Utilisation de données à un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité dans les interactions caenorhabditis elegans-bactériennes

Megan N. Taylor; Satya Spandana Boddu; Nic M. Vega

doi:10.3791/64027

Article de méthode

Utilisation de données à un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité dans les interactions caenorhabditis elegans-bactériennes

DOI :

10.3791/64027

⸱

22 juillet 2022

Megan N. Taylor¹ , Satya Spandana Boddu² , Nic M. Vega¹^,²

¹Department of Biology, Emory University, ²Department of Physics, Emory University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une perturbation de 96 puits de Caenorhabditis elegans colonisés par des bactéries individuelles à la suite d’une paralysie par le froid et d’un blanchiment de surface pour éliminer les bactéries externes. La suspension résultante est plaquée sur des plaques de gélose pour permettre une quantification précise et à débit moyen de la charge bactérienne dans un grand nombre de vers individuels.

Résumé

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Le nématode Caenorhabditis elegans est un système modèle pour les interactions hôte-microbe et hôte-microbiome. À ce jour, de nombreuses études utilisent des digestes par lots plutôt que des échantillons individuels de vers pour quantifier la charge bactérienne dans cet organisme. Ici, il est soutenu que la grande variabilité interindividuelle observée dans la colonisation bactérienne de l’intestin de C. elegans est informative et que les méthodes de digestion par lots rejettent les informations importantes pour une comparaison précise entre les conditions. Comme la description de la variation inhérente à ces échantillons nécessite un grand nombre d’individus, un protocole pratique de plaque de 96 puits pour la perturbation et le placage des colonies de vers individuels est établi.

Introduction

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L’hétérogénéité des associations hôte-microbe est observée partout, et la variation entre les individus est de plus en plus reconnue comme un facteur contribuant aux processus au niveau de la population, de la compétition et de la coexistence¹ à la transmission de la maladie ^2,3,4. Chez C. elegans, une « hétérogénéité cachée » au sein des populations isogéniques a été observée à plusieurs reprises, avec des sous-populations d’individus présentant des phénotypes distincts dans la réponse au choc thermique^....

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Protocole

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Les vers utilisés dans ces expériences ont été obtenus auprès du Caenorhabditis Genetic Center, financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 est le type sauvage. Les mutants DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) et daf-2(e1370) III (CGC CB1370) sont utilisés pour illustrer les différences de charge bactérienne intestinale.

HT115(DE3) E. coli portant le vecteur ARNi pos-1 provient de la bibliothèque Ahringer²¹. La collection MYb de bactéries intestinales natives de C. elegans ²² a été obtenue au la....

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Résultats

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Stérilisation à l’eau de Javel des vers vivants
Les vers blanchis en surface sont effectivement exempts de bactéries externes jusqu’à ce que la motilité revienne et que l’excrétion reprenne. Dans les conditions utilisées ici, on observe une extinction rapide des bactéries dans le tampon (Figure 1A-C, Figure supplémentaire 2, Vidéo 1) sans perturber les bactéries associées à l’intestin chez les vers paralysés par le froid (

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Discussion

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Ici, des données sont présentées sur les avantages de la quantification par un seul ver de la charge bactérienne chez C. elegans, ainsi que sur un protocole de perturbation de 96 puits pour permettre l’acquisition rapide et cohérente de grands ensembles de données de ce type. Par rapport aux méthodes existantes³³, ces protocoles permettent une mesure à plus haut débit des communautés microbiennes intestinales dans le ver.

Cette approche a le placage comme une é.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier H. Schulenberg et C. LaRock pour leur généreux partage des souches bactériennes utilisées dans ces expériences. Ce travail a été soutenu par un financement de l’Université Emory et de la NSF (PHY2014173).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de polypropylène à fond plat à 96 puits, 300 uL	Evergreen Labware	290-8350-03F
Tapis d’étanchéité à plaques à 96 puits, silicone, puits carrés (AxyMat)	Axygen	AM-2ML-SQ
Plaques à 96 puits, 2 mL, puits carrés	Axygen	P-2ML-SQ-C-S Couvercles
à plaques en polypropylène à 96 puits	Evergreen Labware	290-8020-03L
Agar	Fisher Scientific	443570050
Jeu d’adaptateurs de broyeur à billes pour plaques à 96 puits	QIAGEN	119900	Plaques d’adaptation à utiliser avec deux plaques à 96 puits sur le TissueLyser II
Homogénéisateur de tissus de broyeur à billes (TissueLyser II)	QIAGEN	85300	Homogénéisateur mécanique pour la perturbation d’échantillons à moyen et haut débit
BioSorter	Union Biometrica		Trieuse d’objets de grande taille équipée d’un foyer de 250 microns pour C. elegans
Eau de Javel, commerciale, 8,25 % d’hypochlorite de sodium	Clorox
Breathe-Easy Membrane d’étanchéité perméable aux gaz à 96 puits	Diversified Biotech	BEM-1	Membranes polyuréthanes perméables aux gaz à plaques multipuits. Le film d’étanchéité mince est perméable à l’O2, au CO2 et aux vapeurs d’eau et est transparent aux UV jusqu’à 300 nm. Stérile, 100/boîte.
Chlorure de calcium dihydraté	Fisher Scientific	AC423525000
Cholestérol	VWR	AAA11470-30
Acide citrique monohydraté	Fisher Scientific	AC124910010 Sulfate de
cuivre (II) pentahydraté	Fisher Scientific	AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifugeuse	Corning	; COR-6765
Disodium EDTA	Fisher Scientific	409971000
DL 1,4 Dithiothréitol, 99+ %, pour la biologie mol, sans DNAse, ARNASE et Protéase, ACROS Organics	Fisher Scientific	327190010
Eppendorf 1,5 mL microcentrifugeuse Eppendorf
Eppendorf 5424R	Eppendorf	5406000640	Microcentrifugeuse de paillasse réfrigérée 24 places
Centrifugeuse Eppendorf 5810R avec rotor S-4-104	Centrifugeuse de	22627040	3L avec adaptateurs pour tubes et plaques de 15-50 mL
Godet à plaques Eppendorf (x2), pour rotor S-4-104	Eppendorf	22638930
Éthanol 100 %	Fisher Scientific	BP2818500
Billes de verre, 2,7 mm	Produits des sciences de la vie	LS-79127
Perles de verre, lavées à l’acide, 425-600 & micro ; m	Sigma	G877-500G
Perles de placage en verre	VWR	76005-124
Acide chlorhydrique	VWR	BDH7204-1
Sulfate de fer (II) heptahydraté	Scientific	423731000
Moteur pilon à granulés Kimble Kontes	DWK Life Sciences	749540-0000
Pilons à granulés en polypropylène Kimble Kontes et microtubes, 0,5 mL	DWK Life Sciences	749520-0590
Microscope inversé motorisé Leica DMi8 avec platine motorisée	Leica	11889113
Logiciel Leica LAS X Premium	Leica	11640687
Sulfate de magnésium heptahydraté	Fisher Scientific	AC124900010
Chlorure de manganèse(II) tétrahydraté	VWR	470301-706
PARAFILM M film d’étanchéité de laboratoire flexible	Amcor	PM996
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Boîtes de Pétri, rondes, 10 cm	VWR	25384-094
Boîtes de Pétri, rondes, 6 cm	VWR	25384-092
Boîtes de Pétri, carrées, 10 x 10 cm	VWR	10799-140
Tamponnées phospho-tamponnées solution saline (1X PBS)	Gold Bio	P-271-200
Plateau autoclave en polypropylène, peu profond	Fisher Scientific	13-361-10
Hydroxyde de potassium	Fisher Scientific	AC134062500
Phosphate de potassium dibasique	Fisher Scientific	BP363-1
Phosphate de potassium monobasique	Fisher Scientific	BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443	R Foundation	n/a
Spatule de laboratoire de type cuillère, métal	VWR	470149-438
Carbure de silicium grain 36	MJR Tumblers	n/a	Noir grain de carbure de silicium extra grossier. Disponible dans des tailles de 0,5 à 5 lb chez ce fournisseur.
Dodécylsulfate de sodium	Fisher Scientific	BP166-100
Hydroxyde de sodium	VWR	BDH7247-1
Phosphate dibasique de sodium anhydre	Fisher Scientific	BP332-500
Chlorure de sodum	Fisher Scientific	BP358-1
Saccharose	Fisher Scientific	AC419760010
Tripotassique citrate monohydraté	Fisher Scientific	AC611755000
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Sulfate de zinc heptahydraté	Fisher Scientific	AC205982500

paillasse Eppendorf Fisher

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
Stephenson, J., et al. Host heter....

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Mots-clés

Caenorhabditis Elegans Bacterial Colonization Host Microbe Interactions Single Worm Quantification 96 Well Plate Mechanical Disruption Colony Plating Surface Bleaching Serial Dilution Intestinal Bacterial Load

Utilisation de données à un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité dans les interactions caenorhabditis elegans-bactériennes

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