Fabrication et caractérisation de nano-matrice Janus Base couche par couche pour favoriser la régénération du cartilage

Résumé

Ce protocole décrit l’assemblage d’un échafaudage de nanomatrice de base Janus (JBNm) couche par couche en ajoutant des nanotubes de base Janus (JBNts), de la matriline-3 et du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) séquentiellement. Le JBNm a été fabriqué et caractérisé; De plus, il a montré une excellente bioactivité, encourageant les fonctions cellulaires telles que l’adhésion, la prolifération et la différenciation.

Résumé

Divers échafaudages de biomatériaux ont été développés pour guider l’adhésion cellulaire et la prolifération dans l’espoir de promouvoir des fonctions spécifiques pour des utilisations in vitro et in vivo . L’ajout de facteurs de croissance dans ces échafaudages de biomatériaux est généralement effectué pour fournir un environnement de culture cellulaire optimal, médiant la différenciation cellulaire et ses fonctions ultérieures. Cependant, les facteurs de croissance d’un échafaudage de biomatériau conventionnel sont généralement conçus pour être libérés lors de l’implantation, ce qui pourrait entraîner des effets secondaires involontaires sur les tissus ou les cellules environnantes. Ici, la nano-matrice de base Janus (JBNm) inspirée de l’ADN a réussi à obtenir un microenvironnement hautement localisé avec une structure couche par couche pour des constructions de tissus cartilagineux autosuffisantes. Les JBNms sont auto-assemblés à partir de nanotubes de base Janus (JBNts), de matriline-3 et de facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) via la bioaffinité. Le JBNm a été assemblé à un rapport TGF-β1:matriline-3:JBNt de 1:4:10, car c’est le rapport déterminé auquel l’assemblage approprié dans la structure couche par couche pourrait se produire. Tout d’abord, la solution TGF-β1 a été ajoutée à la solution matriline-3. Ensuite, ce mélange a été pipeté plusieurs fois pour assurer une homogénéité suffisante avant l’ajout de la solution JBNt. Cela a formé le JBNm couche par couche, après avoir pipeté plusieurs fois à nouveau. Diverses expériences ont été réalisées pour caractériser la structure JBNm couche par couche, JBNts seuls, matriline-3 seul et TGF-β1 seul. La formation de JBNm a été étudiée avec des spectres d’absorption UV-Vis, et la structure du JBNm a été observée avec la microscopie électronique à transmission (TEM). Comme l’échafaudage innovant JBNm couche par couche est formé à l’échelle moléculaire, le colorant fluorescent marqué JBNm a pu être observé. Le TGF-β1 est confiné dans la couche interne du JBNm injectable, ce qui peut empêcher la libération de facteurs de croissance dans les zones environnantes, favoriser la chondrogenèse localisée et promouvoir un microenvironnement antihypertrophique.

Introduction

Les échafaudages en ingénierie tissulaire jouent un rôle essentiel dans la fourniture d’un soutien structurel pour la fixation cellulaire et le développement ultérieur^{des tissus 1}. En règle générale, les constructions tissulaires conventionnelles sans aucun échafaudage reposent sur l’environnement de culture cellulaire et ont ajouté des facteurs de croissance pour arbitrer la différenciation cellulaire. De plus, cet ajout de molécules bioactives dans les échafaudages est souvent l’approche privilégiée pour guider la différenciation et la fonction^{cellulaires 2,3}. Certains échafaudages pe....

Protocole

1. Synthèse des JBNts

1. Préparer le monomère JBNt en utilisant des méthodes précédemment publiées, impliquant la synthèse d’une variété de composés¹².
2. Purifier le monomère JBNt brut après sa synthèse par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide d’une colonne en phase inverse. Utilisez le solvant A : 100 % d’eau, le solvant B : 100 % d’acétonitrile et le solvant C : solution aqueuse HCl avec pH = 1. Utilisez un débit de 3 mL/min. Collecter le plus grand pic obtenu en CLHP à 7,2 min.

2. Fabrication pour JBNt/Matn1/TGF-β1 (Vidéo 1)

Résultats

Conformément au protocole, les JBNt ont été synthétisés avec succès et caractérisés par absorption UV-Vis et MET. Le JBNm est un échafaudage solide injectable qui subit un processus biomimétique rapide. Après l’ajout de JBNts à un mélange de solution de TGF-β1/matriline-3 dans un environnement physiologique, un échafaudage solide à mailles blanches a été formé indiquant l’assemblage réussi de JBNm, comme le montre la figure 1. Cela a été démontré dans les méthodes de caractérisation.

Discussion

L’objectif de cette étude est de développer une plateforme d’échafaudage biomimétique, le JBNm, pour surmonter les limites des constructions tissulaires conventionnelles qui reposent sur des environnements de culture cellulaire pour arbitrer la différenciation cellulaire. Le JBNm est un échafaudage de structure couche par couche pour une construction de tissu cartilagineux autonome. La conception innovante est basée sur de nouveaux nanomatériaux inspirés de l’ADN, les JBNts. Le JBNm, composé de JBNts^30<.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % de sérum de chèvre normal	Thermo Fisher	50062Z	Agent utilisé pour bloquer les actions de liaison des anticorps non spécifiques pendant la coloration.
Plaque à 24 puits	Corning	07-200-740	Plaque à 24 puits utilisée pour la culture cellulaire comparative.
Plaque noire non traitée 384 puits	Thermo Fisher	262260	Plaque 384 puits utilisée pour les mesures d’absorption.
Verre de protection à 8 puits	Thermo Fisher	155409PK	Verre de protection à 8 puits utilisé pour la culture cellulaire comparative.
Plaque à fond plat à 96 puits	Corning	07-200-91	Plaque à 96 puits utilisée pour la culture cellulaire comparative.
Plaque à 96 puits non traitée	Thermo Fisher	260895	plaque à 96 puits utilisée pour la culture cellulaire comparative et l’analyse.
Gel d’agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel utilisé pour la culture cellulaire.
Gel d’agarose	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel utilisé comme environnement pour la culture cellulaire.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) et A30007 (555)	Colorant fluorescent utilisé pour marquer les protéines.
Anticorps anti-collagène X	Thermo Fisher	41-9771-82	Anticorps utilisé pour colorer le collagène-X.
Machine de PCR Bio-Rad	Bio-Rad		utilisé pour effectuer la PCR sur des échantillons.
		cellulaire chondrocytaire C28/I2	Cellules utilisées pour analyser les capacités prolifératives de divers échantillons.
Kit de comptage cellulaire 8	Milipore Sigma	96992	Essai de prolifération cellulaire.
Cell Profiler	Broad Institute		Logiciel utilisé pour analyser les images cellulaires.
Cryostat Microtome			Équipement utilisé pour produire de minces segments d’échantillons destinés à la coloration et à la microscopie.
DAPI	Invitrogen	D1306	Colorant fluorescent bleu qui se lie aux régions de l’ADN adénine-thymine.
Cuvettes jetables	FISHER Scientific	14-955-128	Récipient utilisé pour la spectrophotométrie.
Milieu de culture cellulaire DMEM Thermo	Fisher	10566032	Milieu utilisé pour soutenir la croissance cellulaire.
Sérum fœtal bovin	GIBCO	A4766801	sérum utilisé dans les milieux de culture cellulaire pour soutenir la croissance cellulaire.
Fluoromount-G Medium de montage	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution utilisée pour le montage de lames pour l’immunomarquage.
Composé de formaldéhyde			utilisé pour fixer les échantillons avant le microtoming.
hautement adsorbé de chèvre (H+L) Anticorps secondaire Thermo	Fisher	A16110	utilisé pour la coloration des protéines.
Cellules souches mésenchymateuses humaines	LONZA	PT-2501	Cellules utilisées pour analyser les capacités différentielles de divers échantillons.
Milieu chondrogénique souche mésenchymateuse humaine	LONZA	PT-3003	Milieu cellulaire utilisé pour favoriser la différenciation chondrogénique.
ImageJ	Logiciel d’analyse d’images des National Institutes of Health		utilisé conjointement avec la microscopie.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit utilisé pour la PCR.
Nanotubes à base de Janus (JBNts)			Nanotube fabriqué à partir de nucléobases synthétiques pour servir d’outil d’échafaudage cellulaire.
LaB6 20-120 kV Microscope électronique à transmission	Tecnai		Équipement utilisé pour effectuer la microscopie électronique à transmission sur un échantillon.
MATLAB	MathWorks		Logiciel statistique utilisé pour la modélisation et l’analyse de données.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Protéine structurelle utilisée comme sites d’adhésion pour les chondrocytes.
Spectrophotomètre	NanoDrop Thermo Fisher		Équipement utilisé pour mesurer les valeurs d’absorption d’un échantillon.
Microscope confocal spectral Nikon A1R	Nikon	A1R HD25	utilisé pour l’analyse d’échantillons.
Numéro 1.5 Coverglass à chambre	Thermo Fisher	152250	Environnement pour la culture cellulaire stérile et l’imagerie.
Composé			pour intégrer les cellules avant le microtoming.
Paraformaldéhyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Composé utilisé pour fixer les cellules.
Nettoyeur plasma PDC-32G Nettoyeur	Harrick utilisé		pour préparer les grilles avant la microscopie électronique à transmission.
pénicilline-streptomycine	GIBCO	15-140-148	Agent antibiotique utilisé pour décourager la croissance bactérienne pendant la culture cellulaire.
Solution saline tamponnée au phosphate	Thermo Fisher	10010023	solution utilisée pour laver le milieu cellulaire et agir comme tampon pendant l’expérimentation.
Rhodamine-phalloïdine	Invitrogen	R415	F-Actin rouge fluorescent.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit utilisé pour filtrer et homogénéiser les échantillons lors de l’extraction de l’ARN.
Saccharose Solution			Solution utilisée pour traiter les échantillons avant le microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Kit de dosage utilisé pour déterminer la présence de TGF-&beta ; 1 dans un échantillon.
TGF-&bêta ; 1	PEPROTECH	100-21C	Facteur de croissance utilisé pour la stimulation de la différenciation et de la prolifération chondrogéniques.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Composé utilisé pour lyser les cellules non fixées pendant le processus de coloration.
Réactif TRIzol	Thermo Fisher	15596026	réactif utilisé pour isoler l’ARN.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Équipement utilisé pour mesurer les valeurs de potentiel zêta d’un échantillon.

Équipement Lignée Anticorps secondaire Thermo Fisher A16110 HD25 Microscope confocal réactif utilisé plasma