Sectionnement osseux temporal humain à grande vitesse pour l’évaluation de la pathologie de l’oreille moyenne associée à la COVID-19

Résumé

Cet article décrit une technique de section osseuse temporale humaine rapide qui utilise une micro scie à lames de diamant jumelles pour générer de fines tranches de décalcification rapide et l’analyse de l’immunohistochimie osseuse temporale.

Résumé

L’analyse histopathologique des sections osseuses temporales humaines est une technique fondamentale pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne. Les coupes osseuses temporales sont préparées par prélèvement osseux temporal post-mortem, fixation, décalcification, encastrement et coloration. En raison de la densité de l’os temporal, la décalcification est un processus long et gourmand en ressources; la préparation complète des tissus peut prendre de 9 à 10 mois en moyenne. Cela ralentit la recherche en otopathologie et entrave les études urgentes, telles que celles pertinentes pour la pandémie de COVID-19. Cet article décrit une technique de préparation et de décalcification rapides des coupes osseuses temporales pour accélérer le traitement des tissus.

Les os temporaux ont été récoltés après l’autopsie à l’aide de techniques standard et fixés dans 10% de formol. Une micro scie de précision avec deux lames diamantées a été utilisée pour couper chaque section en trois sections épaisses. Les coupes osseuses temporales épaisses ont ensuite été décalcifiées dans une solution décalcifiante pendant 7 à 10 jours avant d’être incorporées dans de la paraffine, sectionnées en sections minces (10 μm) à l’aide d’un cryotome et montées sur des lames non chargées. Les échantillons de tissus ont ensuite été déparaffinisés et réhydratés pour la coloration des anticorps (ACE2, TMPRSS2, Furin) et imagés. Cette technique a réduit le temps entre la récolte et l’analyse des tissus de 9-10 mois à 10-14 jours. La section osseuse temporale à grande vitesse peut augmenter la vitesse de la recherche en otopathologie et réduire les ressources nécessaires à la préparation des tissus, tout en facilitant les études urgentes telles que celles liées à la COVID-19.

Introduction

La recherche sur les os temporaux humains fournit une ressource inestimable pour étudier la pathologie et la physiopathologie de l’oreille interne et moyenne. Avant le 19ème siècle, on savait peu de choses sur les maladies otologiques ^1,2,3. Pour mieux comprendre les maladies otologiques et « sauver la chirurgie auditive des mains des charlatans », Joseph Toynbee (1815-1866) a développé des méthodes pour étudier les sections histologiques de l’os temporal humain³. Ce travail a été poursuivi par Adam Politzer (1835-1920) à Vienne et dans d’autres à trav....

Protocole

Ce protocole a été élaboré avec l’approbation de la CISR (IRB00250002) et conformément aux politiques institutionnelles relatives à l’utilisation de tissus humains et de matières infectieuses. Chaque donneur d’os temporel a donné son consentement écrit avant son décès, ou le consentement a été obtenu à titre posthume de la famille du donneur. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Récolte osseuse temporale

1. Obtenir l’approbation du conseil d’examen institutionnel local (CISR), examiner les politiques in....

Résultats

La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la muqueuse de l’oreille moyenne et de la trompe d’Eustache a montré une préservation de la muqueuse de l’oreille moyenne et du tissu sous-muqueux de l’oreille moyenne après traitement (figure 1). Les images immunohistochimiques ont montré l’expression des protéines ACE2, TMPRSS2 et Furin dans la muqueuse de l’oreille moyenne et la trompe d’Eustache (Figure 1). La présence de ces protéines dans l’oreille moyenne fo.......

Discussion

La recherche sur les os temporaux humains est essentielle pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne, mais reste une entreprise exigeante en temps et en ressources. Cet article décrit une technique qui utilise une microse à diamant pour générer des coupes osseuses temporales épaisses qui peuvent être rapidement décalcifiées avant d’autres coupes afin que le temps entre la récolte des tissus et l’étude puisse être réduit de 9-10 mois à 10-14 jours. Cette technique peut réduire les ressources nécessaires au.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-ACE-2 (dilution appliquée 1:50)	Novus Biologicals	SN0754
Anticorps anti-furine (dilution 1:250)	Anticorps anti-TMPRSS2 Abcam	EPR 14674
(dilution 1:1 000)	Novus Biologicals	NBP1-20984
BX43 Microscope à système manuel	Olympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade	Pace Technologies	WB-007GP
Collin Mallet - 8''	Surgical Mart	SM1517
DS-Fi3 Microscope Camera	Nikon
Dual Endogenenous Enzyme Block (solution de blocage commerciale)	Dako	S2003
Eaosin Stain	Sigma-Aldrich	548-24-3
Solution de formol, neutre tamponné 10 %	Décalcifiant Sigma-Aldrich	HT501128
Formical-4 (solution décalcifiante d’acide formique)	StatLab	1214-1 GAL
Coloration hématoxyline	Sigma-Aldrich	H9627
HRP-Anticorps secondaire anti-lapin conjugué HRP (dilution 1:100)	Leica Biosystems	PV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat Detection Kit, peroxydase (1:100 dilution)	Vector Laboratories	MP-7405
Lambotte Osteotome	Surgical Mart	SM1553
Métallographique PICO 155P Scie de précision	Pace Technologies	PICO 155P	microscie
NIS Elements Version logicielle 4.6	Nikon
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	paraffine
Lames de microscope à charge positive avec extrémité givrée blanche	Walter Products	1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome	New Life Scientific Inc.	A78900104	cryotome
Triology Pretreatment Solution (solution de prétraitement commerciale)	Sigma-Aldrich	920P-05
Xylene	Sigma-Aldrich	920P-05