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Article de méthode

Faciliter la culture organoïde cérébrale grâce à l’éclairage latéral à lumière douce

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DOI :

10.3791/63989

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6 juin 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

Dans cet article

Résumé

Les organoïdes cérébraux offrent des possibilités sans précédent d’étudier le développement des organes et la pathologie des maladies humaines. Bien qu’un grand succès ait été obtenu avec les systèmes de culture organoïdes cérébrales, il existe encore des difficultés opérationnelles dans l’application de cette technologie. Le présent protocole décrit une procédure organoïde cérébrale qui facilite le changement de milieu et le transfert organoïde.

Résumé

À l’heure actuelle, la technologie de culture organoïde cérébrale est encore compliquée à utiliser et difficile à appliquer à grande échelle. Il est nécessaire de trouver une solution simple et pratique. Par conséquent, un protocole organoïde cérébral plus réalisable est proposé dans la présente étude. Pour résoudre les inconvénients inévitables du changement moyen et du transfert organoïde à un stade précoce, la recherche actuelle optimise la technologie d’exploitation en appliquant le principe d’ingénierie. Une lampe à lumière douce a été adoptée pour éclairer latéralement les échantillons de corps embryoïde (EB), permettant aux EB d’être vus à l’œil nu grâce à l’effet de réflexion diffuse amélioré. En utilisant le principe de l’écoulement secondaire généré par la rotation, les organoïdes se rassemblent vers le centre du puits, ce qui facilite le fonctionnement du changement de milieu ou du transfert organoïde. Par rapport à la cellule dispersée, le corps embryoïde s’installe plus rapidement dans la pipette. En utilisant ce phénomène, la plupart des cellules libres et des fragments de cellules mortes peuvent être éliminés efficacement de manière simple, empêchant les EB d’être endommagés par la centrifugation. Cette étude facilite le fonctionnement de la culture organoïde cérébrale et aide à promouvoir l’application d’organoïdes cérébraux.

Introduction

Par rapport aux systèmes de culture bidimensionnelle (2D), les systèmes de culture tridimensionnelle (3D) présentent plusieurs avantages, notamment une véritable réplication et une reproduction efficace des structures complexes de certains organes1. Par conséquent, les organoïdes cérébraux sont l’une des méthodes auxiliaires importantes pour les domaines de recherche du développement du cerveau humain et de la maladie2, du dépistage des médicaments et de la thérapie cellulaire.

La culture d’organoïdes cérébraux par la méthode de suspension rotative est propice à leur développement et à leur maturation3. Bien que les systèmes de culture organoïdes cérébrales aient connu un grand succès, ils sont toujours confrontés à des défis critiques qui limitent leur application. Par exemple, la culture manuelle implique des étapes de manipulation compliquées et introduit des obstacles à la réalisation d’applications à grande échelle. De plus, à chaque stade de développement de la culture d’organoïdes cérébraux, des changements dans différents milieux et cytokines sont nécessaires4. Cependant, au stade précoce, les organoïdes ou EB ont des tailles minuscules (environ 200 μm à 300 μm) et sont presque visuellement inaccessibles sans appareil approprié. Inévitablement, une certaine quantité d’échantillons organoïdes précieux est évacuée lorsque le milieu est changé. De nombreuses techniques ont été explorées pour surmonter cela dans d’autres types de cultures organoïdes, et certains exemples incluent l’immersion de puces organoïdes entières dans un milieu de culture pendant 3 jours sans intervention5; ajouter un milieu frais à travers la couche de couverture après l’absorption de l’ancien milieu à l’aide de papier absorbant5; ou l’application de pipelines microfluidiques complexes pour l’échange de fluides 6,7,8. Un autre obstacle rencontré au début de la culture organoïde est la difficulté d’obtenir des observations directes à l’œil nu, ce qui peut provoquer de mauvaises opérations entraînant des dommages et des pertes organoïdes pendant les étapes de transfert organoïdes. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un protocole plus réalisable qui facilite le changement de milieu et le transfert d’organoïdes pour générer des organoïdes.

Un fonctionnement optimisé correspondant basé sur des principes d’ingénierie est proposé pour surmonter ces problèmes, ce qui facilite considérablement et commodément de nombreuses procédures organoïdes. Dans la nature, lorsque le soleil brille dans une maison à travers un espace de fenêtre, l’œil nu peut voir la poussière danser dans le faisceau lumineux. En raison de la réflexion diffuse de la lumière du soleil sur la poussière, une partie de la lumière est réfractée dans le globe oculaire pour produire une image visuelle. Inspirée par le principe de ce phénomène 9,10, cette étude a réalisé une lampe à lumière douce et a éclairé les EB latéralement. Il a été constaté que les EB pouvaient être visuellement clairs sans affecter la portée de visualisation. Un écoulement secondaire pointant vers le centre est généré dans le liquide en faisant tourner la plaque de culture en raison des courants de Foucault11. Les EB dispersés à l’origine s’accumulent au centre de la plaque. Sur cette base, et le phénomène selon lequel la vitesse de sédimentation des organoïdes est plus rapide que celle des cellules, une méthode d’utilisation facile de changement de milieu et de transfert d’organoïdes sans centrifugation est proposée. Les organoïdes dans le milieu de culture peuvent être efficacement séparés des cellules libres et des fragments de cellules mortes grâce à cette opération de transfert.

Ici, un protocole facile à utiliser est proposé pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes humaines. La technologie d’exploitation a été optimisée en appliquant le principe d’ingénierie, rendant les opérations en culture 3D aussi simples et réalisables que celles en culture 2D. La méthode d’échange de liquide améliorée et l’opération de transfert organoïde sont également utiles pour d’autres types de culture organoïde et la conception de machines de culture automatiques.

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Protocole

Le protocole a été élaboré à la suite de la Déclaration d’Helsinki. L’approbation a été accordée par le Comité d’éthique du troisième hôpital affilié de l’Université médicale de Guangzhou (examen médical et éthique [2021] n ° 022). Avant l’expérience, chaque milieu était préparé selon la formule12 de Juergen A. Knoblich (tableaux supplémentaires 1 à 4), ou un kit d’organoïdes cérébraux disponible dans le commerce était utilisé (voir tableau des matériaux). Les CSPi utilisées dans cette étude ont déjà été établies par notre laboratoire et ont obtenu une exemption éclairée. Les SCA3-iPSC ont été générés à partir d’un patient femelle atteint d’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) âgé de 31 ans génotypé comme hébergeant 26/78 répétitions CAG dans le gène ATXN313 (Figure supplémentaire 1A). Les CSPi humaines normales mentionnées dans un article précédent ont été sélectionnées comme NC-iPSC14, et le gène ATXN3 a été identifié comme ayant des répétitions CAG 14/14 (figure supplémentaire 1B).

1. Préparation de cellules souches pluripotentes induites (CSPi)

  1. Prélever 3 mL de sang périphérique par ponction veineuse avec le consentement éclairé des volontaires et des patients.
  2. Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique selon la méthode Ficoll-Paque15.
  3. Établissez des IPSC selon le protocole du kit de reprogrammation de Sendai (voir tableau des matériaux).
    1. Cultiver les cspi avec un milieu mTeSR1 dans des boîtes de Petri de 35 mm recouvertes de Matrigel (une matrice de membrane basale, voir Tableau des matériaux). Changez le médium tous les jours. La densité de croissance iPSC ne doit pas dépasser 75%.
    2. Digérez les cellules avec une solution de dissociation PSC (voir Tableau des matériaux) et sous-cultivez-les dans un rapport de 1:5 tous les 3-5 jours.
      ATTENTION: Le virus Sendai est utilisé ici. Il doit être utilisé dans l’armoire de biosécurité et des mesures d’autoprotection doivent être prises. Il devrait être clair s’il peut être utilisé légalement dans le pays local. Les lois et règlements locaux en matière de biosécurité doivent être strictement respectés lorsqu’ils sont utilisés.

2. Préparation EB (jours 0-1)

  1. Retirez le support mTeSR1 des iPSC avec une pipette et lavez-le 2x avec 1 mL de 1x PBS.
  2. Retirez le PBS à l’aide d’une pipette et ajoutez 300 μL de solution de détachement de cellule (voir Tableau des matériaux) pour digérer les CSPi en cellules individuelles pendant 3 à 4 minutes à 37 °C.
  3. Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu de formation EB (tableau supplémentaire 1), puis centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 300 x g (température ambiante).
  4. Prétraitez la plaque spécialisée de 24 puits avec une solution de rinçage antiadhésive (500 μL/puits) pendant 5 min (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: La solution de rinçage anti-adhérence est essentielle pour une formation optimale d’EB et de sphéroïdes.
  5. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de formation EB contenant Y-27632 (concentration finale, 10 μM, voir Tableau des matériaux), avec une densité cellulaire de 1,5 x 106 cellules/mL.
  6. Retirer la solution de rinçage anti-adhérence et rincer chaque puits avec 2 mL de milieu de formation d’EB.
  7. Ajouter les cellules aux plaques spécialisées de 24 puits à une densité de 3 x 106 cellules/puits (Figure 1A, à gauche).
    REMARQUE: Normalement, 300 EB peuvent être préparés dans chaque puits. Cette méthode permet de préparer de grandes quantités d’EB de même taille.
  8. Centrifuger la plaque à 100 x g pendant 2 min à température ambiante. Répartir uniformément les cellules dans chaque chambre au bas de la plaque (Figure 1A, à droite).
    REMARQUE: S’il n’y a pas de centrifugeuse appropriée, la plaque peut également être placée directement dans l’incubateur pour la culture statique, mais le temps de formation de la boule EB sera plusieurs heures plus tard que celui sous centrifugation normale.
  9. Incuber les échantillons à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h. Si la centrifugation n’a pas été utilisée à l’étape précédente, incuber pendant 36 h. Gardez l’échantillon stable et ne le sortez pas de l’incubateur pendant cette période.

3. Préparation de la lampe à lumière douce (jour 1)

  1. Utilisez un panneau acrylique transparent d’une épaisseur de 0,3 à 0,5 cm dans la taille du papier A5. Collez des tampons blancs à l’avant et à l’arrière de la plaque acrylique.
    1. Installez une rangée de voyants blancs à DEL sur le bord de la plaque afin que les feux puissent entrer par le côté de la plaque acrylique, puis jaillir en parallèle (Figure supplémentaire 2A-F, Figure 1B).
      REMARQUE: Comme les diamètres des EB au stade précoce sont d’environ 200 μm à 300 μm, il est difficile de les observer clairement à l’œil nu sous la lampe fluorescente des bancs propres. En revanche, en raison de l’amélioration de la réflexion diffuse, nous pouvons détecter clairement les EB en utilisant une lumière douce éclairée latéralement (Figure 1B, C). Une plaque de 6 puits est recommandée pour les cultures EB dans les expériences ultérieures. Cependant, pour mieux montrer l’effet visuel de la lumière douce, la vaisselle est parfois utilisée pour prendre des photos et des vidéos dans cette étude au lieu d’assiettes, alors ne vous méprenez pas. La lampe à lumière douce éclairée latéralement peut également être utilisée pour la plaque à 6 puits.

4. Transfert EB et remplacement moyen (jours 2-5)

  1. Préparez une nouvelle plaque à faible adhérence de 6 puits et ajoutez 2 mL de milieu de formation EB à chaque puits.
  2. Retirez les EB avec le milieu avec une pointe de pipette à large alésage de 1000 μL (voir tableau des matériaux) et transférez-les sur la plaque à faible adhérence de 6 puits (~ 100 EB / puits).
    REMARQUE: Le processus de fonctionnement adopte une lampe à lumière douce (mentionnée à l’étape 3.) pour rendre les EB plus faciles à observer. Éteignez les autres sources de lumière intérieure pour obtenir l’effet visuel de la lumière douce.
  3. Remplacer par le même volume de milieu frais de formation d’EB tous les jours. Utilisez le flux secondaire pour rassembler les EB au centre et changer le milieu.
    1. Aspirer l’ancien milieu en pipetant lentement jusqu’au bord du puits. Ne pas sucer trop fort; sinon, les EB seront supprimés ensemble. Ensuite, ajoutez un milieu frais pour remettre en suspension les EB.
      NOTE : Le principal écoulement secondaire (Figure 1D). Induire un flux tourbillonnant en faisant pivoter le plat le long d’une orbite circulaire. En raison de l’écoulement tourbillonnant, un écoulement secondaire est induit dirigé vers le centre. Les EB ou organoïdes convergent vers le centre du puits en raison du flux secondaire généré par rotation, après quoi le changement de milieu ou le transfert d’embryides peut être exécuté facilement.

5. Vérification de la pluripotence en étiquetant avec le marqueur de pluripotence OCT4 (jour 4)

REMARQUE: Lorsque le diamètre des EB est supérieur à 300 μm, prenez plusieurs EB pour la coloration par immunofluorescence du marqueur OCT4 afin de détecter leur pluripotence.

  1. Fixer les EB dans 4% de paraformaldéhyde à 4 °C pendant 30 min, puis laver dans 1x PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  2. Transférer les EB sur pbS à température ambiante contenant 0,3% de Triton X-100 et 3% de BSA pendant 2 h, puis laver dans PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
    REMARQUE: Après avoir été traités avec Triton X-100, les EB flottent sur la surface du liquide et peuvent être facilement aspirés avec le liquide pendant le nettoyage. Le fonctionnement sous stéréomicroscope est recommandé.
  3. Diluer l’anticorps primaire OCT4 (voir tableau des matériaux) avec 1 mL de 1x PBS contenant 1% de BSA dans un rapport de 1:200 et ajouter aux EB pour l’incubation à 4 °C pendant la nuit, puis laver dans PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  4. Diluer l’anticorps secondaire respectif (voir tableau des matériaux) avec 1x PBS à 1:500 et ajouter 1 mL aux EB.
  5. Après avoir incubé à température ambiante pendant 2 h, lavez les cellules dans 1x PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  6. Retirer le PBS, ajouter 2 mL de solution 1x PBS contenant 1 μg/mL de DAPI, incuber à température ambiante pendant 10 min, puis laver dans PBS 3x pendant 10 min à chaque fois.
  7. Déplacez l’EB contenant une petite quantité de liquide sur la lame, scellez la lame avec un verre de couverture recouvert de vaseline disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) sur le bord, puis observez et collectez l’image sous le microscope confocal à fluorescence.
    REMARQUE : L’expression OCT4 représente la pluripotence EB12. Lorsque l’expression de l’OCT4 est inférieure à 90 %, les EB doivent être écartées et les EB doivent être préparées à nouveau.

6. Induction neuronale (jours 5-7)

  1. Préparez une nouvelle plaque de 6 puits à faible adhérence et ajoutez 3 mL de milieu d’induction neuronal (tableau supplémentaire 2) à chaque puits.
  2. Allumez la lumière douce latérale (mentionnée à l’étape 3.) et éteignez les autres sources lumineuses intérieures.
  3. Transférez les EB sur la plaque de 6 puits avec un milieu d’induction neuronal ajouté (~ 100 EB / puits). Ajoutez le moins possible du support d’origine au nouveau puits.
    REMARQUE: Introduisez des compétences simples de transfert organisationnel. Naturellement, sous gravité et avec une densité relativement plus élevée que le milieu, les EB remis en suspension vont progressivement couler en appliquant l’opération illustrée à la figure 1E. Par conséquent, les EB peuvent être facilement transférés. Étant donné que, par rapport aux EB, les cellules libres et les fragments de cellules mortes coulent plus lentement, la plupart des cellules libres et des fragments de cellules mortes peuvent ainsi être éliminés par cette méthode de sédimentation (Figure 1F).
  4. Incuber les échantillons à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
    REMARQUE: Au microscope, le diamètre des EB était d’environ 500 μm et le bord était translucide, ce qui indique qu’une couche neuroépithéliale s’est formée.
  5. Passez à l’étape suivante.

7. Intégration dans la matrice de la membrane basale (jours 7-10)

  1. Placer la matrice membranaire dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 60 minutes à l’avance pour la dissoudre. Calculez à l’avance la quantité de la matrice requise. Environ 100 EB ont été incorporés dans 1,5 mL de la matrice membranaire.
  2. Allumez la lumière douce latérale et éteignez la source lumineuse sur le dessus de la console.
  3. Gardez la matrice membranaire sur la glace pour éviter la solidification.
  4. Transférer une petite quantité d’EB dans un plat de 60 mm contenant un milieu d’expansion frais (tableau supplémentaire 3) à chaque fois. Réduisez le nombre d’EB pour faciliter la suppression d’un seul EB.
  5. Ensuite, utilisez une nouvelle plaque à faible adhérence de 6 puits. Aspirez un seul EB (contenant environ 10 μL de milieu) avec une pointe de pipette à alésage large de 200 μL (voir tableau des matériaux) à chaque fois, puis ajoutez-le au fond de la plaque de 6 puits pour obtenir des gouttelettes. Utilisez cinq gouttelettes par puits.
    REMARQUE: La clé consiste à ajuster la portée du pistolet à pipette à 50 μL et à aspirer un EB, puis à vous référer au fonctionnement de la Figure 1E. Lorsque l’EB se dépose à l’alésage de la pointe de la pipette, la pointe touche rapidement le fond du puits de la plaque et pousse environ 10 μL de liquide pour former une gouttelette.
  6. Ajouter 15 μL de matrice membranaire à chaque goutte contenant de l’EB et mélanger rapidement. Insérez la boule EB au centre de la gouttelette.
    REMARQUE: Les EB ne doivent pas être aspirés avec une pointe de pipette standard, ce qui endommage l’EB. L’embout de pipette à large alésage de 200 μL doit être utilisé à la place.
  7. Placez la plaque à 6 puits dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min et solidifiez les gouttelettes de matrice membranaire contenant des EB.
  8. Ajouter 3 mL du milieu d’expansion à chaque puits et faire sauter doucement les EB intégrés à la matrice pour les suspendre.
  9. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 3 jours.
    REMARQUE: Si l’on observe un bourgeonnement à la surface de l’EB, cela signifie qu’un neuroépithhélium expansé s’est formé16.

8. Maturation organoïde (jours 10-40)

  1. Retirer délicatement le milieu d’origine et ajouter 3 mL de milieu de maturation (tableau supplémentaire 4) à chaque puits.
  2. Placez la plaque organoïde sur un agitateur horizontal dans un incubateur à 37 °C.
  3. Continuez à faire pivoter la culture horizontalement. Réglez le shaker à la vitesse appropriée.
    REMARQUE: Lors de la culture d’organoïdes cérébraux sur une plaque à 6 puits, une force centrifuge relative (FCR) de 0,11808 x g est plus appropriée, selon le fabricant du shaker horizontal (voir tableau des matériaux). Selon la conversion entre la force centrifuge relative et la vitesse de rotation17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × tr/min2, où RCF = force centrifuge relative (g), rpm = tours par minute (r/min) et R = rayon de rotation (cm), également connu sous le nom de projection d’agitation. Les paramètres de projection d’agitation de différents agitateurs peuvent être différents. Par conséquent, on peut estimer que la vitesse de rotation est de 299 x (RCF/R)1/2.
  4. Changez le milieu de maturation frais tous les 2-3 jours.
  5. Après 20-30 jours, cultivez progressivement les organoïdes cérébraux jusqu’à maturité.
    REMARQUE: Pendant cette période, les organoïdes peuvent être utilisés pour des expériences et des détections, telles que la détection de marqueurs neuronaux et le séquençage du transcriptome 19,20,21.

9. Sections congelées et immunofluorescence des organoïdes cérébraux

  1. Fixez les organoïdes dans 4% de paraformaldéhyde à 4 °C pendant 16 h, puis lavez-les 3x avec 1x PBS pendant 10 min à chaque fois.
  2. Retirez le PBS et immergez les organoïdes dans du saccharose à 30 % à 4 °C pendant la nuit.
  3. Incorporer les organoïdes dans de la gélatine/saccharose à 10 %/7,5 % à 37 °C pendant 1 h, puis les transférer rapidement dans le moule d’encastrement.
  4. Ajouter de la glace carbonique à de l’éthanol à 100 % pour préparer une boue de glace carbonique/éthanol et y placer les échantillons organoïdes pour une congélation rapide.
  5. Conservez les échantillons congelés dans un congélateur à −80 °C. Au besoin, faites des sections congelées d’une épaisseur de 20 μm.
  6. Reportez-vous aux étapes 5.3.-5.5. pour l’immunofluorescence. Utilisez l’anticorps PAX6 pour marquer les cellules progénitrices apicales, l’anticorps TUJ1 (voir Tableau des matériaux) pour marquer les cellules neuronales 22,23,24 et le DAPI pour la coloration de l’ADN nucléaire.

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Résultats

La présente étude a induit des CSPi (figure 2B) dans des organoïdes cérébraux (figure 2C). Les EB cultivés au stade précoce ont exprimé le marqueur OCT4 (Figure 2A), ce qui indiquait une bonne pluripotence. Dans la dernière étape, les EB se sont développés en organoïdes cérébraux matures (Figure 2D). La recherche a cultivé des CSPi d’individus normaux en bonne santé et de patients atteints de SCA3 en or...

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Discussion

Les organoïdes cérébraux ouvrent de nouvelles voies pour la recherche médicale. De nombreuses applications utiles de cette technologie commencent seulement à être explorées28. Cette recherche a révélé que les résultats du séquençage du transcriptome des organoïdes cérébraux génétiquement malades et des organoïdes cérébraux normaux peuvent refléter les différences entre la maladie et la santé. Par exemple, les résultats de l’analyse des données ARN-seq (figure 3B) sont...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (subvention n ° 2020A0505100062), le projet de sujets clés de la science et de la technologie de la ville de Guangzhou (subvention n ° 201904020025), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions n ° 31872800, 32070582, 82101937) et le projet de subvention de recherche postdoctorale de la ville de Guangzhou (à Bangzhu Chen).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 &mu ; m FiltreNEST Biotechnology, Chine331001
1000 &mu ; L pointe de pipette à large alésageThermo Fisher Scientific, USA9405163
200 &mu ; L pointe de pipette à large calibreThermo Fisher Scientific, États-Unis9405020
2-MercaptoéthanolMerck, Allemagne8057400005
4 % de paraformaldéhydeServicebio, ChineG1101
Plaque à faible adhérence 6 puitsNEST Biotechnology, Chine703011Il est utilisé pour les cultures en suspension EB
Solution de détachement de cellules AaccuteSTEMCELL Technologies, Canada07920Il est utilisé pour digérer les iPSC en cellules uniques.
AggreWell800 24 puitsSTEMCELL Technologies, Canada34811Plaque de culture microporeuse pour la préparation des EB.
Solution de rinçage anti-adhérenceSTEMCELL Technologies, Canada07010Solution de rinçage pour les ustensiles de culture afin d’empêcher l’adhésion cellulaire
B27-vit. Un supplémentThermo Fisher Scientific, États-Unis12587010
bFGFPeprotech,États-Unis GMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology, ChineST025
CentrifugeuseEppendorf, Allemagne5810 RIl peut être utilisé pour la centrifugation de divers types de tubes à centrifuger, de bouteilles de réactifs et de plaques de travail.
Verre de couvertureÉquipement de laboratoire Shitai, Chine10212020C
DAPIBeyotime Biotechnology, ChineC1002Utilisé pour la coloration nucléaire. Après la combinaison du DAPI avec de l’ADN double brin, la longueur d’onde d’excitation maximale était de 364 nm et la longueur d’onde d’émission maximale était de 454 nm.
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, États-Unis11330032
FBS de qualité SEThermo Fisher Scientific, États-Unis10270106
Ficoll PaqueGeneral Electric Company, États-Unis17-5442-02Isolez les cellules mononucléées du sang périphérique selon la méthode Ficoll-Pace.
GélatineSangon Bioteach, ChineA609764
Supplément de GlutamaxThermo Fisher Scientific, États-Unis35050061
Supplément de GlutamaxThermo Fisher Scientific, États-Unis17504044
Anticorps anti-Poulet de chèvre IgY  ; anticorps secondaireAbcam, Royaume-Uniab150171Anticorps anti-Poulet de chèvre. Conjugaison : Alexa Fluor 647. Ex : 652 nm, Em : 668 nm. Utilisation à une dilution de 1:500.
Anticorps secondaire anti-IgG de souris de chèvreAbcam, UKab150120IgG anti-souris de chèvre. Conjugaison : Alexa Fluor 594. Ex : 590 nm, Em : 617 nm. Utilisation à une dilution de 1:500.
Anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvreAbcam, UKab150077IgG anti-lapin de chèvre. Conjugaison : Alexa Fluor 488. Ex : 495 nm, Em : 519 nm. Utilisation à une dilution de 1:500.
HeparinMerck, GermanyH3149
Agitateur horizontalServicebio, ChineDS-H200Une force centrifuge relative (RCF) de 0,11808 x g est plus appropriée, selon le fabricant INFORS HT (Switzerland).
InsulineMerck, AllemagneI9278-5ML
KOSRThermo Fisher Scientific, États-Unis10828028
MatrigelCorning, États-Unis354277Matrigel se solidifie dans l’environnement à une température supérieure à 4 ° ; C, il doit donc être sous-emballé à basse température.
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, États-Unis11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, Canada85850Milieu de culture iPSC
Supplément N2Thermo Fisher Scientific, États-Unis17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, États-Unis21103049
OCT4 Anticorps primaireAbcam, Royaume-Uniab19857Hôte : Lapin. Dissoudre avec 500 &mu ; L PBS. Utilisation à une dilution de 1:200.
Trancheuse congelée pathologiqueLeica, AllemagneLeica CM1860
PAX6 anticorps primaireAbcam, UKab78545Hôte : Souris. Utilisation à une dilution de 1:100.
PBSSTEMCELL Technologies, Canada37350
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific, États-Unis15140122
solution de dissociation PSCBeijing Saibei Biotechnology, ChineCA3001500La solution de dissociation sans enzyme peut être utilisée pour la digestion et le passage des iPSC.
Kit de reprogrammation SendaiThermo Fisher Scientific, USAA16518Établissez iPSC selon le protocole du kit de reprogrammation Sendai.
Slide GlassShitai Laboratory Equipment, Chine188105W
Lampe à lumière douceNUT NUTUn appareil simple fabriqué par vous-même, reportez-vous à la figure supplémentaire 2 pour la préparation.
Kit d’organoïdes cérébraux STEMdiffSTEMCELL Technologies, Canada8570Contient : 1. Milieu de formation EB ; 2. Milieu d’induction ; 3. Milieu d’expansion ; 4. Milieu de maturation.
STEMdiff Kit de maturation d’organoïdes cérébrauxSTEMCELL Technologies, Canada8571Maturation Medium
SaccharoseSangon Bioteach, ChineA502792
Triton X-100Merck, AllemagneX100
TUJ1 anticorps primaireAbcam, Royaume-Uniab41489Hôte : Poulet. Utilisation à une dilution de 1:1000.
VaselineSangon Bioteach, ChineA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, Canada72302Préparer une solution mère de 5 mM dans du PBS, remettre en suspension 1 mg dans 624 & micro ; L de PBS.
Weblink
Données brutes de séquençage Archive deséquences génomiques (génomique, protéomique et Bioinformatique 2021) dans le Centre national de données génomiques (Nucleic Acids Res 2022), Centre national chinois de bioinformation / Institut de génomique de Pékin, Académie chinoise des sciencesGSA-Human : HRA002430https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

Références

  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
  2. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
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