bactéries produits lors de la fermentation des fibres alimentaires par le microbiome intestinal. Les AGCC sécrétés par l’intestin peuvent agir sur plusieurs sites à la périphérie, affectant les réponses immunitaires, endocriniennes et neuronales en raison de la vaste distribution des récepteurs des AGCC. Par conséquent, il est difficile de différencier les effets centraux et périphériques des AGCC par administration orale et intrapéritonéale d’AGCC. Cet article présente une méthode vidéo pour interroger le rôle fonctionnel des AGCC dans le cerveau via une canule guide chez des souris en mouvement libre. La quantité et le type d’AGCC dans le cerveau peuvent être ajustés en contrôlant le volume et le débit de perfusion. Cette méthode peut fournir aux scientifiques un moyen d’apprécier le rôle des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal humain abrite divers micro-organismes ayant un impact sur l’hôte 1,2,3. Ces bactéries intestinales peuvent sécréter des métabolites dérivés de l’intestin lors de leur utilisation des composants alimentaires consommés par l’hôte 4,5. Fait intéressant, les métabolites intestinaux non métabolisés à la périphérie peuvent être transportés vers d’autres organes par la circulation6. Il convient de noter que ces métabolites sécrétés peuvent servir de médiateurs pour l’axe intestin-cerveau, défini comme la communication bidirectionnelle entre le système nerveux central et l’intestin7. Des études antérieures ont montré que les métabolites dérivés de l’intestin peuvent moduler le comportement complexe et les émotions chez les animaux 8,9,10,11.

Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites produits par le microbiote intestinal lors de la fermentation des fibres alimentaires et des glucides non digestibles6. L’acétate, le propionate et le butyrate sont les AGCC les plus abondants dans l’intestin12. Les AGCC servent de source d’énergie pour les cellules du tractus gastro-intestinal. Les AGCC non métabolisés dans l’intestin peuvent être transportés vers le cerveau par la veine porte, modulant ainsi le cerveau et le comportement 6,12. Des études antérieures ont suggéré que les AGCC pourraient jouer un rôle essentiel dans les troubles neuropsychiatriques 6,12. Par exemple, l’injection intrapéritonéale de butyrate chez des souris BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modèle animal de trouble du spectre autistique (TSA), a sauvé leurs déficits sociaux13. Les rats traités aux antibiotiques recevant le microbiote de sujets dépressifs ont montré une augmentation des comportements anxieux et des AGCC fécaux14. Sur le plan clinique, des altérations des taux d’AGCC fécaux ont été observées chez les personnes atteintes de TSA par rapport aux témoins en développement typique15,16. Les personnes souffrant de dépression ont des taux d’AGCC fécaux inférieurs à ceux des sujets sains17,18. Ces études suggèrent que les AGCC peuvent modifier le comportement des animaux et des humains par diverses voies.

Les métabolites microbiens exercent divers effets sur de multiples sites dans le corps, affectant la physiologie et les comportements de l’hôte 4,19, y compris le tractus gastro-intestinal, le nerf vague et le nerf sympathique. Il est difficile de déterminer le rôle précis des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau lors de l’administration des métabolites par des voies périphériques. Cet article présente un protocole vidéo pour étudier les effets des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau d’une souris en mouvement libre (Figure 1). Nous avons montré que les AGCC pouvaient être administrés de manière aiguë par la canule guide pendant les tests comportementaux. Le type, le volume et le débit de perfusion des métabolites peuvent être modifiés en fonction de l’objectif. Le site de canulation peut être ajusté pour explorer l’impact des métabolites intestinaux dans une région spécifique du cerveau. Notre objectif est de fournir aux scientifiques une méthode pour explorer l’impact potentiel des métabolites microbiens dérivés de l’intestin sur le cerveau et le comportement.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux et les soins des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale Cheng Kung (NCKU).

1. Préparation pour l’animal d’expérimentation

  1. Procurez-vous des souris mâles C57BL/6JNarl de type sauvage âgées de 6 à 8 semaines auprès d’un fournisseur.
  2. Abritez les souris dans une cage à souris standard avec un chow de souris standard et de l’eau stérilisée ad libitum.
    REMARQUE: Les conditions de logement pour le Centre des animaux de laboratoire du NCKU sont une température de 22 ± 1 °C, une humidité de 55% ± 10% et un cycle lumière/obscurité de 13 h / 11 h.

2. Chirurgie stéréotaxique

  1. Préparez et stérilisez l’instrument stéréotaxique, les instruments chirurgicaux et les articles connexes.
    REMARQUE: Tous les articles qui entreront directement en contact avec le site chirurgical doivent être stérilisés pour éviter l’infection.
  2. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la cage en plexiglas avec 1% -5% d’isoflurane dans l’oxygène.
    REMARQUE: Observez attentivement la souris pour vous assurer que la fréquence respiratoire est maintenue à environ une respiration par seconde.
  3. Sortez la souris de la chambre d’anesthésie. Rasez le site chirurgical (tête de souris) avec une tondeuse pour animaux de compagnie. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique en fixant les incisives de la souris sur la barre d’incisive dans le support d’incisive stéréotaxique. Couvrez le nez avec le masque de nosecone.
  4. Anesthésiez la souris avec 1% -2,5% d’isoflurane dans l’oxygène tout au long de la chirurgie stéréotaxique. Évaluer la nociception de la souris via le réflexe de pincement des orteils et s’assurer d’un rythme respiratoire constant avant d’inciser le site chirurgical.
  5. Placez un coussin chauffant (37,0 °C) sous la souris sur le cadre stéréotaxique pour maintenir la température corporelle pendant la chirurgie. Alternativement, maintenez la température centrale à l’aide d’une sonde thermique rectale reliant le réchauffeur programmé et le coussin chauffant.
  6. Retirez la fourrure parée sur la tête à l’aide de ruban adhésif. Injectez à la souris un analgésique kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur. Appliquez une pommade pour les yeux pour éviter les yeux secs.
  7. Insérez la barre d’oreille pointue dans le conduit auditif pour fixer la tête.
  8. Centrez la tête en ajustant l’échelle de la barre d’oreille.
  9. Serrez la pince nasale sur le support d’incisive pour éviter les mouvements verticaux. Appuyez doucement sur la tête pour vérifier que la tête est fixe et éviter que la tête ne se desserre lors de la chirurgie ultérieure.
  10. Désinfectez le cuir chevelu avec trois gommages alternés de chlorhexidine à l’aide d’un coton-tige. Commencez chaque gommage du milieu vers le côté extérieur (de la zone centrale la plus désinfectée à la zone la moins désinfectée).
    REMARQUE: L’utilisation de gommages du milieu vers l’extérieur pourrait aider les scientifiques à minimiser l’infection et la contamination de la fourrure. La zone extérieure est proche de la région de la tête non rasée, qui a encore une grande quantité de fourrure et n’est pas facile à désinfecter complètement.
  11. Inciser le cuir chevelu de manière antérieure/postérieure (<1 cm) à l’aide d’une lame chirurgicale. Ouvrez l’incision et essuyez le crâne avec un coton-tige maintenu par une pince à microdissection.
    REMARQUE: Les pinces à microdissection, la lame chirurgicale et les cotons-tiges doivent être stérilisés par autoclavage avant la chirurgie. Pendant le processus chirurgical, stériliser tout le matériel chirurgical à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s avant et après chaque animal. Préparez un bécher stérilisé pour maintenir la lame chirurgicale et les forceps pendant le processus chirurgical et entre les animaux.
  12. Identifiez le Bregma et le Lambda sur le crâne. Utilisez le Bregma comme référence pour localiser la région d’intérêt.
    1. Facultatif : Montez la perceuse stéréotaxique sur le support de perceuse stéréotaxique et utilisez la pointe de la perceuse pour pointer Bregma comme référence. Stériliser la perceuse stéréotaxique à l’aide du stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s.
  13. Calibrer et aligner le plan horizontal du crâne plat dans les plans gauche/droite et antérieur/postérieur par Bregma/Lambda.
    REMARQUE: Si ce n’est pas dans un plan horizontal correct, remontez la souris sur l’instrument stéréotaxique.

3. Implantation de canule de guidage commercial personnalisé

  1. Identifier et étiqueter la position du ventricule latéral droit, en fonction des coordonnées stéréotaxiques : Distance à Bregma, antérieur/postérieure (A/P) : 0,26 mm, médiale/latérale (M/L) : -1,0 mm, dorsale/ventrale (D/V) : -2,0 mm 20.
    REMARQUE: Les coordonnées peuvent être modifiées en fonction de la région d’intérêt. Les coordonnées du ventricule latéral étaient basées sur des souris adultes C57BL/6J pesant entre 26 et 30 g. Si des souris plus jeunes sont utilisées, reportez-vous à la discussion.
  2. Percer un trou (diamètre = 1,5 mm) à travers le crâne sur le site marqué à l’aide d’une perceuse stéréotaxique pour l’implantation d’une canule de guidage commerciale.
  3. Percez deux à quatre trous supplémentaires (diamètre = 1,5 mm) sur le crâne à l’aide d’une perceuse stéréotaxique pour le montage de vis en acier inoxydable.
    REMARQUE : Stériliser la perceuse stéréotaxique à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s avant et après chaque animal.
  4. Essuyez les restes d’os et arrêtez de saigner avec un coton-tige.
  5. Essuyez le crâne avec de la lidocaïne (1 mg / kg) à l’aide d’un coton-tige pour des effets anesthésiques, antiprurigineux et analgésiques locaux. Si le saignement ne s’arrête pas après le forage, placez doucement un coton-tige sur le trou pour l’hémostase.
  6. Montez deux à quatre vis en acier inoxydable sur les trous pour fournir des ancrages pour l’acrylique dentaire.
  7. Placer la canule de guidage commercial sur le support de canule stéréotaxique et désinfecter avec le stérilisateur à billes de verre (150 °C).
    REMARQUE : La canule du guide commercial, le mannequin commercial et l’injecteur commercial (figure 2A) ont été personnalisés conformément aux spécifications indiquées dans le tableau des matériaux.
  8. Déplacez le porte-canule stéréotaxique vers le trou percé pour le ventricule latéral et insérez lentement la canule de guidage commerciale dans le trou jusqu’à la profondeur souhaitée (2,5 mm).
    NOTE: La coordonnée dorsale/ventrale peut être définie en définissant l’extrémité de la canule de guidage commerciale comme référence lorsque la pointe est à peine insérée dans le trou.
  9. Appliquez 10 μL d’adhésif cyanoacrylate de n-butyle (colle adhésive tissulaire) pour fixer la canule de guidage commerciale dans le trou percé et attendez 3-4 minutes. Retirez doucement la canule de guidage commercial du support de canule stéréotaxique et éloignez la douille.
  10. Appliquez l’acrylique dentaire sur le cuir chevelu incisé pour fixer la canule de guidage commercial et attendez au moins 5 min. Implanter le mannequin commercial dans la canule de guidage commercial pour éviter que la canule ne ne soit obstruée par le sang ou les liquides organiques (figure 2B).
  11. Libérez la barre auriculaire du conduit auditif et retirez la souris du cadre stéréotaxique.
  12. Placez la souris dans une nouvelle cage avec un coussin chauffant en dessous pour récupérer de l’anesthésie et observez continuellement jusqu’à ce que la souris se réveille complètement.
    REMARQUE : Ne laissez pas l’animal sans surveillance avant qu’il n’ait repris suffisamment conscience pour maintenir sa position couchée sternale. Un animal qui a subi une intervention chirurgicale ne doit pas retourner en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétabli.
  13. Retournez la souris dans un logement simple ou un logement de groupe, selon le protocole IACUC institutionnel et le plan expérimental. Pour le logement de groupe, assurez-vous que moins de souris sont logées dans une cage afin de minimiser les blessures indésirables ou le détachement de la canule.
  14. Administrer de l’ibuprofène (0,2 mg/mL) dans l’eau potable pendant au moins 3 jours pour les soins postopératoires et surveiller deux fois par jour les signes de douleur et de détresse pendant au moins 3 jours.
    1. Pendant les soins postopératoires, appliquez une pommade à la roxithromycine autour de la peau pour prévenir l’inflammation et l’infection chez les souris.
    2. Continuez à surveiller l’état de l’animal et donnez une injection intrapéritonéale opportune de glucose à 5% et / ou de chlorure de sodium à 0,9% pour fournir suffisamment d’énergie.
    3. Si l’état de douleur, de détresse ou d’infection se détériore régulièrement, euthanasier la souris par inhalation de CO2 .
  15. Attendez 1 semaine après l’opération pour que la souris soit prête pour l’administration intra-rébroventriculaire des AGCC et des tests comportementaux.

4. Préparation des AGCC

  1. Dissoudre l’acétate de sodium, le butyrate de sodium et le propionate de sodium dans le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) (voir le tableau des matériaux).
  2. Assurez-vous que les produits chimiques sont complètement dissous, puis ajustez le pH à 7,4 et filtrez le mélange d’AGCC à travers un filtre de 0,22 μm pour la stérilisation.

5. Mettre en place le système de perfusion pour l’administration intra-rébroventriculaire d’AGCC pendant les tests comportementaux

  1. Montez une caméra de plafond pour enregistrer le comportement. Connectez la caméra à un ordinateur pour contrôler le logiciel d’enregistrement vidéo (Figure 3).
  2. Remplissez une seringue de 10 μL avec de l’eau distillée.
    REMARQUE: Évitez les bulles d’air dans la seringue de microlitre.
  3. Connectez une pompe de micro-injection au contrôleur de micro-injection.
  4. Montez la seringue de microlitre sur la pompe de micro-injection. Pour installer la seringue, appuyez sur le bouton pour desserrer la pince et installez la seringue dans la position correspondante. Fermez la pince et serrez la vis de fixation du piston de la pompe de micro-injection (Figure 4A).
  5. Insérez l’injecteur commercial dans le tube en polyéthylène (figure 2A).
  6. Accrochez le tube en polyéthylène à la caméra de plafond au-dessus de l’arène de test.
  7. Remplissez le tube en polyéthylène avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue à insuline. Connectez la seringue de microlitre au tube en polyéthylène suspendu.
    REMARQUE: Assurez-vous que le tube en polyéthylène est suffisamment long pour permettre à la souris de se déplacer librement dans l’arène de test.

6. Paramètres système du contrôleur de micro-injection

  1. Mettez le contrôleur de micro-injection sous tension et appuyez sur Display All Channels (Afficher tous les canaux) pour accéder à l’écran de commande (Figure 4C). Appuyez sur Configuration et définissez Volume Target sur 9 800 nL avec Delivery Rate sur 100 nL/s. Infuser 9 800 nL d’eau distillée à partir du tube en polyéthylène connecté à la seringue de microlitre (appuyez sur Direction pour passer en mode Infuse et appuyez sur RUN) (voir les carrés rouges dans l’écran de commande de la figure 4C).
  2. Appuyez sur Configuration et définissez Volume Target à 3 000 nL avec Delivery Rate à 100 nL/s. Prélever 3 000 nL d’huile minérale (appuyez sur Direction pour passer en mode Retrait et appuyez sur RUN) (voir les carrés rouges dans l’écran de commande de la figure 4C).
    NOTE: Une séparation claire de la phase huile-eau doit être observée sur le tube en polyéthylène.
  3. Démontez le tube en polyéthylène de l’aiguille de la seringue de microlitre. Crachez 3 000 nL d’eau distillée de l’aiguille de la seringue de microlitre (appuyez sur Direction pour passer en mode Infuse et appuyez sur RUN).
  4. Réinsérez la seringue de microlitre dans le tube en polyéthylène. Appuyez sur Configuration et définissez Volume Target sur 9 500 nL avec Delivery Rate sur 100 nL/s. Retirez 9 500 nL d’AGCC (appuyez sur Direction pour passer en mode Retrait et appuyez sur RUN). Étiqueter la phase huile-AGCC pour valider si les AGCC sont perfusés avec succès.
  5. Appuyez sur Configuration et définissez l’objectif de volume souhaité avec un taux de livraison à 7 nL/s. Appuyez sur Direction pour passer en mode Infuser (voir les carrés rouges dans l’écran de commande de la figure 4C).
    REMARQUE: Déterminez le volume en fonction du temps de perfusion. Par exemple, si le temps de perfusion est de 3 min pour un débit de 7 nL/s, volume cible = 1 260 nL.
  6. Appuyez sur RUN pour perfuser la seringue de microlitre vers l’avant jusqu’à ce que le liquide sorte à l’extrémité avant de l’injecteur commercial avant d’insérer l’injecteur dans la canule pour l’injection d’AGCC.

7. Perfusion d’AGCC dans le ventricule latéral à travers la canule guide commerciale chez une souris en mouvement libre

  1. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la cage en plexiglas avec 1% -5% d’isoflurane dans l’oxygène.
    REMARQUE: Observez attentivement la souris pour vous assurer que la fréquence respiratoire est maintenue à environ une respiration par seconde.
  2. Frotter la souris et insérer l’injecteur commercial dans la canule de guidage commercial (Figure 4B).
    REMARQUE: Si la canule de guide commercial est bouchée, déboucher doucement avec une pince à épiler.
  3. Laissez la souris récupérer de l’anesthésie pendant 15 minutes dans une cage avant les tests comportementaux.
  4. Pour le test de locomotion de base, placez la souris dans une nouvelle cage et laissez-la explorer librement pendant 35 minutes. Infuser les AGCC en utilisant un débit de 7 nL /s pour un volume cible de 2 100 nL au cours des 5 premières minutes (appuyez sur Direction vers le mode Infuse et appuyez sur RUN).
    REMARQUE: La locomotion dans la nouvelle cage peut être analysée à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo du comportement animal21,22.
  5. Anesthésiez la souris (répétez l’étape 7.1) et retirez l’injecteur commercial de la canule de guidage commercial.
    REMARQUE: La souris peut être injectée à plusieurs reprises avec différents témoins / métabolites après avoir donné le temps approprié pour laver l’injection précédente. Tant que la canule est fixée sur la tête de la souris, la souris peut être testée à plusieurs reprises avec différents métabolites.

8. Restauration du système de micro-injection

  1. Démontez le tube en polyéthylène de la seringue de microlitre.
  2. Injectez de l’air dans le tube à l’aide de la seringue à insuline pour éliminer l’eau distillée dans le tube en polyéthylène. Videz la seringue du microlitre.
  3. Appuyez sur Reset Pos (Réinitialiser le point de vente) sur l’écran Configuration (Configuration) pour ouvrir l’écran Serinke Stop Definition (Définition de l’arrêt de la seringue) (Figure 4C).
  4. Appuyez sur Retirer jusqu’à ce qu’un bip sonore se produise pour remettre la pompe de micro-injection en position complètement retirée (Figure 4C).
  5. Revenez à l’écran de commande et éteignez le contrôleur de micro-injection si un signe ** FIN ATTEINT** s’affiche sur cet écran (Figure 4C).

9. Facultatif : Validation de l’injection intra-rebroventriculaire par traceur neural

  1. Infuser 2 100 nL du traceur neural avec un débit de 7 nL/s pour vérifier le site de perfusion.
    REMARQUE: Laissez l’injecteur dans la canule de guidage pendant 5 minutes pour éviter le refoulement.
  2. Anesthésier la souris par un surdosage d’isoflurane (5%) 30 min après la perfusion du traceur neural.
  3. Vérifiez la fréquence respiratoire et le réflexe de pincement de la queue et de la patte chez la souris anesthésiée.
    REMARQUE: Les souris ne doivent pas répondre avant l’étape suivante.
  4. Faites une incision de 4 à 5 cm à travers la peau, les muscles et la paroi abdominale sous la cage thoracique.
  5. Éloignez légèrement le foie du diaphragme avec précaution.
  6. Inciser le diaphragme pour exposer le cœur de la souris.
  7. Perfuser la souris à travers le cœur avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et du paraformaldéhyde glacé à 4% dans du PBS.
  8. Décapitater la souris et disséquer soigneusement le cerveau avec des pinces à microdissection et des ciseaux à microdissection pour éliminer tout le cerveau23. Placez les échantillons de cerveau dans du paraformaldéhyde glacé à 4% dans du PBS pendant 3-4 jours et lavez-les 3 x 5 min avec du PBS.
  9. Couper le cerveau en deux parties dans le support de tranche de cerveau de souris à la huitième coupe du support de tranche de cerveau de souris (1 mm / section) de la direction antérieure à postérieure. Placez le cerveau dans le moule d’encastrement et incorporez les échantillons de cerveau dans l’agarose à bas point de fusion (4% dans PBS).
  10. Collez le cerveau incrusté dans l’agarose sur la scène du vibratome à l’aide de superglue. Couper le cerveau coronalement en tranches de cerveau de 50 μm à l’aide du vibratome.
  11. Incuber les tranches de cerveau dans l’anticorps ciblant le traceur neural dilué dans un tampon de blocage (dilution 1:1 000) pendant une nuit à température ambiante.
    REMARQUE: Le tampon de blocage contenait 10% de sérum de cheval, 0,1% de Triton X-100 et 0,02% d’azoture de sodium.
  12. Laver les tranches 3 x 5 min avec PBST (PBS avec 0,1% de triton X-100).
  13. Incuber les tranches de cerveau dans un anticorps secondaire conjugué à fluorescence dilué dans un tampon bloquant (dilution 1:500) pendant 2 h à température ambiante.
  14. Laver les tranches 3 x 5 min avec du PBS.
  15. Fixez les tranches de cerveau sur la lame avec un support de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
  16. Couvrez la lame avec une lame-couverture de microscope.
  17. Appliquez du vernis à ongles sur le bord de la glissière pour éviter les fuites du support de montage.
  18. Après une nuit d’incubation à température ambiante, à l’abri de la lumière, imager le signal de fluorescence dans le site de perfusion à l’aide d’un microscope à fluorescence.

10. Facultatif : Perfusion de métabolites à travers une canule guide en acier inoxydable personnalisée dans le ventricule latéral chez la souris

  1. Suivez les sections 1 à 8 du protocole et remplacez la canule de guidage commerciale par une canule de guidage en acier inoxydable pour infuser des produits chimiques à travers un injecteur en acier inoxydable dans la souris.
    NOTE: Les avantages et les inconvénients des différentes canules commerciales et en acier inoxydable sont développés dans la section de discussion.
  2. Exécuter le protocole chirurgical de la même manière que celle décrite dans les sections 2 et 3 du protocole, sauf n’oubliez pas de remplacer la canule de guidage commerciale par une canule de guidage en acier inoxydable (Figure 5B).
    REMARQUE : La canule de guidage en acier inoxydable, le mannequin en acier inoxydable et l’injecteur en acier inoxydable (figure 5A) ont été personnalisés conformément aux spécifications indiquées dans le tableau des matériaux. Insérez la canule de guidage en acier inoxydable personnalisée dans le trou jusqu’à la profondeur souhaitée (2,0 mm).
  3. Infuser les AGCC via la canule guide en acier inoxydable à l’aide du système de microinjection composé du contrôleur de microinjection et de la pompe de microinjection (figure 4B) (identique aux sections de protocole 4 à 7). Pour le mannequin en acier inoxydable de la canule guide en acier inoxydable, pliez doucement un côté de l’injecteur en acier inoxydable jusqu’à ce que la pointe de l’autre côté soit 1 mm plus longue que la canule de guidage en acier inoxydable.
  4. Infuser 2 100 nL du traceur neural à travers la canule guide en acier inoxydable dans le ventricule latéral chez la souris (identique à la section 9 du protocole).
  5. Prélever l’échantillon pendant 30 minutes après la perfusion du traceur neural (identique à la section 9 du protocole).
  6. Effectuez l’acquisition d’images dans les tranches de cerveau infusées du traceur neuronal (identique à la section 9 du protocole).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La souris a reçu des AGCC 1 semaine après la récupération de l’implantation de la canule guide pour évaluer l’activité locomotrice dans une nouvelle cage. La souris a été placée dans une nouvelle cage et perfusée avec 2 100 nL d’AGCC ou d’ACSF dans les 5 premières minutes (taux d’administration de 7 nL/s) dans le cerveau par la canule guide commerciale implantée dans le ventricule latéral du cerveau. L’activité locomotrice dans une nouvelle cage a été enregistrée pendant 30 minutes supplémentaires après la perfusion. Auc...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les métabolites dérivés de l’intestin ont été associés à des maladies à médiation cérébrale sans mécanisme très précis, en partie à cause de leurs multiples sites de liaison dans le corps 6,12,24. Des rapports antérieurs indiquaient que les AGCC pouvaient servir de ligands pour les récepteurs couplés aux protéines G, les régulateurs épigénétiques et les sources de production d’énergie à plusieurs endroits dans le corps

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.

Remerciements

Nous remercions le personnel du Centre des animaux de laboratoire de l’Université nationale Cheng Kung (NCKU) pour avoir pris soin des animaux. Ce travail a été soutenu par la bourse du Fonds d’éducation du professeur Kun-Yen Huang de la Fondation médicale CHENG-HSING à C.-W.L.; les fonds du Ministère de la science et de la technologie (MOST) à Taïwan : (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) à T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) à W.-L.W.; et le projet de germination de l’enseignement supérieur, du Ministère de l’éducation au siège de l’avancement universitaire à NCKU à W.-L.W.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofène A2 :D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 âne anti-lapinThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)MilliporeAB153-I
Filtre à vide pour flacon, 500 mL, 0.22 &mu ; m, PES, StérileNEST121921LA01
CaCl2  ;Sigma-AldrichC1016ACSF : 0,14 g/L
Gommage à la chlorhexidine 2 %PhoenixNDC 57319-611-09
Solution de chlorhexidinePhoenixNDC 57319-599-09
Mannequin professionnelRWD Life Science62004Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Canule de guidage commercialeRWD Life Science62104Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm  ;
Injecteur professionnelRWD Life Science62204Single_OD 0,21 mm-33G/ S’accouple avec M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF : 0,61 g/L
Acrylique dentaireHYGENICn/a
Vis de fixationRWD Life Science62521
Milieu de montage Fluoroshield avec DAPIAbcamAB104139
Sérum de chevalThermoFisher Scientific16050130
Seringues à insulineBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurane  ;Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl  ;Sigma-AldrichP3911ACSF : 0,19 g/L
kétoprofène  ;Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaïne  ;AstraZenecan/a
Agarose à faible point de fusionInvitrogen16520
MgCl2 ;Sigma-AldrichM8266ACSF : 0.19 g/L
Lamelles de microscopeMARIENFELD101242
Lames de microscopeThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Huile minérale légère, blanche NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl  ;Sigma-AldrichS9888ACSF : 7,46 g/L
NaH2PO4  ;Sigma-AldrichS8282ACSF : 0,18 g/L
de NaHCO3 ;Sigma-AldrichS5761ACSF : 1,76 g/L
d’adhésif cyanoacrylate n-butyle (colle pour tissus)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer  ;Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148
Tube en polyéthylèneRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm et OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (œil) Pommade Dechra  ;
Acétate de sodiumAGCC Sigma-AldrichS2889: 13,5 mM
d’azoture de sodium.Sigma-AldrichS2002
Butyrate de sodium  ;AGCC Sigma-AldrichB5887: 8 mM
de propionate de sodium.Sigma-AldrichP1880SCFAs : 5.18 mM
Canule de guidage en acier inoxydableChun Ta entreprise en acier inoxydable CO., LTD.n/aDiamètre extérieur 0,63 mm ; Fournisseur local
Injecteur en acier inoxydableChun Ta entreprise en acier inoxydable CO., LTD.n/aOD 0,3 mm ; le mannequin est fabriqué à partir d’un injecteur ; vendeur local
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Support de canuleRWD Life ScienceB485-68217
Caméra de plafondFOSCAMR2
Instruments stéréotaxiques numériquesStoelting51730D
Microscope de dissectionINNOVIEWSEM-HT/TW
Stérilisateur à billes de verreRWD Life ScienceRS1501
Coussin chauffantStoelting53800M
Microscope Leica  ;LeicaDM2500
Micro pince à dissectionROBOZRS-5136dentelée, légère courbure ; Extra délicat ; Largeur de pointe de 0,5 mm ; Longueur de 4 po  ;
Micro Ciseaux de dissectionROBOZRS-59184.5" Angled Sharp
Contrôleur de micro-injectionWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TSMARTouch Controller
Pompe à seringue de micro-injectionWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3  ;   ;
Seringue d’un microlitreHamilton8001410 & micro ; L
Fibre optique Lumière froide avec double étape de fibreLGY-150Fournisseur local
Tondeuse pour animaux de compagnieWAHL09962-2018
Vaporisateur pour IsofluraneÉtapeAS-01Vendeur local
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Animal behavior video logiciel de suiviNoldusEthoVisionVersion : 15.0.1416
Logiciel Leica Application Suite XLeicaLASXVersion : 3.7.2.22383
de 12920060

Références

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25(2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22(2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939(2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428(2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252(2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023(2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941(2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157(2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879(2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540(2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3(2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28(2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987(2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157(2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Microbiote intestinalAcides gras à chaîne courteCanule guideChirurgie stéréotaxiqueAxe intestin-cerveauTests comportementauxMicroscopie à fluorescence
Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.