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Article de méthode

Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

4K vues

DOI :

10.3791/63979

17 février 2023

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.

Résumé

La résistance à l’insuline est un effet réduit de l’insuline sur ses cellules cibles, généralement dérivé d’une diminution de la signalisation des récepteurs de l’insuline. La résistance à l’insuline contribue au développement du diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies dérivées de l’obésité à forte prévalence dans le monde entier. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents à la résistance à l’insuline est d’une grande pertinence. Plusieurs modèles ont été utilisés pour étudier la résistance à l’insuline in vivo et in vitro; Les adipocytes primaires représentent une option intéressante pour étudier les mécanismes de la résistance à l’insuline et identifier les molécules qui contrecarrent cette condition et les cibles moléculaires des médicaments sensibilisants à l’insuline. Ici, nous avons établi un modèle de résistance à l’insuline en utilisant des adipocytes primaires en culture traités avec le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α).

Les cellules précurseurs adipocytaires (APC), isolées du tissu adipeux sous-cutané de souris digéré par collagéase par la technologie de séparation cellulaire magnétique, sont différenciées en adipocytes primaires. La résistance à l’insuline est ensuite induite par un traitement au TNF-α, une cytokine pro-inflammatoire qui réduit la phosphorylation / activation de la tyrosine des membres de la cascade de signalisation de l’insuline. La diminution de la phosphorylation du récepteur de l’insuline (IR), du substrat du récepteur de l’insuline (IRS-1) et de la protéine kinase B (AKT) est quantifiée par transfert Western. Cette méthode fournit un excellent outil pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux.

Introduction

L’insuline est une hormone anabolique produite par les β-cellules des îlots pancréatiques et le régulateur clé du métabolisme du glucose et des lipides. Parmi ses nombreuses fonctions, l’insuline régule l’absorption du glucose, la synthèse du glycogène, la gluconéogenèse, la synthèse des protéines, la lipogenèse et la lipolyse1. Le signal moléculaire initial après interaction de l’insuline avec son récepteur (IR) est l’activation de l’activité intrinsèque de la protéine tyrosine kinase de l’IR2, entraînant son autophosphorylation3 et l’activation ultérieure d’une famille de protéines connues sous ....

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Protocole

Toutes les expériences sur les rongeurs ont été approuvées par le Comité de bioéthique de l’Institut de neurobiologie de l’UNAM, protocole numéro 075.

1. Isolement de cellules précurseurs adipocytaires de souris

  1. Euthanasier des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines (p. ex. par inhalation de CO2 et luxation cervicale subséquente) (quatre animaux par isolement). Désinfectez les souris en frottant avec de l’éthanol à 70% et obtenez le tissu adipeux immédiatement après le sacrifice.
    REMARQUE: Après l’euthanasie des rongeurs, isoler immédiatement le tissu adipeux et effectuer toutes les étapes à l....

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Résultats

Au cours des dernières années, la prévalence accrue de l’obésité et du DT2 a suscité une recherche intense des mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux. Avec le protocole décrit ici, les APC peuvent être différenciés en adipocytes matures pour évaluer la résistance et la sensibilité à l’insuline. Une fois que les APC atteignent la confluence, il faut 10 jours pour compléter leur différenciation en adipocytes matures et leur induction de résistance à l’insuline médiée par le TNF α (

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Discussion

Cet article fournit une méthode pour étudier la résistance à l’insuline qui utilise des adipocytes primaires dans la culture traitée avec le TNF-α. Ce modèle présente l’avantage que les adipocytes primaires peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant de longues périodes avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires26. La durée du test est de 15 à 20 jours, bien que des variations dans le pourcentage d’adipocytes différenciés puissent se produire entre les expérie.......

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla et María Antonieta Carbajo pour leur assistance technique, et Jessica Gonzalez Norris pour l’édition critique du manuscrit. Ce protocole a été soutenu par Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (à Y.M.).

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1. Cellules précurseurs adipocytaires de souris d’isolement
  ;LONZA10-548E
Microbilles anti-biotine  ;Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
Séparateur AutoMACS ProMiltenyi
Matrice de membrane basale (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Facteur
de croissance BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Anticorps monoclonal (30-F11) - Biotine  ;eBioscience13-0451-85
Colgénase de type 1Worthington BiochemLS004197
DexaméthasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM faible teneur en glucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Facteur
de croissance FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
Acide L-ascorbique 2-phosphateSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Facteur de croissance
Acide linoléique-albumineSigmaL9530
MCDB 201 moyenSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB  ;Peprotech315-18Facteur de croissance
Péniciline-StreptomycineBioWestL0022-100
Filtres de pré-séparation (70 µ ; m)Miltenyi130-095-823
Anti-souris pour rat purifié CD16 / CD32  ;BD Pharmingen553142
Trypsine-EDTA  ;GIBCO25300062
2. Différenciation adipocytaire et induction de la résistance à l’insuline
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]SigmaI5879Cocktail de différenciation
BMP4R& D Systems5020-BP-010Cocktail de différenciation
DexaméthasoneSigmaD1756Cocktail de différenciation
InsulinSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Cocktail de différenciation
TNF&alpha ;R& D Systems210-TA-005  ;
3. Évaluation de la voie de signalisation de l’insuline par western blot
Anticorps anti-tubulinebêta Abcamab6046
Bleu de bromophénolBioRad161-0404Tampon Laemmli
EDTASigmaE5134Tampon RIPA
EGTASigmaE4378Tampon RIPA
Système FluorChem EProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Tampon Laemmli
GlycineSigmaG7126Tampon de fonctionnement et de transfert
IgepalSigmaI3021Tampon RIPA
2- mercaptoethanolSigmaM3148Tampon Laemmli
MéthanolJT Baker907007Tampon
de transfertNaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379Tampon RIPA
NaOH  ;JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762Tampon RIPA
Na3VO4SigmaS6508Tampon RIPA
Membrane nitrocellulosique  ;BioRad1620112
Lait écrémé en poudreBioRad1706404Solution bloquante
Étalon protéique précoloré  ;BioRad1610395
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigmaP8340-5ML
Peroxydase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  ;Jackson ImmunoResearch711-035-132
Récepteur phospho-insuline &bêta ;   ;Signalisation cellulaire3024
Phospho-Akt (Ser473) AnticorpsSignalisation cellulaire9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) AnticorpsMillipore9432
Saccharose  ;JT Baker407205Tampon RIPA
SDSBioRad1610302Tampon de course et laemmli
SuperSignal West Pico PLUS Substrat chimiluminescentThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Tampon de course, de transfert et laemmli
Tris-HClJT Baker4103-02Tampon RIPA - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T
ACK

Références

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. ....

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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