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Article de méthode

Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

4K vues

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DOI :

10.3791/63979

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17 février 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.

Résumé

La résistance à l’insuline est un effet réduit de l’insuline sur ses cellules cibles, généralement dérivé d’une diminution de la signalisation des récepteurs de l’insuline. La résistance à l’insuline contribue au développement du diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies dérivées de l’obésité à forte prévalence dans le monde entier. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents à la résistance à l’insuline est d’une grande pertinence. Plusieurs modèles ont été utilisés pour étudier la résistance à l’insuline in vivo et in vitro; Les adipocytes primaires représentent une option intéressante pour étudier les mécanismes de la résistance à l’insuline et identifier les molécules qui contrecarrent cette condition et les cibles moléculaires des médicaments sensibilisants à l’insuline. Ici, nous avons établi un modèle de résistance à l’insuline en utilisant des adipocytes primaires en culture traités avec le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α).

Les cellules précurseurs adipocytaires (APC), isolées du tissu adipeux sous-cutané de souris digéré par collagéase par la technologie de séparation cellulaire magnétique, sont différenciées en adipocytes primaires. La résistance à l’insuline est ensuite induite par un traitement au TNF-α, une cytokine pro-inflammatoire qui réduit la phosphorylation / activation de la tyrosine des membres de la cascade de signalisation de l’insuline. La diminution de la phosphorylation du récepteur de l’insuline (IR), du substrat du récepteur de l’insuline (IRS-1) et de la protéine kinase B (AKT) est quantifiée par transfert Western. Cette méthode fournit un excellent outil pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux.

Introduction

L’insuline est une hormone anabolique produite par les β-cellules des îlots pancréatiques et le régulateur clé du métabolisme du glucose et des lipides. Parmi ses nombreuses fonctions, l’insuline régule l’absorption du glucose, la synthèse du glycogène, la gluconéogenèse, la synthèse des protéines, la lipogenèse et la lipolyse1. Le signal moléculaire initial après interaction de l’insuline avec son récepteur (IR) est l’activation de l’activité intrinsèque de la protéine tyrosine kinase de l’IR2, entraînant son autophosphorylation3 et l’activation ultérieure d’une famille de protéines connues sous le nom de substrats des récepteurs de l’insuline (PID), qui se lie aux protéines adaptatrices conduisant à l’activation d’une cascade de protéines kinases4 . L’insuline active deux voies de signalisation principales: la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-protéine kinase B (AKT) et la protéine kinase activée par Ras-mitogène (MAPK). Le premier constitue un point de branche ou nœud majeur 4,5 pour l’activation de nombreux effecteurs en aval impliqués dans diverses fonctions physiologiques, y compris la régulation de l’homéostasie du carburant, tandis que le second régule la croissance et la différenciation cellulaires 4,6. Les actions de l’insuline dépendent en fin de compte du type cellulaire et du contexte physiologique7.

L’un des principaux tissus métaboliques sensibles à l’insuline est le tissu adipeux. Le tissu adipeux blanc est le type de graisse le plus abondant chez les humains et les rongeurs, distribué dans la graisse sous-cutanée (entre la peau et les muscles) et la graisse viscérale (autour des organes de la cavité abdominale). Compte tenu de leur grand volume, les adipocytes ou cellules graisseuses sont le type de cellule le plus abondant dans le tissu adipeux. Ces cellules graisseuses peuvent être brunes/beiges (thermogéniques), roses (dans la glande mammaire) et blanches 8,9. Les adipocytes blancs conservent les principales réserves d’énergie dans le corps sous forme de triglycérides, un processus insulino-dépendant. L’insuline favorise le transport du glucose et la lipogenèse, tout en inhibant la lipolyse ou la dégradation des lipides 7,10. Il facilite également la différenciation des préadipocytes en adipocytes – les cellules matures stockant les graisses11.

La résistance à l’insuline se produit lorsqu’un taux d’insuline normal produit une réponse biologique atténuée, entraînant une hyperinsulinémie compensatoire12. La résistance à l’insuline est une affection associée au surpoids et à l’obésité5 qui, lorsqu’elle est combinée, entraîne le diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies métaboliques13. L’hyperinsulinémie compense la résistance à l’insuline dans les tissus périphériques pour maintenir une glycémie normale14. Cependant, la perte ou l’épuisement éventuel de cellules β, ainsi qu’une résistance exacerbée à l’insuline, entraînent une glycémie élevée compatible avec le DT25. Par conséquent, la résistance à l’insuline et l’hyperinsulinémie peuvent contribuer au développement de maladies métaboliques dérivées de l’obésité15. En outre, l’obésité peut provoquer une inflammation locale chronique de bas grade favorisant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux15,16,17. En outre, les altérations du tissu adipeux dérivées de l’obésité, telles que la fibrose, l’inflammation et la réduction de l’angiogenèse et de l’adipogenèse, entraînent une baisse des taux sériques d’adiponectine (un sensibilisant à l’insuline) et une augmentation de la sécrétion de facteurs tels que l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène 1 (PAI-1), les acides gras libres et les exosomes dans la circulation sanguine, exacerbant la résistance à l’insuline17.

De nombreux aspects sous-jacents à la résistance à l’insuline restent inconnus. Des modèles in vitro et in vivo ont été développés pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans les principaux tissus cibles, y compris le tissu adipeux. L’avantage des modèles in vitro est que les chercheurs ont plus de contrôle sur les conditions environnementales et peuvent évaluer la résistance à l’insuline dans des types cellulaires spécifiques. En particulier, les cellules précurseurs adipocytaires (APC) ont le phénotype individuel du tissu donneur, ce qui pourrait mieux refléter la physiologie que les lignées cellulaires adipocytes. L’un des principaux facteurs induisant la résistance à l’insuline in vitro est le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α). Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire sécrétée par les adipocytes et les macrophages dans le tissu adipeux18. Bien qu’elle soit nécessaire pour un remodelage et une expansion appropriés du tissu adipeux19, l’exposition à long terme au TNF-α induit une résistance à l’insuline dans le tissu adipeux in vivo et dans les adipocytes in vitro20. Le traitement chronique par le TNF-α de plusieurs types cellulaires entraîne une augmentation de la phosphorylation de la sérine de l’IR et de l’IRS-1, favorisant ainsi une diminution de la phosphorylation de la tyrosine21. L’augmentation de la phosphorylation de l’IRS-1 sur les résidus de sérine inhibe l’activité de la tyrosine kinase IR et peut être l’un des principaux mécanismes par lesquels le traitement chronique par le TNF-α altère l’action de l’insuline22,23. Le TNF-α active des voies impliquant l’inhibiteur de la sérine/thréonine kinase du facteur nucléaire ĸB kinase β (IKKβ) et de la kinase terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induit un programme transcriptionnel pro-inflammatoire complexe mais phosphoryle aussi directement IRS-16.

Comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline est devenu de plus en plus important pour guider le développement de futures thérapies contre le DT2. Les APC se sont révélés être un excellent modèle pour l’étude de la biologie des cellules adipeuses, y compris la sensibilité et la résistance à l’insuline, et pour identifier les propriétés intrinsèques des adipocytes indépendamment de l’environnement systémique. Les APC peuvent être facilement obtenus à partir de différents dépôts adipeux et, dans les conditions appropriées, différenciés en adipocytes matures. Avec cette méthode, les effets directs sur la résistance / sensibilité à l’insuline peuvent être évalués dans les adipocytes.

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Protocole

Toutes les expériences sur les rongeurs ont été approuvées par le Comité de bioéthique de l’Institut de neurobiologie de l’UNAM, protocole numéro 075.

1. Isolement de cellules précurseurs adipocytaires de souris

  1. Euthanasier des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines (p. ex. par inhalation de CO2 et luxation cervicale subséquente) (quatre animaux par isolement). Désinfectez les souris en frottant avec de l’éthanol à 70% et obtenez le tissu adipeux immédiatement après le sacrifice.
    REMARQUE: Après l’euthanasie des rongeurs, isoler immédiatement le tissu adipeux et effectuer toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile. Les souris sont maintenues sous des cycles lumière/obscurité de 12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
  2. Disséquer le tissu adipeux sous-cutané inguinal de chaque souris. Retirer seulement le tissu adipeux, en évitant l’ablation du muscle, de la peau ou de tout autre tissu, et le recueillir dans un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de solution de collagénase de type 1 (1,5 mg/mL) sur de la glace. Dissoudre la collagénase de type 1 dans l’albumine sérique bovine (BSA) à haute teneur en glucose et 1% de Dulbecco Eagle Medium (DMEM) et filtrer à travers des filtres à seringue de 0,2 μm.
  3. Couper le tissu adipeux en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux stériles et digérer les échantillons par incubation avec une solution de collagénase de type 1 à 37 °C dans un agitateur orbital (150 tr/min) pendant 30 min (placer le tube contenant de la graisse et de la collagénase en position horizontale pour une plus grande surface agitée). Vérifiez la digestion toutes les 10 minutes pour vous assurer qu’elle fonctionne (la dégradation des tissus est visible) et pour éviter la surdigestion (voir la figure supplémentaire S1).
  4. Filtrer à l’aide d’une seringue à mailles de 200 μm (préalablement autoclavée) pour éliminer les tissus non digérés avec de la collagénase. Passez le filtre sur le bord du tube pour drainer autant de cellules que possible dans la solution. Ajouter 15 mL de DMEM-1% BSA froid pour arrêter la digestion et centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C.
  5. Aspirer la couche supérieure contenant les adipocytes matures et la majeure partie de la couche liquide; Évitez de toucher ou de déranger le granulé. Ajouter 20 mL de sérum de bœuf bovin fœtal (PBS) tamponné au phosphate froid (PBS) à 2 % et remettre le granulé en suspension. Centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  6. Retirez le surnageant, en aspirant d’abord la couche supérieure pour éliminer les adipocytes et la graisse restants. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lyse de chlorure d’ammonium potassium (ACK) (pour lyser les globules rouges) et incuber sur de la glace pendant 5 min. Ajouter 10 mL de PBS-2% FBS, mélanger et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de solution anti-Fc (CD16/CD32 anti-souris de rat purifié dilué dans du FBS PBS-2% [1:150]) pour réduire la liaison médiée par le récepteur Fc par les anticorps d’intérêt. Incuber sur la glace pendant 5 min. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 5 mL qui s’insère dans les racks prérefroidis d’un séparateur de cellules magnétiques et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  8. Éliminer le surnageant, ajouter 200 μL du mélange d’anticorps monoclonal CD31(PECAM-1) (390)-biotine (1:100) et d’anticorps monoclonal CD45 (30-F11)-biotine (1:100), bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 minutes (préparer les dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc; voir Tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
    NOTE: CD31 et CD45 sont des marqueurs des cellules endothéliales et des cellules hématopoïétiques, respectivement.
  9. Aspirer le surnageant et incuber dans 100 μL de microbilles antibiotines (1:5) pendant 15 min sur glace (préparer des dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc, voir le tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 350 μL de PBS-2% FBS. Éliminer les agrégats cellulaires ou les grosses particules des suspensions unicellulaires à l’aide d’un filtre de préséparation (70 μm). Tout d’abord, activez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS, passez la suspension cellulaire à travers le filtre (recueillir dans un tube propre) et enfin lavez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS.
  11. Effectuer la séparation magnétique des cellules en utilisant la stratégie de séparation négative avec un séparateur de cellules magnétiques.
    1. Placer l’échantillon dans la position A de la grille de refroidissement (s’assurer que la grille est prérefroidie) et deux tubes vides en position B et C pour récupérer les cellules non marquées et étiquetées, respectivement.
    2. Chargez le tampon de lavage et le tampon de fonctionnement dans les bouteilles correspondantes avant d’allumer l’équipement. Programmer l’équipement pour effectuer la séparation magnétique des cellules avec le protocole DEPLETE .
      REMARQUE: Ce protocole est pour la déplétion en mode standard pour l’élimination des cellules avec une expression antigénique normale (dans ce cas, les cellules marquées avec anti-CD31 et anti-CD45), si la récupération est la plus haute priorité.
    3. Dans la section de séparation , sélectionnez le nombre d’échantillons à séparer et sélectionnez le protocole DEPLETE . Appuyez sur Exécuter et démarrez la séparation. À la fin du programme, récupérer les cellules non marquées et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  12. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de milieu de croissance (tableau 1).
  13. Ensemencer les APC dans un puits d’une plaque de 12 puits préalablement recouverte d’une matrice membranaire basale à 2,5 % (environ 50 000 à 75 000 cellules sont obtenues). Ajouter 400 μL de matrice membranaire basale à 2,5 % pour couvrir toute la surface de chaque puits. Immédiatement après avoir retiré l’excès de solution et ne laisser qu’une petite couche, laissez sécher la plaque (sans couvercle) à l’intérieur de la hotte à flux laminaire pendant au moins 1 h. Incuber à 37 °C dans une atmosphère de 5% de CO2 . Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
  14. À 80% de confluence, retirer complètement le milieu et laver avec 350 μL de PBS-2% FBS. Récolter les cellules avec 350 μL de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 2 min à 37 °C. Ajouter 2 mL de milieu de croissance et recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 50 mL, puis centrifuger à 400 × g pendant 5 min.
  15. Passage des APC vers des plaques à 12 puits (10 000 à 20 000 cellules par puits) préalablement recouvertes d’une matrice membranaire basale à 2,5 %. Incuber à 37 °C avec 5% de CO2. Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
    REMARQUE: Les APC peuvent être passés une fois. Par la suite, ils perdent leur capacité à proliférer et à se différencier. Voir le workflow pour le processus d’isolation des APC dans la figure supplémentaire S2.

2. Différenciation des adipocytes et induction de la résistance à l’insuline

REMARQUE : Maintenir les cellules à 37 °C dans 5 % de CO2 et effectuer des étapes impliquant un changement de milieu et des traitements avec du TNF-α et de l’insuline à l’intérieur d’une cagoule stérile.

  1. À 80% de confluence, commencer le processus de différenciation; aspirer tout milieu de croissance et le remplacer par 500 μL de milieu de différenciation (tableau 1) contenant 3,3 nM de protéine morphogénétique osseuse (BMP4) dans chaque puits.
  2. Après 48 h, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (500 μL par puits) et le cocktail de différenciation (tableau 1).
  3. Retirer le milieu 72 h plus tard et ajouter 100 nM d’insuline dans 500 μL de milieu de différenciation frais.
    REMARQUE: Les cellules commencent à montrer un aspect rond avec de petites gouttelettes lipidiques à l’intérieur.
  4. Aspirer tout milieu de différenciation et le remplacer par 500 μL de milieu simple - FBS à 2% (tableau 1) 48 h plus tard. Induire une résistance à l’insuline avec 4 ng/mL de TNF-α. Inclure les puits témoins sans traitement au α au TNF.
  5. Après 24 heures d’incubation, ajouter 4 ng/mL de TNF-α dans du FBS simple à 0 % (tableau 1). Maintenir les puits de contrôle sans traitement au α TNF.
  6. Activer la voie de signalisation de l’insuline 24 h plus tard en ajoutant 100 nM d’insuline et incuber pendant 15 min à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Retirer le milieu et laver avec 500 μL de PBS. Inclure les puits témoins sans traitement à l’insuline.

3. Évaluation de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western

  1. Extraction et quantification des protéines
    1. Lavez chaque puits de cellules avec 500 μL de PBS et conservez-les sur la glace pour lyser les cellules dans 50 μL de tampon RIPA (tableau 1) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase à 1 % ajouté juste avant l’isolement de l’échantillon. Grattez toute la surface du puits avec une pointe et transférez le lysat dans un tube microcentrifuge de 0,6 mL (garder sur la glace).
    2. Incuber pendant 1 h à 4 °C dans un agitateur rotatif, mélanger par tourbillon, centrifuger à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C et récupérer le surnageant (garder sur la glace).
    3. Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford (ne pas diluer l’échantillon pour quantifier).
    4. Prélever le volume nécessaire correspondant à 40-60 μg et dénaturer avec 6x tampon Laemmli (tableau 1) en incubant à 97 °C pendant 15 min tout en agitant à 550 tr/min. Congeler jusqu’à utilisation.
  2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
    1. Effectuer une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) avec un gel de polyacrylamide à 7,5% d’épaisseur de 1,5 mm. Insérez le gel dans le réservoir et remplissez-le de tampon courant (tableau 1).
    2. Ajouter 3 μL de protéine étalon précolorée au premier puits du gel et charger chaque échantillon dans les puits suivants.
    3. Exécutez le gel à 80 V pendant environ 15 minutes pour s’assurer que l’échantillon pénètre dans la matrice de gel du concentrateur de polyacrylamide. Par la suite, augmentez la tension à 90 V pendant 2,5 h ou jusqu’à ce que le marqueur de poids moléculaire de 37 kDa puisse être vu sur le bord inférieur du gel.
    4. Transférer les protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose dans une chambre semi-sèche pendant 35 min à 25 V. Au préalable, immergez le gel, la membrane et les filtres dans un tampon de transfert (tableau 1) pendant quelques minutes.
  3. Western blot
    1. Après le transfert, laver la membrane avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 0,1 % de Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (tableau 1) pendant 3 min en agitant à 30 tr/min.
    2. Bloquer la membrane avec une solution de blocage (tableau 1) à 4 °C pendant 1 h en rotation constante.
    3. Couper la membrane en trois parties selon le marqueur de poids moléculaire à incuber pendant une nuit avec différents anticorps primaires (dilués dans une solution bloquante) à 4 °C en rotation constante : anticorps Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1 000), bande attendue à 180 kDa ; Anticorps β récepteur phospho-insuline (Tyr1150/1151) (1:1 000), bande attendue à 95 kDa; Anticorps Phospho-Akt (Ser473) (1:1 000), bande attendue à 60 kDa.
    4. Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.
    5. Incuber les membranes avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase correspondant (dilué dans une solution bloquante) pendant 2 h à température ambiante en rotation constante : peroxydase affiniPure ânesse anti-lapin IgG (H+L) (1:5 000).
    6. Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.
    7. Détecter les protéines à l’aide du système de détection par chimiluminescence. Préparez le substrat conformément aux instructions du fabricant.
    8. Placez le transfert dans un sac en plastique et ajoutez 200 μL de substrat chimioluminescent pour recouvrir complètement la membrane. Vidangez l’excès de substrat et éliminez les bulles d’air.
    9. Exposez chaque transfert pendant 30-60 s dans un système d’imagerie haute performance compatible avec la chimiluminescence.
    10. Dénuder les membranes (étapes 10 à 13 de la section Western blot) pour briser les interactions anticorps-antigène et permettre ainsi aux membranes de nitrocellulose d’être regonflées. Récupérer les membranes et laver 3x pendant 5 min chacune avec TBS-T 1% à 50 tr/min.
    11. Incuber pendant 7 min avec 10 mL de NaOH 0,2 M à 50 rpm.
    12. Laver 3x pendant 5 min chacun avec de l’eau du robinet à 50 tr/min.
    13. Laver pendant 10 min avec TBS-T 1 % à 50 tr/min.
    14. Répéter les étapes 2 à 9 de la section Western blot pour incuber la membrane avec de la tubuline anti-bêta (55 kDa) comme contrôle de charge en utilisant une dilution de 1:1 000.
    15. Effectuer une analyse densitométrique25 pour chaque protéine à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

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Résultats

Au cours des dernières années, la prévalence accrue de l’obésité et du DT2 a suscité une recherche intense des mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux. Avec le protocole décrit ici, les APC peuvent être différenciés en adipocytes matures pour évaluer la résistance et la sensibilité à l’insuline. Une fois que les APC atteignent la confluence, il faut 10 jours pour compléter leur différenciation en adipocytes matures et leur induction de résistance à l’insuline médiée par le TNF α (

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Discussion

Cet article fournit une méthode pour étudier la résistance à l’insuline qui utilise des adipocytes primaires dans la culture traitée avec le TNF-α. Ce modèle présente l’avantage que les adipocytes primaires peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant de longues périodes avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires26. La durée du test est de 15 à 20 jours, bien que des variations dans le pourcentage d’adipocytes différenciés puissent se produire entre les expérie...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla et María Antonieta Carbajo pour leur assistance technique, et Jessica Gonzalez Norris pour l’édition critique du manuscrit. Ce protocole a été soutenu par Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (à Y.M.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1. Cellules précurseurs adipocytaires de souris d’isolement
  ;LONZA10-548E
Microbilles anti-biotine  ;Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
Séparateur AutoMACS ProMiltenyi
Matrice de membrane basale (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Facteur
de croissance BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Anticorps monoclonal (30-F11) - Biotine  ;eBioscience13-0451-85
Colgénase de type 1Worthington BiochemLS004197
DexaméthasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM faible teneur en glucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Facteur
de croissance FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
Acide L-ascorbique 2-phosphateSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Facteur de croissance
Acide linoléique-albumineSigmaL9530
MCDB 201 moyenSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB  ;Peprotech315-18Facteur de croissance
Péniciline-StreptomycineBioWestL0022-100
Filtres de pré-séparation (70 µ ; m)Miltenyi130-095-823
Anti-souris pour rat purifié CD16 / CD32  ;BD Pharmingen553142
Trypsine-EDTA  ;GIBCO25300062
2. Différenciation adipocytaire et induction de la résistance à l’insuline
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]SigmaI5879Cocktail de différenciation
BMP4R& D Systems5020-BP-010Cocktail de différenciation
DexaméthasoneSigmaD1756Cocktail de différenciation
InsulinSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Cocktail de différenciation
TNF&alpha ;R& D Systems210-TA-005  ;
3. Évaluation de la voie de signalisation de l’insuline par western blot
Anticorps anti-tubulinebêta Abcamab6046
Bleu de bromophénolBioRad161-0404Tampon Laemmli
EDTASigmaE5134Tampon RIPA
EGTASigmaE4378Tampon RIPA
Système FluorChem EProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Tampon Laemmli
GlycineSigmaG7126Tampon de fonctionnement et de transfert
IgepalSigmaI3021Tampon RIPA
2- mercaptoethanolSigmaM3148Tampon Laemmli
MéthanolJT Baker907007Tampon
de transfertNaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379Tampon RIPA
NaOH  ;JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762Tampon RIPA
Na3VO4SigmaS6508Tampon RIPA
Membrane nitrocellulosique  ;BioRad1620112
Lait écrémé en poudreBioRad1706404Solution bloquante
Étalon protéique précoloré  ;BioRad1610395
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigmaP8340-5ML
Peroxydase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  ;Jackson ImmunoResearch711-035-132
Récepteur phospho-insuline &bêta ;   ;Signalisation cellulaire3024
Phospho-Akt (Ser473) AnticorpsSignalisation cellulaire9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) AnticorpsMillipore9432
Saccharose  ;JT Baker407205Tampon RIPA
SDSBioRad1610302Tampon de course et laemmli
SuperSignal West Pico PLUS Substrat chimiluminescentThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Tampon de course, de transfert et laemmli
Tris-HClJT Baker4103-02Tampon RIPA - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T
ACK

Références

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
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Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline
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