In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Sheng Chen; Zachary Gao Sun; Michael P. Murrell

doi:10.3791/64026

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Article de méthode

In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

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DOI :

10.3791/64026

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25 août 2022

Sheng Chen¹ , Zachary Gao Sun²^,³ , Michael P. Murrell¹^,²^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Yale University, ²Systems Biology Institute, Yale University, ³Department of Physics, Yale University

Dans cet article

Résumé

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

Résumé

Le cytosquelette d’actine, la principale machinerie mécanique de la cellule, intervient dans de nombreuses activités cellulaires physiques essentielles, notamment la déformation, la division, la migration et l’adhésion cellulaires. Cependant, l’étude de la dynamique et de la structure du réseau d’actine in vivo est compliquée par la régulation biochimique et génétique au sein des cellules vivantes. Pour construire un modèle minimal dépourvu de régulation biochimique intracellulaire, l’actine est encapsulée dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV, également appelées liposomes). Les liposomes biomimétiques sont de la taille d’une cellule et facilitent un aperçu quantitatif des propriétés mécaniques et dynamiques du réseau de cytosquelettes, ouvrant une voie viable pour la biologie synthétique ascendante. Pour générer des liposomes pour l’encapsulation, la méthode d’émulsion inversée (également appelée méthode de transfert d’émulsion) est utilisée, qui est l’une des techniques les plus efficaces pour encapsuler des solutions complexes dans des liposomes afin de préparer divers systèmes imitant les cellules. Avec cette méthode, un mélange de protéines d’intérêt est ajouté au tampon interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des phospholipides pour former des gouttelettes lipidiques monocouches. Les liposomes souhaités sont générés à partir de gouttelettes lipidiques monocouches traversant une interface lipide/huile-eau. Cette méthode permet l’encapsulation de polymères d’actine concentrés dans les liposomes avec les composants lipidiques souhaités, ouvrant la voie à la reconstitution in vitro d’un réseau de cytosquelettes biomimiques.

Introduction

Le cytosquelette d’actine joue un rôle fondamental dans la construction de l’architecture intracellulaire de la cellule en coordonnant la contractilité au niveau moléculaire et la génération de force ^1,2,3. En conséquence, il intervient dans de nombreuses activités cellulaires essentielles, notamment la déformation cellulaire^4,5, la division⁶, la migration ^7,8 et l’adhésion⁹. La reconstitution in vitro d....