Évaluation non destructive de la densité cellulaire régionale dans les agrégats tumoraux après un traitement médicamenteux

Résumé

Le présent protocole développe une technique basée sur l’image pour la mesure rapide, non destructive et sans étiquette de la densité cellulaire régionale et de la viabilité dans les agrégats tumoraux 3D. Les résultats ont révélé un gradient de densité cellulaire, avec des densités cellulaires plus élevées dans les régions centrales que dans les couches externes dans les agrégats en développement et principalement la mort cellulaire périphérique dans les agrégats HER2+ traités avec trastuzumab.

Résumé

Les modèles de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) ont démontré une utilité croissante pour l’étude in vitro de la progression du cancer et la découverte de médicaments. Ces constructions avasculaires relativement simples imitent des aspects clés des tumeurs in vivo , tels que la structure 3D et les gradients physiopathologiques. Les modèles MCTS peuvent fournir des informations sur le comportement des cellules cancéreuses pendant le développement des sphéroïdes et en réponse aux médicaments; cependant, leur taille requise limite considérablement les outils utilisés pour l’évaluation non destructive. L’imagerie structurelle par tomographie par cohérence optique et le logiciel d’analyse 3D Imaris sont explorés pour une mesure rapide, non destructive et sans étiquette de la densité cellulaire régionale dans les SCTM. Cette approche est utilisée pour évaluer les SCT sur une période de maturation de 4 jours et tout au long d’un traitement prolongé de 5 jours avec le Trastuzumab, un médicament anti-HER2 cliniquement pertinent. En bref, les MCTS au565 HER2+ pour le cancer du sein ont été créés par superposition liquide avec ou sans ajout de Matrigel (une matrice de membrane basale) pour explorer des agrégats de différentes morphologies (agrégats 2.5D plus épais, semblables à des disques ou agrégats 2D plats, respectivement). La densité cellulaire dans la région externe, la région de transition et le noyau interne a été caractérisée dans les SCTM matures, révélant un gradient de densité cellulaire avec des densités cellulaires plus élevées dans les régions centrales par rapport aux couches externes. L’addition de matrice a redistribué la densité cellulaire et amélioré ce gradient, diminuant la densité de la zone externe et augmentant le compactage cellulaire dans les noyaux. La densité cellulaire a été quantifiée après un traitement médicamenteux (0 h, 24 h, 5 jours) dans des zones progressivement plus profondes de 100 μm afin d’évaluer les différences régionales potentielles dans la réponse aux médicaments. Au dernier point temporel, presque toute la mort cellulaire semblait être limitée aux 200 μm externes de chaque agrégat, tandis que les cellules plus profondes dans l’agrégat semblaient en grande partie intactes, illustrant les différences régionales dans la réponse au médicament, peut-être en raison des limitations de la pénétration du médicament. Le protocole actuel fournit une technique unique pour quantifier de manière non destructive la densité cellulaire régionale dans les tissus cellulaires denses et la mesurer longitudinalement.

Introduction

Les chercheurs se sont largement tournés vers les systèmes de culture 3D in vitro de paillasse pour étudier certaines des caractéristiques clés de la progression tumorale. Une grande partie de ces recherches a été menée par la réémergence de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) et d’organoïdes plus complexes ^1,2. Bien que ces modèles soient avasculaires, ils fournissent un outil puissant pour récapituler les processus physiologiques et pathologiques qui se produisent in vivo ^3,4,5. En particulier, les modèles de taille moyenne (300-500 μm de diamètre) peuvent imiter les caractéristiques clés de la tumeur telles que la structure 3D, les gradients physiopathologiques et la signalisation métastatique due à l’hypoxie dans le noyau. Il est bien documenté que ces modèles présentent les couches concentriques caractéristiques observées dans les tumeurs in vivo vascularisées, à savoir une couche externe de cellules prolifératives, une couche transitionnelle de cellules sénescentes / quiescentes et des cellules souffrant d’hypoxie dans le noyau ^3,6,7,8,9 . Des informations uniques peuvent être obtenues à partir de ces modèles en caractérisant le comportement cellulaire au sein de ces couches, pendant le développement et en réponse au médicament. Cependant, la taille requise des SCTM, nécessaire pour développer les gradients qui en font des modèles in vitro aussi puissants, limite considérablement les outils utilisés pour l’évaluation non destructive. En effet, l’un des plus grands défis de l’analyse non destructive des MTCS est la quantification des détails à l’échelle cellulaire. La microscopie à champ lumineux et à contraste de phase est couramment utilisée pour évaluer la croissance et le développement des SCTM 3D de manière non destructive. Cependant, ces modalités sont limitées aux projections 2D, manquant de la capacité de visualiser la structure 3D cruciale de ces modèles 10,11,12,13. L’information sur la cytotoxicité et la prolifération cellulaire est généralement recueillie par imagerie fluorescente (c.-à-d. microscopie à feuille de lumière, microscopie confocale) ou par coloration immunohistologique ex vivo 14,15,16. Bien que ces approches fournissent des informations précieuses et à haute résolution sur la structure tissulaire, la densité cellulaire et la fonction cellulaire, elles nécessitent souvent la préparation d’échantillons tels que le nettoyage optique, la fixation / coloration ou l’intégration qui empêche les analyses longitudinales.

La tomographie par cohérence optique (OCT) est une modalité d’imagerie structurelle non destructive qui a le potentiel de surmonter certains des défis mentionnés ci-dessus. Il bénéficie d’une résolution cellulaire et d’un champ de vision suffisamment large (jusqu’à 10 mm x 10 mm) capable de visualiser des agrégats multicellulaires entiers 17,18,19. Il est important de noter qu’en raison de la nature visible de la lumière utilisée, cette technique est totalement non destructive et sans étiquette¹⁷. En outre, les échantillons peuvent être imagés in situ sans nécessiter de préparation d’échantillons, de sorte que les échantillons peuvent être prélevés directement de l’incubateur, rapidement scannés avec OCT (durée de numérisation ~ 5-10 min), puis retournés à l’incubateur, permettant une caractérisation longitudinale. De nombreuses études cherchant à utiliser l’OCT pour analyser le comportement des sphéroïdes tumoraux ont récemment émergé. Dans l’une des démonstrations les plus passionnantes, Huang et al. ont utilisé l’OCT pour détecter de manière non destructive les noyaux nécrotiques dans de grands modèles de sphéroïdes tumoraux, notant que les régions de cellules vivantes et mortes possèdent des différences perceptibles dans l’atténuation optique, qui peuvent être utilisées pour la surveillance de la viabilité sans étiquette²⁰. De même, Hari et al. ont effectué des mesures de l’indice de réfraction (IR) des sphéroïdes du cancer du côlon humain (HCT116) imagés avec OCT pour étudier la présence d’hypoxie dans les échantillons²¹. Leurs mesures n’étaient pas suffisantes pour les inférences directes, bien qu’ils aient observé une IR plus faible dans des endroits qui étaient en corrélation avec le site, mais pas la taille, des carottes nécrotiques, identifiées plus tard par microscopie confocale. Abd El-Sadek et al. ont utilisé l’OCT pour visualiser et quantifier la viabilité tissulaire régionale des modèles tumoraux du cancer du sein²². Ils ont rapporté deux méthodes basées sur l’OCT pour visualiser la dynamique tissulaire et ont montré une corrélation modérée entre les différences dans ces mesures et les régions identifiées par microscopie de cellules vivantes / mortes.

Nos travaux publiés utilisant l’OCT se sont appuyés sur cette littérature antérieure pour établir une approche quantitative et non destructive pour mesurer la morphologie 3D et le nombre de cellules dans les modèles de cancer du sein MCTS au cours du développement^10,23. En utilisant le logiciel d’analyse d’images de rendu 3D Imaris pour compter le nombre d’objets de la taille d’une cellule (c’est-à-dire des taches) imagés dans les scans de volume OCT, le nombre de cellules a été mesuré de manière non destructive dans des SCTM qui étaient statistiquement similaires à ceux déterminés par hémocytomètre lors de la dissociation agrégée. Cependant, en raison de la nature structurelle de l’OCT, les membranes cellulaires encore présentes après la mort cellulaire par nécrose peuvent être comptées à tort comme des cellules vivantes. De plus, cette caractérisation a été étendue pour suivre de manière non destructive la viabilité cellulaire au sein d’agrégats individuels soumis à un régime médicamenteux avec un succès prometteur¹⁰. Fait important, il a été noté que notre approche OCT-Imaris a rapporté une viabilité cellulaire similaire avec ce qui a été comparé dans ces échantillons lors de la dissociation. Cette approche cellulaire non destructive et sans étiquette permet de compter les cellules dans des constructions 3D et des agrégats denses longitudinalement sans sacrifier la structure construction/agrégat.

Le présent travail fait état d’une approche améliorée pour quantifier directement la densité cellulaire régionale dans les agrégats denses en tirant parti de la capacité d’OCT-Imaris à mesurer à la fois la morphologie des agrégats 3D et le nombre de cellules. Cette avancée méthodologique fournit une image plus détaillée de la distribution spatiale et de la prolifération des cellules dans les couches concentriques caractéristiques des modèles MCTS. Plutôt que de simplement calculer une densité cellulaire agrégée moyenne globale, de telles mesures de densité locale peuvent révéler des gradients de densité cellulaire, tels que ceux associés au compactage. Cette évaluation régionale est également appliquée aux agrégats traités avec un agent chimiothérapeutique afin d’évaluer la réponse régionale aux médicaments, mesurée par les changements dans la densité cellulaire locale. Cette combinaison d’OCT et de méthodes d’analyse d’imagerie avancées fournit une quantification de la viabilité cellulaire régionale, qui peut être utilisée pour explorer la pénétration des médicaments en fonction des régions qui connaissent une diminution de la densité cellulaire. Il s’agit du premier rapport à quantifier de manière non destructive la densité cellulaire régionale et la viabilité en réponse au médicament dans les tissus cellulaires denses et à le mesurer longitudinalement. Une telle caractérisation de la densité cellulaire tridimensionnelle et de la distribution spatiale dans des SCTM entiers peut aider à optimiser l’administration de médicaments dans le traitement du cancer et à améliorer la compréhension de la progression du modèle du cancer.

Protocole

Les lignées cellulaires de cancer du sein AU565 (HER2+) et MDA-MB-231 ont été utilisées pour la présente étude (voir tableau des matériaux).

1. Préparation des agrégats tumoraux

1. Préparer le milieu de croissance des cellules cancéreuses du sein AU565 (HER2+) à l’aide du milieu basal (+) 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) dans la L-glutamine complétée par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine (voir tableau des matériaux).
2. Préparer le milieu de croissance des cellules cancéreuses du sein triple négatif MDA-MB-231 à l’aide du milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 2 mM de L-glutamine (voir tableau des matériaux).
3. Préparer des cultures cellulaires confluentes à 70% à 90% des deux lignées cellulaires (~ 3-4 jours de préparation) dans des conditions standard (37 ° C, 5% de CO₂, 95% d’humidité relative). Détacher les monocouches cellulaires de leurs flacons de culture en suivant la méthode de trypsinisation standard.
   REMARQUE: Prévenir la surexposition des cellules à la trypsine, affectant leur viabilité.
   1. Pour les cellules AU565, aspirer les milieux cellulaires de la fiole à l’aide d’une pipette (ou, si disponible, à l’aide d’une pompe à vide reliée par un tube à une pointe de pipette en verre autoclavée) et remplacer par 2 mL de trypsine-EDTA. Laissez la fiole pendant 3 minutes à température ambiante, puis passez à l’incubateur pendant 4 minutes supplémentaires. Ensuite, ajoutez 6 mL de milieu de croissance à la fiole pour neutraliser la trypsine.
   2. Pour les cellules MDA-MB-231, aspirer les milieux cellulaires de la fiole de la même manière que celle effectuée à l’étape 1.3.1 et remplacer par 1,5 mL de trypsine-EDTA. Après 7 min d’incubation, ajouter 8,5 mL de milieu de croissance à la fiole pour neutraliser la trypsine.
4. Ajouter 10 μL de la suspension cellulaire à un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules dans la suspension²⁴. Remettre en suspension les cellules dans un milieu à la concentration souhaitée de 2,5 × 10⁵ cellules/mL.
5. Distribuer 50 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond, non adhérente. Pour les suspensions préparées sans Matrigel (matrice de membrane basale, voir Tableau des matériaux), ajouter 50 μL de milieu de croissance ordinaire à chaque puits.
   1. Pour les suspensions préparées avec la matrice de la membrane basale, retirer le flacon de matrice du stockage à -20 °C et le placer au réfrigérateur pour le décongeler pendant la nuit. Préparer un récipient avec un milieu de croissance et réfrigérer pendant 10 min pour refroidir.
   2. À l’aide d’une pointe de pipette congelée, ajouter la matrice au milieu réfrigéré de manière à ce que la concentration finale de cette solution soit de 5%. Ajouter 50 μL de ce milieu à chaque puits, de sorte que la concentration finale de matrice dans ces puits soit de 2,5 %³.
      REMARQUE: Dans des travaux antérieurs, la morphologie agrégée a été évaluée pour ces lignées cellulaires^10,25 et a révélé que les agrégats MDA-MB-231 forment des sphéroïdes avec l’ajout de la matrice membranaire, tandis que les cultures MDA-MB-231 sans matrice et au565+/- matrice forment toutes des agrégats en forme de disque. La sphéricité quantifiée de >0,8 sur une échelle de 0 (plan) à 1,0 (sphère parfaite) a été utilisée pour identifier des agrégats suffisamment sphériques et devrait donc avoir le rapport surface/volume requis pour un comportement in vivo ^{de type 26,27}.
6. Centrifuger les plaques à 123 x g pendant 10 min à température ambiante immédiatement après l’ensemencement pour assurer la collecte d’une pastille cellulaire au fond de chaque puits.
   REMARQUE: Cette étape doit avoir lieu le plus rapidement possible après l’ensemencement. Les auteurs ont observé que trop de temps entre ces étapes permet aux cellules de s’installer sur les fonds et les côtés de chaque puits, ce qui inhibe leur capacité à s’accumuler et à s’agréger au fond du puits.
7. Incuber les plaques pendant 4 jours, moment auquel les agrégats cellulaires sont considérés comme matures.
   REMARQUE: Les agrégats AU565 préparés avec la matrice de la membrane basale nécessitent une période de culture supplémentaire de 5 jours pour l’étude de réponse au médicament (9 jours au total, changement de milieu au jour 4).

2. Administration de trastuzumab (TZM) à des agrégats cellulaires AU565

1. Préparer 500 μg/mL de solution de TZM (voir tableau des matériaux) dans un milieu de croissance AU565. Le jour 4, ajouter 10 μL de cette solution à chaque puits, de sorte que la concentration finale dans chaque puits soit de 50 μg/mL.
2. Agrégation de culture pendant 5 jours supplémentaires après l’ajout de TZM et évaluation à des moments clés.
   REMARQUE : Pour la présente étude, des points de temps de 0 h (immédiatement avant la prise de drogue), de 24 h et de 120 h après la prise de médicament ont été utilisés pour analyser le médicament.

3. Imagerie par tomographie par cohérence optique

REMARQUE: Les échantillons ici ont été imagés avec la tomographie par cohérence optique (OCT) au cours de chaque jour de maturation (1-4), puis à nouveau le jour 5 (24 heures après l’ajout de médicament) et le jour 9 (120 h après l’ajout de médicament) pour certains agrégats médicamentés. Un système commercial de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SDOCT, voir Table des matériaux) pour l’imagerie OCT a été utilisé pour la présente étude. Bien que cette approche se prête à presque tous les systèmes PTOM et que la procédure suivie soit généralement similaire entre les différents systèmes, certaines des étapes détaillées qui suivent sont spécifiques à l’équipement actuel.

1. Utilisez un système OCT pour l’imagerie structurelle. Réglez la fréquence de balayage A sur 5,5 kHz pour la collecte d’images haute résolution. Réglez l’indice de réfraction à 1,33 pour les échantillons dans un milieu liquide. Réglez la taille du voxel sur 1,10 x 1,10 x 2,58 μm³.
2. Dans la fenêtre Paramètres de l’image sur le côté droit de l’écran, définissez le champ de vision (FOV) en entrant les valeurs X, Y et Z (en mm) de sorte que l’échantillon soit englobé dans cette région d’intérêt.
   REMARQUE : Le champ de vision de ces études était généralement réglé sur 1,5 x 1,5 x 0,5 mm³. Assurez-vous que l’échantillon s’insère dans cette région en alternant l’entrée « Angle » entre 0 et 90 degrés et en effectuant une confirmation visuelle.
3. Cliquez sur Mode d’acquisition 3D, puis sur Enregistrer pour collecter le scan de volume 3D de l’échantillon.

4. Analyse d’images

1. Exportez le fichier OCT au format logiciel (Imaris, voir Table des matériaux).
   1. Ouvrez le fichier OPO dans le kit de développement logiciel. Cliquez sur Exporter, définissez le type de fichier sur .jpg et exportez les images dans un dossier vide.
   2. Ouvrez le logiciel de traitement d’image (FIJI, voir Table des matériaux) et importez la séquence d’images à partir du dossier où les fichiers JPEG exportés sont stockés. Utilisez un logiciel pour assembler la séquence d’images, puis enregistrez ce fichier en tant qu’image TIFF.
2. Créez une reconstruction de volume en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Ouvrez Imaris et accédez au fichier TIFF converti dans l’Arène. Accédez à Modifier > Propriétés de l’image et entrez la taille du voxel (en μm) de l’image de l’OPO dans les zones XYZ correspondantes. Ensuite, cliquez sur OK.
      REMARQUE: Dans l’arborescence de l’exemple d’objet sur le côté gauche de l’écran, désélectionnez l’onglet Volume pour éviter le décalage logiciel.
   2. Cliquez sur Ajouter de nouvelles surfaces au-dessus de l’arborescence des objets. Dans le menu sous l’arborescence, cliquez sur Ignorer la création automatique et modifiez manuellement. Dans la fenêtre Réglage de l’affichage , faites glisser manuellement les flèches rouge et noire pour améliorer le contraste entre l’échantillon et l’arrière-plan et améliorer la visualisation de l’échantillon.
   3. Ajustez la « position de la tranche » à la tranche à un bord de l’échantillon, c’est-à-dire à l’endroit où le signal d’échantillon apparaît pour la première fois. Utilisez la touche d’échappement pour changer la souris du mode Navigation au mode Sélectionner, puis cliquez sur Dessiner. Tracez manuellement le contour de la région affichant le signal.
   4. Avancez la position de la tranche en entrant la position suivante dans la zone de saisie. Cette position suivante doit être ≤ 100 tranches plus loin dans l’échantillon que la précédente. Tracez manuellement la région affichant le signal.
   5. Répétez l’étape 4.2.4 à travers l’épaisseur de l’échantillon jusqu’à ce que le bord opposé de l’échantillon soit atteint. Ensuite, cliquez sur Créer une surface dans le menu de gauche pour assembler ces tranches et terminer la reconstruction du volume.
   6. Cliquez sur Modifier, puis sur Sélection du masque. Cela crée une nouvelle couche dans la fenêtre Réglage de l’affichage contenant uniquement l’échantillon isolé. Les caractéristiques morphologiques de l’échantillon se trouvent maintenant dans l’onglet Statistiques > détaillé .
      REMARQUE : Cette approche a été suivie pour déterminer les sphéricités et les volumes déclarés dans le cadre de la présente étude.
3. Obtenez la densité cellulaire totale d’un échantillon en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Au-dessus de l’arborescence des objets, sélectionnez Ajouter de nouveaux repères. Dans le menu Paramètres de l’algorithme , désélectionnez toutes les cases. Cliquez sur la flèche bleue pour accéder à l’écran Canal source.
      1. Dans le menu déroulant qui s’affiche, sélectionnez le canal masqué créé à l’étape 5.2.8, généralement nommé Canal 2. Entrez le diamètre moyen de la cellule pour l’échantillon dans la zone Diamètre XY. Assurez-vous que la soustraction en arrière-plan est cochée.
         REMARQUE: Pour ce travail avec les cellules AU565 et MDA-MB-231, le diamètre a été réglé à 10 μm. Cette sélection est basée sur la taille de la cellule (expliquée dans la section Discussion).
   2. Cliquez sur la flèche bleue pour passer à l’écran Classer les taches . Dans le graphique en bas du menu, cliquez et faites glisser le bord gauche du seuil jaune vers le bord gauche du graphique, de sorte que tous les objets soient inclus dans le seuil ombré jaune. Ensuite, cliquez sur le Green Arrow pour terminer la création du spot.
   3. Obtenez le nombre d’objets identifiés (c.-à-d. le nombre de cellules d’échantillon) en cliquant sur Statistiques > > nombre total de points.
   4. Pour déterminer la densité cellulaire agrégée moyenne, divisez le nombre de cellules de l’agrégat (mesuré à l’étape 4.3.3) par le volume agrégé (déterminé à l’étape 4.2.6).
4. Évaluer la densité régionale dans les couches concentriques d’agrégats sphériques (Graphique 1A).
   1. Après une analyse morphologique et de densité cellulaire, évaluez la densité régionale. Cliquez sur la surface créée à l’étape 4.2.5 et accédez à l’onglet Style/Qualité des surfaces . Remplacez la sélection par Point central et modifiez la largeur des pixels sur ≤20 pour une meilleure visibilité. Accédez à Statistiques > Position détaillée de la > et enregistrez l’emplacement de l’emplacement du point central.
   2. Sélectionnez Ajouter un nouveau cadre de référence dans le menu situé au-dessus de l’arborescence des objets. Cochez les cases Visible et Fix à côté de XY dans le menu. Cliquez et faites glisser le centre de l’icône du cadre de référence de manière à ce qu’il soit aligné avec le point central. Désélectionnez les zones XY Visible et Fix et sélectionnez-les pour XZ.
      1. Encore une fois, cliquez et faites glisser le centre de l’icône du cadre de référence de sorte qu’il soit aligné avec le point central. Enfin, répétez cette opération pour le plan YZ, en alternant entre ces trois plans fixes jusqu’à ce que le repère de référence s’aligne parfaitement avec le point central. Double-cliquez sur le cadre de référence dans l’arborescence des objets et renommez-le Centre ou Similaire.
   3. Cliquez sur les emplacements créés à l’étape 4.3 et accédez à Statistiques > Cadre de référence de position > détaillée. Cliquez sur Position X Reference Frame jusqu’à ce qu’il trie la valeur la plus élevée à la valeur la plus basse. Enregistrez la valeur la plus élevée - cela indique le bord le plus éloigné de l’échantillon, c’est-à-dire le rayon de l’échantillon.
      REMARQUE: Étant donné que les échantillons utilisés ici sont circulaires dans le plan XY, les calculs peuvent être effectués le long de l’axe X ou Y avec des résultats similaires. Pour les échantillons qui ne présentent pas de symétrie X-Y (géométrie asymétrique, ellipsoïde, irrégulière, etc.), il est recommandé d’effectuer ces analyses le long de plusieurs axes.
   4. Accédez à Statistiques. Dans le coin inférieur droit du menu, cliquez sur Exporter toutes les statistiques dans un fichier et enregistrez les données dans une feuille de calcul.
   5. Effectuez des calculs manuels pour identifier les couches concentriques le long de l’axe des X.
      REMARQUE : Les échantillons utilisés dans cette étude avaient un diamètre d’environ 500 μm; ainsi, il existe deux zones concentriques extérieures de 200 μm d’épaisseur et une zone centrale interne de 100 μm d’épaisseur. Il est recommandé de maintenir des zones de 200 μm d’épaisseur car les comportements de diffusion devraient changer sur cette distance 7,28,29,30. Conformément à ce raisonnement, il est également recommandé d’utiliser des zones plus concentriques pour les échantillons plus grands et vice versa pour les échantillons plus petits.
   6. Définissez une région de couche externe de 200 μm en soustrayant 200 μm du rayon extérieur trouvé à l’étape 4.4.3. Ainsi, la région extérieure englobera des taches avec des positions X entre le_rayon X et le_{bord extérieur X} intérieur (Figure 1A, région orange).
   7. Définissez une région de transition en soustrayant 200 μm de X_{bord extérieur, intérieur}. La région de transition englobera des taches avec des positions X entre X_{à l’extérieur, à l’intérieur}, et X_{à l’intérieur de la transition} (Figure 1A, région rose).
   8. Définissez une région centrale du noyau englobant les points restants entre le centre de l’échantillon et X_{transitionnel, bord intérieur} (Figure 1A, région bleue).
   9. Ouvrez le fichier de feuille de calcul enregistré créé à l’étape 4.4.4. Accédez à l’onglet Distance par rapport au cadre de référence d’origine.
   10. Calculez le nombre de points dans la région centrale à l’aide de la fonction ' COUNTIF (Colonne_x, « < X_{transitionnelle, bord intérieur} »), où colonne_x est la colonne 'Distance du cadre de référence d’origine'. La valeur résultante est le numéro de cellule dans cette région. Divisez cette valeur par le volume de la région pour obtenir la densité cellulaire.
   11. De la même manière, calculez le nombre de cellules dans la région de transition en utilisant 'COUNTIF (Colonne_x, « < X_{outer,inner-edge} ») - COUNTIF(Column_x, « > X_{transitional,inner-edge} »).
   12. Calculez le nombre de cellules dans la région externe à l’aide de 'COUNTIF (Colonne_x,"> X_{transition,inner-edge} »).
5. Évaluer la densité cellulaire régionale dans les échantillons non sphériques au moyen de « fiches régionales » (figure 1B).
   REMARQUE: Pour les échantillons non sphériques qui n’ont pas de couches concentriques, la méthode « Regional Plug » est développée pour échantillonner la densité cellulaire locale à différentes profondeurs radiales dans l’ensemble.
   1. Répétez les étapes 4.4.1 à 4.4.3 pour définir le repère de référence central (Figure 1B, cercle jaune central) et obtenir le rayon total de l’échantillon.
   2. Effectuer des calculs manuels pour identifier l’emplacement des cadres de référence dans les régions transitionnelles et extérieures de manière à ce que la densité cellulaire puisse être évaluée dans l’échantillon à ces endroits.
      1. Pour calculer l’emplacement extérieur, soustrayez 50 μm de la valeur du rayon de l’échantillon de l’étape 4.5.1 et utilisez cette valeur comme position X.
         REMARQUE : Utilisez les mêmes valeurs de position Y et Z enregistrées à l’étape 4.5.1 pour toutes les fiches d’un échantillon donné afin de mesurer la densité des cellules le long de l’axe X de l’échantillon (Figure 1B, cercle jaune le plus à gauche).
      2. Au-dessus de l’arborescence des objets, cliquez sur Ajouter de nouveaux spots et cliquez sur Ignorer la création automatique, Modifier manuellement. Avec le pointeur en mode 'sélectionner', maintenez la touche Maj + clic enfoncée pour placer une place sur l’écran. Dans le menu de gauche, entrez les valeurs de position XYZ calculées ci-dessus. Ajustez les diamètres XY et Z à ≤20 pour une meilleure visibilité.
      3. Répétez l’étape 4.4.2 pour ajouter un cadre de référence à cet emplacement. Renommez ce cadre de référence dans l’arborescence d’objets externe ou similaire.
      4. Pour calculer l’emplacement de transition (point médian), recherchez la moyenne de la valeur de la position_centrale X et des valeurs_{de position extérieure} X. Utilisez cette valeur comme position X pour le cadre de référence transitoire. Comme ci-dessus, utilisez les mêmes valeurs Y et Z enregistrées à l’étape 4.5.1 pour tous les bouchons d’un échantillon donné afin de mesurer la densité cellulaire le long de l’axe X de l’échantillon (Figure 1B, cercle jaune du milieu).
      5. Répétez l’étape 4.4.2 pour placer le cadre de référence central à cet emplacement, en le renommant « transitoire » ou similaire une fois créé.
   3. Cliquez sur les spots créés à l’étape 4.3 et accédez à Statistiques. Dans le coin inférieur droit du menu, cliquez sur Exporter toutes les statistiques dans un fichier et enregistrez les données dans une feuille de calcul.
   4. Ouvrez la feuille de calcul. Accédez à l’onglet Distance par rapport au cadre de référence d’origine. La distance de chaque objet aux cadres de référence est indiquée dans la colonne A, et le regroupement des cadres de référence pour chaque objet est indiqué dans la colonne G. Utilisez la fonction 'MOD' pour attribuer numériquement chaque distance à son cadre de référence correspondant, où 0 est le cadre central, 1 est le cadre transitoire et 2 est l’extérieur.
   5. Filtrez les valeurs de cette colonne pour utiliser les distances de chaque cadre de référence. Pour chacun des cadres de référence, calculez le nombre d’objets à moins de 50 micromètres du cadre à l’aide de la fonction 'COUNTIF (Colonne_x, « ≤50 »), où la colonne_x est la colonne 'Distance du cadre de référence d’origine' pour chaque groupe. La valeur résultante correspond au nombre de cellules de cette fiche régionale. Divisez cette valeur par le volume du bouchon de 100 μm pour obtenir la densité cellulaire.
6. Exécutez la méthode De prise régionale affinée spatialement (Figure 1C).
   REMARQUE : Cette approche a été utilisée pour évaluer la viabilité des cellules régionales en réponse à l’application d’un médicament. L’inclusion de plus de cadres de référence améliore la résolution des densités de cellules pouvant être calculées tout au long de l’épaisseur du modèle.
   1. Répétez les étapes 4.4.1 à 4.4.3 pour définir le repère de référence central (Figure 1C, cercle jaune central) et obtenir le rayon de l’échantillon.
   2. Effectuez des calculs manuels pour déterminer d’autres lieux d’intérêt. Pour ce faire, ajoutez 100 μm à la valeur_{du centre} X, puis utilisez les valeurs Y et Z du point central pour définir le premier emplacement le long de l’axe central. Ajoutez un cadre de référence à cette position comme à l’étape 4.4.2 (Figure 1C, cercle jaune adjacent au cercle central).
      REMARQUE: Ajoutez moins de μm à cette étape si vous recherchez un suivi de densité de résolution plus élevée.
   3. Répétez les étapes 4.6.2, en ajoutant 100 μm (ou le nombre souhaité de μm) à chaque emplacement X séquentiel pour établir un axe de bouchons également espacés à travers l’épaisseur de l’échantillon. Placez le dernier repère de référence à ≤50 μm du rayon extérieur de l’échantillon (Figure 1C, cercles jaunes).
   4. Répétez les étapes 4.5.3 à 4.5.5 pour obtenir le nombre de cellules dans chaque bouchon de 100 μm de diamètre. Divisez ces valeurs par le volume de chaque fiche correspondante pour obtenir une densité cellulaire locale.
   5. Répétez toutes les étapes de cette section pour obtenir les données de l’OPO recueillies à chaque moment de l’essai du médicament. La comparaison du nombre de cellules à chaque endroit au cours du traitement devrait révéler où la densité cellulaire diminue (c.-à-d. les régions connaissant la mort cellulaire) et, par conséquent, à quelle profondeur le médicament pénètre (c.-à-d. quelles couches voient une baisse de la densité cellulaire par rapport à celles qui maintiennent ou affichent une augmentation des niveaux de densité cellulaire).

Figure 1: Illustration schématique. (A) L’approche de la couche concentrique (coquilles) pour évaluer la densité cellulaire régionale dans les agrégats sphériques. (B) La méthode du bouchon régional a été mise au point pour évaluer la densité cellulaire locale dans les agrégats non sphériques, où de petits bouchons sphériques (100 μm de diamètre) (en jaune) sont utilisés comme indicateurs de densité à chaque zone/épaisseur. C) La méthode du bouchon régional affinée dans l’espace est utilisée pour les études de pénétration des médicaments. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Dans une publication antérieure, une méthode a été établie pour la mesure non destructive de la densité cellulaire globale dans les agrégats cellulaires à l’aide de l’OCT¹⁰. Ici, cette technique est étendue pour évaluer la densité cellulaire régionale des agrégats cellulaires en développement. La figure 1 montre un schéma de cette extension, où la densité cellulaire peut être évaluée en couches concentriques d’un sphéroïde ou plus localement en regardant plutôt de pet...

Discussion

Importance
Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) sont de puissants modèles in vitro 3D pour l’étude de la progression tumorale et le dépistage des médicaments ^1,2,3. L’avancement de l’utilité de ces modèles agrégés relativement simples repose fortement sur la caractérisation de leurs caractéristiques clés, telles que la morphologie et la densité cellulaire, qui sont connues pour influencer ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques à 96 puits	Greiner Bio-One  ;	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0,25 % de trypsine, 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 cellules de cancer du sein	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Corning	10-013-CV
Sérum de veau fœtal	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Téléchargé à partir de https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 cellules cancéreuses du sein	Microscope ATCC
	Zeiss	Z1 AxioVision
Pénicilline streptomycine	Corning	30-0002CI
Centrifugeuse à plaques	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Domaine spectral Tomographie par cohérence optique	ThorLabs	TEL220C1
flacons de culture cellulaire T75	Greiner Bio-One  ;
Trastuzumab			Des échantillons cliniques résiduels de Trastuzumab ont été utilisés dans cette étude, généreusement offerts par l’Albany Medical College Pharmacy.