Article de méthode

Fabrication et caractérisation de nano-matrice Janus Base couche par couche pour favoriser la régénération du cartilage

DOI :

10.3791/63984

⸱

6 juillet 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit l’assemblage d’un échafaudage de nanomatrice de base Janus (JBNm) couche par couche en ajoutant des nanotubes de base Janus (JBNts), de la matriline-3 et du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) séquentiellement. Le JBNm a été fabriqué et caractérisé; De plus, il a montré une excellente bioactivité, encourageant les fonctions cellulaires telles que l’adhésion, la prolifération et la différenciation.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Divers échafaudages de biomatériaux ont été développés pour guider l’adhésion cellulaire et la prolifération dans l’espoir de promouvoir des fonctions spécifiques pour des utilisations in vitro et in vivo . L’ajout de facteurs de croissance dans ces échafaudages de biomatériaux est généralement effectué pour fournir un environnement de culture cellulaire optimal, médiant la différenciation cellulaire et ses fonctions ultérieures. Cependant, les facteurs de croissance d’un échafaudage de biomatériau conventionnel sont généralement conçus pour être libérés lors de l’implantation, ce qui pourrait entraîner des effets secondaires involontaires sur les tissus ou les cellules environnantes. Ici, la nano-matrice de base Janus (JBNm) inspirée de l’ADN a réussi à obtenir un microenvironnement hautement localisé avec une structure couche par couche pour des constructions de tissus cartilagineux autosuffisantes. Les JBNms sont auto-assemblés à partir de nanotubes de base Janus (JBNts), de matriline-3 et de facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) via la bioaffinité. Le JBNm a été assemblé à un rapport TGF-β1:matriline-3:JBNt de 1:4:10, car c’est le rapport déterminé auquel l’assemblage approprié dans la structure couche par couche pourrait se produire. Tout d’abord, la solution TGF-β1 a été ajoutée à la solution matriline-3. Ensuite, ce mélange a été pipeté plusieurs fois pour assurer une homogénéité suffisante avant l’ajout de la solution JBNt. Cela a formé le JBNm couche par couche, après avoir pipeté plusieurs fois à nouveau. Diverses expériences ont été réalisées pour caractériser la structure JBNm couche par couche, JBNts seuls, matriline-3 seul et TGF-β1 seul. La formation de JBNm a été étudiée avec des spectres d’absorption UV-Vis, et la structure du JBNm a été observée avec la microscopie électronique à transmission (TEM). Comme l’échafaudage innovant JBNm couche par couche est formé à l’échelle moléculaire, le colorant fluorescent marqué JBNm a pu être observé. Le TGF-β1 est confiné dans la couche interne du JBNm injectable, ce qui peut empêcher la libération de facteurs de croissance dans les zones environnantes, favoriser la chondrogenèse localisée et promouvoir un microenvironnement antihypertrophique.

Introduction

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Les échafaudages en ingénierie tissulaire jouent un rôle essentiel dans la fourniture d’un soutien structurel pour la fixation cellulaire et le développement ultérieurdes tissus 1. En règle générale, les constructions tissulaires conventionnelles sans aucun échafaudage reposent sur l’environnement de culture cellulaire et ont ajouté des facteurs de croissance pour arbitrer la différenciation cellulaire. De plus, cet ajout de molécules bioactives dans les échafaudages est souvent l’approche privilégiée pour guider la différenciation et la fonctioncellulaires 2,3. Certains échafaudages peuvent imiter le microenvironnement biochimique des tissus natifs indépendamment, tandis que d’autres peuvent influencer directement les fonctions cellulaires via des facteurs de croissance. Cependant, les chercheurs rencontrent souvent des difficultés dans la sélection d’échafaudages qui pourraient affecter positivement l’adhésion, la croissance et la différenciation cellulaires, tout en fournissant un soutien structurel optimal et une stabilité sur une longue période 4,5. Les molécules bioactives sont souvent faiblement liées à l’échafaudage, ce qui entraîne une libération rapide de ces protéines lors de l’implantation, ce qui entraîne leur libération dans des endroits indésirables. Cela aboutit à des effets secondaires sur des tissus ou des cellules qui n’ont pas été intentionnellement ciblés 6,7.

Les échafaudages sont généralement faits de matériaux polymères. La nano-matrice de base Janus (JBNm) est une plate-forme d’échafaudage biomimétique créée avec une nouvelle méthode couche par couche pour la construction autonome de tissus cartilagineux8. Ces nouveaux nanotubes inspirés de l’ADN ont été nommés nanotubes de base Janus (JBNts), car ils imitent correctement la structure et la chimie de surface du collagène trouvé dans la matrice extracellulaire (ECM). Avec l’ajout de molécules bioactives, telles que la matriline-3 et le facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1), le JBNm peut créer un microenvironnement optimal qui peut ensuite stimuler la fonctionnalité cellulaire et tissulaire souhaitée9.

Les JBNt sont de nouveaux nanotubes dérivés de versions synthétiques de la nucléobase adénine et thymine. Les JBNts sont formés par auto-assemblage10; Six nucléobases synthétiques se lient pour former un anneau, et ces anneaux subissent des interactions d’empilement π-π pour créer un nanotube de 200 à 300 μm de longueur11. Ces nanotubes sont structurellement similaires aux protéines de collagène; En imitant un aspect du microenvironnement cartilagineux natif, il a été démontré que les JBNt fournissent un site de fixation favorable pour les chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)11,12,13,14. Parce que les nanotubes subissent un auto-assemblage et ne nécessitent aucune sorte d’initiateur (comme la lumière UV), ils montrent un potentiel passionnant en tant qu’échafaudage injectable pour les zones de défauts difficiles à atteindre15.

La matriline-3 est une protéine structurelle de la matrice extracellulaire présente dans le cartilage. Cette protéine joue un rôle important dans la chondrogenèse et le bon fonctionnement du cartilage16,17. Récemment, il a été inclus dans des échafaudages de biomatériaux, encourageant la chondrogenèse sans hypertrophie 9,18,19. En incluant cette protéine dans le JBNm, les cellules cartilagineuses sont attirées par un échafaudage qui contient des composants similaires à ceux de son microenvironnement natif. De plus, il a été démontré que la matriline-3 est nécessaire pour une signalisation correcte du TGF-β1 dans les chondrocytes20. Les facteurs de croissance fonctionnent comme des molécules de signalisation, provoquant la croissance spécifique d’une certaine cellule ou tissu. Ainsi, pour obtenir une régénération optimale du cartilage, la matriline-3 et le TGF-β1 sont des composants essentiels du JBNm. L’ajout de TGF-β1 dans l’échafaudage couche par couche peut favoriser davantage la régénération du cartilage dans une construction tissulaire. Le TGF-β1 est un facteur de croissance utilisé pour favoriser le processus de guérison des défauts ostéochondrals, favorisant la prolifération et la différenciation des chondrocytes et des hMSC21,22. Ainsi, le TGF-β1 joue un rôle clé dans la régénération du cartilage JBNm (J/T/M JBNm)23, favorisant une bonne croissance surtout lorsqu’il est localisé dans les couches JBNm.

Comme mentionné précédemment, les facteurs de croissance sont généralement assemblés à l’extérieur des échafaudages sans méthodes spécifiques d’incorporation. Ici, avec la nano-architecture précisément conçue des biomatériaux, le JBNm a été développé pour un ciblage spécifique des cellules et des tissus prévus. Le JBNm est composé de TGF-β1 collé sur les surfaces JBNt dans la couche interne et de matriline-3 adhérée sur les surfaces JBNt dans la couche externe24,25. L’incorporation de TGF-β1 dans la couche interne de la structure couche par couche permet un microenvironnement très localisé le long des fibres JBNm, créant une construction tissulaire homéostatique avec une libération beaucoup plus lente de la protéine12. L’injectabilité du JBNm en fait une construction de tissu cartilagineux idéale pour diverses applications futures de biomatériaux26.

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Protocole

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1. Synthèse des JBNts

  1. Préparer le monomère JBNt en utilisant des méthodes précédemment publiées, impliquant la synthèse d’une variété de composés12.
  2. Purifier le monomère JBNt brut après sa synthèse par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide d’une colonne en phase inverse. Utilisez le solvant A : 100 % d’eau, le solvant B : 100 % d’acétonitrile et le solvant C : solution aqueuse HCl avec pH = 1. Utilisez un débit de 3 mL/min. Collecter le plus grand pic obtenu en CLHP à 7,2 min.

2. Fabrication pour JBNt/Matn1/TGF-β1 (Vidéo 1)

REMARQUE: La vidéo 1 montre que le JBNm est un solide injectable formé dans un environnement physiologique (solution d’eau, pas de lumière UV, pas d’additifs chimiques et pas de chauffage), qui est également d’inspiration biologique.

  1. Ajouter 8 μL de TGF-β1 à 1 mg/mL de TGF-β1 en suspension dans H2O à32μL de 1 mg/mL de matriline-3 en suspension dansH2O. Pipette pour assurer un bon mélange de ces protéines.
  2. Ajouter 80 μL de 1 mg/mL de JBNts en suspension dansH2Oà la solution TGF-β1/matriline-3. Pipeter à plusieurs reprises pour assurer un bon mélange. La présence de floccules blancs peut être observée immédiatement après l’ajout de JBNts, indiquant la formation du JBNm (Vidéo 1).

3. Observation d’échantillons à absorption ultraviolet-visible (UV-Vis)

NOTE: Les spectres d’absorption UV-Vis ont été étudiés pour caractériser l’assemblage du JBNm. Cette mesure a été analysée pour quatre catégories: JBNts seul, matriline-3 seul, TGF-β1 seul et JBNm couche par couche, composé des trois parties. Toutes les concentrations initiales sont en suspension dansH2O.

  1. Pour le groupe JBNt, ajouter 5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 50 μL deH2Opour obtenir une solution de 90,9 μg/mL.
  2. Pour le groupe matriline-3, ajouter 40 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 15 μL deH2Opour obtenir une solution de 7,3 μg/mL.
  3. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 10 μL de TGF-β1 à 45 μL deH2Opour obtenir une solution de 1,8 μg/mL.
  4. Pour le groupe JBNm, ajouter 40 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de 10 μg/mL de Tgf-β1. Agiter pour assurer un mélange approprié, puis ajouter 5 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution, en pipetant plusieurs fois pour mélanger l’échantillon.
  5. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer le spectre d’absorption de chaque groupe.

4. Mesure du potentiel zêta des échantillons

NOTE: Le potentiel zêta a été analysé pour mieux prédire comment le JBNm interagirait avec les tissus in vivo . Trois groupes ont été mesurés : la matriline-3 seule, la matriline-3 avec TGF-β1, et le JBNm couche par couche complète.

  1. Pour le groupe matriline-3, ajouter 160 μL de matriline-3 à 10 mg/mL de matriline-3 à 640 μL deH2Opour obtenir une solution de 800 μL.
  2. Pour le composé matriline-3/TGF-β1, ajouter 160 μL de 10 μg/mL de matriline-3 à 40 μL de 10 μg/mL de TGF-β1. Pipeter à plusieurs reprises pour assurer une homogénéité adéquate. Ensuite, ajoutez-le à 600 μL deH2O, ce qui donne une solution de 800 μL.
  3. Pour le groupe JBNm, ajouter 160 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de TGF-β1 à 40 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL. Pipette plusieurs fois pour mélanger les protéines. Ensuite, ajouter 20 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution et à la pipette pour assurer l’homogénéité. Enfin, ajoutez la solution JBNm à 580 μL deH2Opour obtenir une solution de 800 μL.
  4. Mesurez les valeurs de potentiel zêta pour les trois groupes.

5. Préparation de la nano-matrice JBNt/matrilin-3 pour la microscopie électronique à transmission (MET)

NOTE: La caractérisation TEM est effectuée pour caractériser la morphologie des JBNts et JBNm.

  1. Insérez deux grilles dans un nettoyeur plasma pour nettoyer correctement les grilles avant la coloration négative des JBNts et JBNm selon les protocoles publiés et les protocoles du fabricant12.
  2. Créer une solution de 200 μg/mL de JBNt en mélangeant 10 μL de JBNts à 1 mg/mL avec 40 μL d’eau distillée.
  3. Mélanger 30 μL de matriline-3 à 100 μg/mL avec 20 μL de TGF-β1 à 100 μg/mL et à la pipette plusieurs fois. Ajouter 10 μL de 1 mg/mL de JBNts au mélange matriline-3/TGF-β1 pour préparer l’échantillon de JBNm. Encore une fois, pipette à plusieurs reprises.
  4. Ajouter 3 μL de la solution JBNt (200 μg/mL) et 3 μL de la solution JBNm sur des grilles séparées, et laisser agir 2 min.
  5. Rincer chaque grille avec 100 μL de solution d’acétate d’uranyle (0,5%). Utilisez des papiers filtres pour éliminer l’excès de solution et permettre aux grilles de sécher à l’air.
  6. Utiliser un microscope électronique à transmission pour observer et caractériser correctement les échantillons, comme publié précédemment11,12.

6. Mesure des spectres d’absorption des protéines marquées par fluorescence

NOTE: La structure de JBNm est vérifiée en observant les structures du JBNm avec une analyse spectrale d’absorption.

  1. Étiquetez le TGF-β1 à l’aide d’un kit de marquage des protéines en suivant les instructions du fabricant. Ajouter 20 μL de TGF-β1 marqué à 25 μL deH2Opour obtenir une solution d’essai de 8,9 μg/mL.
  2. Étiquetez la matriline-3 à l’aide d’un kit d’étiquetage séparé. Ajouter 20 μL de matriline-3 marquée à 80 μg/mL deH2Opour obtenir une solution d’essai de 36 μg/mL.
    REMARQUE : Le marquage par colorant fluorescent du TGF-β1 a donné une concentration finale de 20 μg/mL, tandis que le marquage de la matriline-3 a donné une concentration finale de 80 μg/mL.
  3. Mélanger 20 μL de 80 μg/mL de matriline-3 marquée avec 20 μL de TGF-β1 marqué à 20 μg/mL et 5 μL deH2O, ce qui donne un composé TGF-β1/matriline-3 marqué. Pipeter le mélange plusieurs fois pour mélanger.
  4. Ajouter 5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 40 μL deH2O, ce qui donne une solution de 111 μg/mL.
  5. Ajouter 20 μL de TGF-β1 marqué à 20 μL de matriline-3 marqué 80 μg/mL et pipette plusieurs fois. Ajouter 5 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution marquée de TGF-β1/matriline-3 et pipeter à plusieurs reprises pour bien mélanger le composé.
    REMARQUE : Les concentrations finales des échantillons de JBNt, de TGF-β1 marqué et de matriline-3 marquée étaient de 111 μg/mL, 8,9 μg/mL et 36 μg/mL, respectivement.
  6. Transférer chaque groupe d’échantillons (c.-à-d. TGF-β1 marqué (étape 6.1), matriline-3 marqué (étape 6.2), marqué TGF-β1/matrilin-3 (étape 6.3), JBNts (étape 6.4), JBNm (étape 6.5)) dans leur propre puits d’une plaque noire de 384 puits.
  7. Chargez la plaque noire à 384 puits dans un lecteur de microplaques multimode et prenez des mesures aux longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 555 nm en suivant le protocole du fabricant.

7. Essai de la fonction biologique in vitro

  1. Test d’adhérence cellulaire sur chambres de verre de couverture pré-revêtues
    1. Préparez deux verres de couverture chambrés avec cinq groupes d’échantillons, car un verre de couverture est utilisé pour chaque type de cellule.
    2. Ajouter 1,25 μL de 1 mg/mL de JBNts à 198,75 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 6,25 μg/mL.
    3. Ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 190 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 0,5 μg/mL.
    4. Ajouter 2,5 μL de TGF-β1 à 197,5 μg/mL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 0,125 μg/mL.
    5. Pour le groupe JBNm, ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 2,5 μL de 10 μg/mLTGF-β1 et pipeter à plusieurs reprises. Ajouter 1,25 μL de JBNts à une concentration de 1 mg/mL à la solution de mélange et à la pipette. Enfin, ajoutez 186,25 μL d’eau distillée pour obtenir une solution de 200 μL de JBNm.
      1. Pour le groupe témoin, utiliser 200 μL d’eau distillée.
    6. Ajouter chaque groupe d’échantillons dans son propre puits d’un verre à couvercle chambré no 1.5. Placez le verre de couverture dans un congélateur à -80 °C pendant 1 h, puis lyophilisez-le avec un instrument lyophiliseur.
    7. Ensemencer des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) et des cellules chondrocytaires humaines (10 000 cellules par puits) dans chaque puits des verres de couverture chambrés préparés.
    8. Incuber les deux verres de couverture pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C. Ensuite, aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez deux fois avec du PBS.
    9. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 5 min, puis prélever et rincer les échantillons avec du PBS. Rincer l’échantillon une deuxième fois pour éliminer complètement le paraformaldéhyde à 4%.
    10. Incuber les cellules avec 100 μL de Triton-X à 0,1% pendant 10 min et laver avec du PBS. Ajouter 100 μL de rhodamine-phalloïdine 0,165 μM à chaque puits. Attendez 30 minutes, puis lavez à nouveau avec PBS.
    11. Ajouter 0,1 μg/mL de DAPI à chaque puits pour colorer les noyaux. Attendez 5 minutes et rincez les puits avec du PBS deux fois.
    12. Utilisez un microscope confocal spectral pour observer la morphologie cellulaire et capturer des images fluorescentes.
    13. De plus, analysez le nombre de cellules et la morphologie à l’aide d’un logiciel de traitement d’images. Ouvrez le logiciel et chargez les images. Ajoutez une barre d’échelle et calibrez le logiciel. Comptez le nombre de cellules dans une zone donnée pour chaque échantillon. Ensuite, utilisez l’outil de mesure pour collecter des données sur la morphologie cellulaire de chaque échantillon.
  2. Prolifération cellulaire
    1. Préparer trois plaques non traitées de 96 puits, en ajoutant cinq groupes d’échantillons à chacune.
      1. Pour le groupe JBNt, ajouter 3,75 μL de 1 mg/mL de JBNts à 596,25 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 600 μL de JBNt à une concentration de 6,25 μg/mL.
      2. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 7,5 μL de TGF-β1 à 592,5 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution d’essai de 0,125 μg/mL.
      3. Pour le groupe matriline-3, ajouter 30 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 570 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution d’essai de 0,5 μg/mL.
      4. Pour le groupe JBNm, mélanger 7,5 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL avec 30 μL de matriline-3 à 10 μg/mL et une pipette plusieurs fois, puis ajouter 3,75 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution.
      5. Diluer la solution de JBNm avec 558,75 μL d’eau distillée pour obtenir les concentrations finales de 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL et 0,5 μg/mL, respectivement, pour les échantillons de JBNt, TGF-β1 et matrilin-3.
      6. Pour le groupe témoin, utiliser 600 μL d’eau distillée.
    2. Diviser chaque groupe d’échantillons en six puits (échantillon de 100 μL par puits).
    3. Placer les trois plaques contenant tous les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant 1 h, puis lyophiliser avec un instrument lyophilisant.
    4. Ensemencer les CSMh sur ces plaques, chacune recevant une suspension cellulaire de 100 μL (par puits) contenant 5 000 cellules. Incuber les trois plaques à 37 °C pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours à 5% CO2.
    5. Ajouter 10 μL de solution CCK-8 à chaque puits avec les cellules et incuber à 37 °C pendant 2 h supplémentaires.
    6. Mesurez les valeurs d’absorption de chaque puits avec des lecteurs de microplaques multimodes à 450 nm.
    7. Ensemencer un gradient connu de CSMh sur une plaque de 96 puits et incuber pendant 4 h. Utilisez le test CCK-8 pour mesurer les valeurs d’absorption du nombre connu de cellules et générer une courbe standard.
    8. Calculer la prolifération cellulaire à l’aide de la courbe standard d’absorption.
  3. Essai de stabilité
    REMARQUE : Une trousse ELISA humaine ciblant le TGF-β1 a été utilisée pour déterminer le pourcentage de libération de TGF-β1 du JBNm dans un hydrogel d’agarose.
    1. Préparer l’agarose à 2 % en ajoutant 400 mg de poudre d’agarose à 20 mL de PBS et en la chauffant jusqu’à 100 °C pour dissoudre complètement la poudre d’agarose.
    2. Préparez le JBNm à l’intérieur de l’hydrogel d’agarose à 2% refroidi.
      1. Combiner 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1, 40 μL de 10 μg/mL de matriline-3, 5 μL de 1 mg/mL de JBNts et 195 μL de PBS. Mélanger cette solution avec 250 μL d’agarose à 2%, créant l’hydrogel JBNm.
    3. Ajoutez 500 μL de PBS, en l’utilisant comme solution de libération, et assurez-vous de le changer tous les 3 jours. Conservez chaque solution libérée et laissez reposer l’échantillon pendant 15 jours.
    4. Utilisez un kit ELISA pour tester chacune des solutions de libération capturées, en suivant les instructions du fabricant.
      NOTA: En soustrayant la quantité de TGF-β1 rejetée dans le PBS de la valeur de charge théorique de 100%, la quantité restante de TGF-β1 peut être déterminée.
  4. Analyse de différenciation cellulaire avec PCR26.
    1. Préparer sept groupes d’échantillons avec chaque échantillon contenant 20 μL de suspension cellulaire (4 x 104 cellules), 30 μL de la solution spécifique (ou PBS, selon le groupe d’échantillon) et 50 μL de 2 % en poids d’agarose.
      1. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 5 μL de TGF-β1 à 25 μL de PBS, ce qui donne une solution de 1,6 μg/mL.
      2. Pour le groupe matriline-3, ajouter 20 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de PBS, ce qui donne une solution de 6,7 μg/mL.
      3. Pour le groupe JBNt, ajouter 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 27,5 μL de PBS, ce qui donne une solution de 83,3 μg/mL.
      4. Pour le groupe J/T/M JBNm, ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de TGF-β1 à 5 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL et pipeter de haut en bas pour mélanger la solution. Ensuite, ajoutez 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts et pipette à nouveau. Enfin, diluer avec 2,5 μL de PBS.
      5. Pour chaque groupe témoin, utiliser 30 μL de PBS comme échantillon.
    2. Ajouter 0,5 mL de milieu de culture cellulaire à chaque puits, en veillant à le remplacer tous les 3 jours.
      1. Pour le groupe témoin positif, utiliser un milieu chondrogène hMSC disponible dans le commerce contenant du TGF-β1 ajouté. Ce TGF-β1 supplémentaire est égal à la quantité dans les groupes TGF-β1 et J/T/M JBNm.
      2. Pour l’un des groupes témoins négatifs, utiliser un milieu chondrogène hMSC commercial qui ne contient pas de TGF-β1. Pour l’autre groupe témoin négatif, utiliser un milieu de culture cellulaire DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
      3. Pour tous les autres groupes, utiliser un milieu de culture cellulaire chondrogène hMSC commercial sans TGF-β1.
    3. Culture des échantillons pendant 15 jours.
    4. Extraire l’ARN des échantillons et effectuer une PCR pour étudier la différenciation des échantillons comme décrit précédemment26.
  5. Immunomarquage pour le dosage d’expression du collagène de type X
    1. Préparer sept échantillons à base d’agarose de la même manière que la différenciation cellulaire avec la section de la méthode PCR (étape 7.4).
    2. Culture des échantillons pendant 15 jours.
    3. Fixez les échantillons avec 4% de formaldéhyde pendant 1 jour, faites tremper dans une solution de saccharose à 30% pendant une nuit, puis congelez toute la nuit à -80 °C avec de l’azote liquide. Fixez les échantillons à l’aide du réactif composé (OCT) à température de coupe optimale, un mélange de glycols et de résines solubles dans l’eau, à -10 °C.
    4. Utiliser un microtome cryostat pour obtenir des sections congelées de 20 μm d’épaisseur de chaque échantillon.
    5. Colorer chaque section avec un anticorps anti-collagène X avec une dilution de 1:800 et un anticorps secondaire de marquage fluorescent dilué avec du PBS, selon les protocoles du fabricant.
    6. Observez chaque section avec un microscope confocal, en utilisant une excitation de 488 nm et un grossissement de 40x sur l’oculaire.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conformément au protocole, les JBNt ont été synthétisés avec succès et caractérisés par absorption UV-Vis et MET. Le JBNm est un échafaudage solide injectable qui subit un processus biomimétique rapide. Après l’ajout de JBNts à un mélange de solution de TGF-β1/matriline-3 dans un environnement physiologique, un échafaudage solide à mailles blanches a été formé indiquant l’assemblage réussi de JBNm, comme le montre la figure 1. Cela a été démontré dans les méthodes de caractérisation.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de cette étude est de développer une plateforme d’échafaudage biomimétique, le JBNm, pour surmonter les limites des constructions tissulaires conventionnelles qui reposent sur des environnements de culture cellulaire pour arbitrer la différenciation cellulaire. Le JBNm est un échafaudage de structure couche par couche pour une construction de tissu cartilagineux autonome. La conception innovante est basée sur de nouveaux nanomatériaux inspirés de l’ADN, les JBNts. Le JBNm, composé de JBNts30<...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le Dr Yupeng Chen est cofondateur d’Eascra Biotech, Inc. et de NanoDe Therapeutics, Inc.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu par les subventions NIH 7R01AR072027 et 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 et l’Université du Connecticut. Ce travail est également soutenu en partie par la subvention S10OD016435 des NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 % de sérum de chèvre normalThermo Fisher50062ZAgent utilisé pour bloquer les actions de liaison des anticorps non spécifiques pendant la coloration.
Plaque à 24 puitsCorning07-200-740Plaque à 24 puits utilisée pour la culture cellulaire comparative.
Plaque noire non traitée 384 puitsThermo Fisher262260Plaque 384 puits utilisée pour les mesures d’absorption.
Verre de protection à 8 puitsThermo Fisher155409PKVerre de protection à 8 puits utilisé pour la culture cellulaire comparative.
Plaque à fond plat à 96 puitsCorning07-200-91Plaque à 96 puits utilisée pour la culture cellulaire comparative.
Plaque à 96 puits non traitéeThermo Fisher260895plaque à 96 puits utilisée pour la culture cellulaire comparative et l’analyse.
Gel d’agaroseSigma-AldrichA9539Hydrogel utilisé pour la culture cellulaire.
Gel d’agaroseSigma AldrichA9539Hydrogel utilisé comme environnement pour la culture cellulaire.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) et A30007 (555)Colorant fluorescent utilisé pour marquer les protéines.
Anticorps anti-collagène XThermo Fisher41-9771-82Anticorps utilisé pour colorer le collagène-X.
Machine de PCR Bio-RadBio-Radutilisé pour effectuer la PCR sur des échantillons.
cellulaire chondrocytaire C28/I2Cellules utilisées pour analyser les capacités prolifératives de divers échantillons.
Kit de comptage cellulaire 8Milipore Sigma96992Essai de prolifération cellulaire.
Cell ProfilerBroad InstituteLogiciel utilisé pour analyser les images cellulaires.
Cryostat MicrotomeÉquipement utilisé pour produire de minces segments d’échantillons destinés à la coloration et à la microscopie.
DAPIInvitrogenD1306Colorant fluorescent bleu qui se lie aux régions de l’ADN adénine-thymine.
Cuvettes jetablesFISHER Scientific14-955-128Récipient utilisé pour la spectrophotométrie.
Milieu de culture cellulaire DMEM ThermoFisher10566032Milieu utilisé pour soutenir la croissance cellulaire.
Sérum fœtal bovinGIBCOA4766801sérum utilisé dans les milieux de culture cellulaire pour soutenir la croissance cellulaire.
Fluoromount-G Medium de montageThermo Fisher00-4958-02Solution utilisée pour le montage de lames pour l’immunomarquage.
Composé de formaldéhydeutilisé pour fixer les échantillons avant le microtoming.
hautement adsorbé de chèvre (H+L) Anticorps secondaire ThermoFisherA16110utilisé pour la coloration des protéines.
Cellules souches mésenchymateuses humainesLONZAPT-2501Cellules utilisées pour analyser les capacités différentielles de divers échantillons.
Milieu chondrogénique souche mésenchymateuse humaineLONZAPT-3003Milieu cellulaire utilisé pour favoriser la différenciation chondrogénique.
ImageJLogiciel d’analyse d’images des National Institutes of Healthutilisé conjointement avec la microscopie.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit utilisé pour la PCR.
Nanotubes à base de Janus (JBNts)Nanotube fabriqué à partir de nucléobases synthétiques pour servir d’outil d’échafaudage cellulaire.
LaB6 20-120 kV Microscope électronique à transmissionTecnaiÉquipement utilisé pour effectuer la microscopie électronique à transmission sur un échantillon.
MATLABMathWorksLogiciel statistique utilisé pour la modélisation et l’analyse de données.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Protéine structurelle utilisée comme sites d’adhésion pour les chondrocytes.
SpectrophotomètreNanoDrop Thermo FisherÉquipement utilisé pour mesurer les valeurs d’absorption d’un échantillon.
Microscope confocal spectral Nikon A1RNikonA1R HD25utilisé pour l’analyse d’échantillons.
Numéro 1.5 Coverglass à chambreThermo Fisher152250Environnement pour la culture cellulaire stérile et l’imagerie.
Composépour intégrer les cellules avant le microtoming.
ParaformaldéhydeThermo ScientificAAJ19943K2Composé utilisé pour fixer les cellules.
Nettoyeur plasma PDC-32G NettoyeurHarrick utilisépour préparer les grilles avant la microscopie électronique à transmission.
pénicilline-streptomycineGIBCO15-140-148Agent antibiotique utilisé pour décourager la croissance bactérienne pendant la culture cellulaire.
Solution saline tamponnée au phosphateThermo Fisher10010023solution utilisée pour laver le milieu cellulaire et agir comme tampon pendant l’expérimentation.
Rhodamine-phalloïdineInvitrogenR415F-Actin rouge fluorescent.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Kit utilisé pour filtrer et homogénéiser les échantillons lors de l’extraction de l’ARN.
Saccharose SolutionSolution utilisée pour traiter les échantillons avant le microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA KitInvitrogenBMS249-4Kit de dosage utilisé pour déterminer la présence de TGF-&beta ; 1 dans un échantillon.
TGF-&bêta ; 1PEPROTECH100-21CFacteur de croissance utilisé pour la stimulation de la différenciation et de la prolifération chondrogéniques.
Triton-XInvitrogenHFH10Composé utilisé pour lyser les cellules non fixées pendant le processus de coloration.
Réactif TRIzolThermo Fisher15596026réactif utilisé pour isoler l’ARN.
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalÉquipement utilisé pour mesurer les valeurs de potentiel zêta d’un échantillon.
Équipement Lignée Anticorps secondaire Thermo Fisher A16110 HD25 Microscope confocal réactif utilisé plasma

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106(2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317(2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590(2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50(2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823(2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676(2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670(2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147(2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155(2021).

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