Article de méthode

Acquisition et perfusion-décellularisation de lambeaux vascularisés porcins dans un bioréacteur de perfusion personnalisé

DOI :

10.3791/64068

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1 août 2022

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1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, University of Toronto, 4Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

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Le protocole décrit l’obtention chirurgicale et la décellularisation ultérieure des lambeaux porcins vascularisés par perfusion du détergent au dodécylsulfate de sodium à travers le système vasculaire du lambeau dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.

Résumé

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Les défauts des tissus mous de grand volume entraînent des déficits fonctionnels et peuvent avoir un impact considérable sur la qualité de vie du patient. Bien que la reconstruction chirurgicale puisse être réalisée par transfert de lambeau libre autologue ou allotransplantation composite vascularisée (AVC), de telles méthodes présentent également des inconvénients. Des problèmes tels que la morbidité sur le site donneur et la disponibilité des tissus limitent le transfert de lambeau libre autologue, tandis que l’immunosuppression est une limitation importante de l’ACV. Les tissus modifiés en chirurgie reconstructive utilisant des méthodes de décellularisation / recellularisation représentent une solution possible. Les tissus décellularisés sont générés à l’aide de méthodes qui éliminent le matériel cellulaire natif tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Ces échafaudages acellulaires peuvent ensuite être recellularisés avec des cellules spécifiques au receveur.

Ce protocole détaille les méthodes d’approvisionnement et de décellularisation utilisées pour réaliser des échafaudages acellulaires dans un modèle porcin. En outre, il fournit également une description de la conception et de la configuration du bioréacteur de perfusion. Les lambeaux comprennent l’épiploon porcin, le fascia lata tenseur et l’avant-bras radial. La décellularisation est réalisée par perfusion ex vivo de détergent à faible concentration de dodécylsulfate de sodium (SDS), suivie d’un traitement enzymatique par la DNase et d’une stérilisation à l’acide peracétique dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.

Une décellularisation tissulaire réussie se caractérise par un aspect blanc-opaque des lambeaux macroscopiquement. Les lambeaux acellulaires montrent l’absence de noyaux sur la coloration histologique et une réduction significative de la teneur en ADN. Ce protocole peut être utilisé efficacement pour générer des échafaudages de tissus mous décellularisés avec une ECM préservée et une microarchitecture vasculaire. De tels échafaudages peuvent être utilisés dans des études de recellularisation ultérieures et ont le potentiel d’une traduction clinique en chirurgie reconstructive.

Introduction

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Les lésions traumatiques et l’ablation de la tumeur peuvent entraîner des défauts des tissus mous importants et complexes. Ces défauts peuvent nuire à la qualité de vie du patient, entraîner une perte de fonction et entraîner une invalidité permanente. Bien que des techniques telles que le transfert de lambeau de tissu autologue aient été couramment pratiquées, les problèmes liés à la disponibilité du lambeau et à la morbidité au site donneur sont des limites majeures 1,2,3. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une alternative prometteuse qui transfère les t....

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Protocole

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Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (CCIA) du Réseau universitaire de santé et sont effectuées conformément au protocole et aux procédures du Centre de ressources animales du Réseau universitaire de santé et aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Cinq porcs Yorkshire (35-50 kg; âgés d’environ 12 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences.

1. Fabrication de bioréacteurs de perfusion

  1. Voir la figure 1 pour tous les composants utilisés dans le bioréacteur de perfusion....

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Résultats

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Ce protocole de décellularisation des lambeaux porcins vascularisés repose sur la perfusion d’un détergent à base ionique, SDS, à travers le système vasculaire du volet dans un bioréacteur de perfusion personnalisé. Avant la décellularisation, trois lambeaux vascularisés dans un modèle porcin ont été achetés et canulés en fonction de leurs principaux vaisseaux d’alimentation. Les volets ont été immédiatement rincés après l’approvisionnement afin de maintenir un système vasculaire perfusable breveté pour permettre une déc.......

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Discussion

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Le protocole proposé utilise la perfusion de SDS à faible concentration pour décellulariser une gamme de lambeaux d’origine porcine. Avec cette procédure, l’épiploon acellulaire, le fascia lata tenseur et les lambeaux radiaux de l’avant-bras peuvent être décellularisés avec succès en utilisant un protocole qui favorise les SDS à faible concentration. Des expériences d’optimisation préliminaires ont déterminé que la SDS à une faible concentration (0,05%) entre 2 jours et 5 jours est capable d’éliminer le matériel cellulai.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 et micro ; m pore Acrodisk FilterVWRCA28143-310
0,9 % solution de chlorure de sodium (solution saline normale)BaxterJF7123
20 L Polypropylène CarboyCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Sofsilk Attache chirurgicale non résorbableCovidien  ; LS639
Robinet d’arrêt 3 voiesCole-ParmerUZ-30600-04
Pince AdsonFine Science Tools11027-12
Solution antibiotique-antimycosique, 100XWisent450-115-EL
Sulfate d’atropine 15 mg/30mlRafter 8 Produits238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath VWR de calibre 22BD381123
BD Angiocath VWR de calibre 24BD381112
chlorure de calciumSigma-AldrichC4901Cofacteur de l’ADN DNase
I du pancréas bovin Dosage deSigma-AldrichDN25
(kit de dosage de l’ADNdb Quant-iT PicoGreen)InvitrogenP7589
DPBS, 10XWisent311-415-CL  ; sans Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Héparine, 1000 UI/mlLeo Pharma A/S453811
Chlorhydrate de kétamine  ; 5000 mg/50 mlBimeda-MTC Santé animale Inc.
Ismatec Pump Tygon Tube à 3 arrêtsCole-ParmerRK-96450-40Diamètre intérieur : 1,85 mm
Ismatec REGLO Pompe à 4 canauxCole-Parmer78001-78
Cassettes de tubes IsmatecCole-ParmerRK-78016-98
Isoflurane 99,9 %, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Essai de stérilité sur plaques gélosées
Sulfate de magnésiumSigma-AldrichM7506Cofacteur de l’ADN
Masterflex L/S 16 TubeCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 mlPartenaires pharmaceutiques du Canada Inc.
Crayon Cautérisé MonopolaireValleylabE2100
Formol Tamponné Normal, 10 %Sigma-AldrichHT501128
N° ; 11 lame de scalpelSwann Morton303
Papaïne en latex de papayeSigma-AldrichP3125
Acide peracétiqueSigma-Aldrich269336
Connecteur cannelé en plastique pour tube de 1/4 » à 1/8 » IDMcMaster-Carr5117K61
Tube cannelé en plastique 90° ; Connecteurs coudésMcMaster-Carr5117K76
Bouchons de tube en plastique à rotation rapideMcMaster-Carr51525K143de tube en plastique Luer mâle
McMaster-Carr51525K293Outil de
biopsieIntegra Miltex3332
Chlorure de potassium 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Povidone iodée, 10 %Rougier833133
Pipette sérologique, 2 mlFisher Science13-678-27D
Couvercle à pression Contenants hermétiquesSnapLock142-3941-4
Poudre de dodécylsulfate de sodiumSigma-AldrichL4509
Pinces de ligature chirurgicale en métal, petitTeleflex001200
Ciseaux de ténotomie Stevens, 115 mm, droitsB. BraunBC004R
Kit de surveillance de la pression TruWaveEdwards LifesciencesPX260
l’ADN 61231622319292242905 Douilles Luer Punch femelle

Références

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  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M.

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Mots-clés

Tissue EngineeringDecellularized ScaffoldsExtracellular MatrixSoft Tissue ReconstructionOmental FlapSodium Dodecyl SulfateRecellularization Methods

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