Protocole de sauvetage d’embryons pour l’hybridation interspécifique en courge

Cucurbita (2n = 40) est un genre très diversifié de la famille des Cucurbitaceae qui contient 27 espèces différentes, dont cinq sont domestiquées¹. Parmi ceux-ci, Cucurbita moschata, C. pepo et C. maxima sont les plus importants économiquement au monde. Aux États-Unis, C. moschata et C. pepo sont les deux espèces les plus importantes dans la production agricole. C. pepo se compose de quatre sous-espèces (ovifera, pepo, fraternel et gumala) qui contiennent des groupes de cultivars de courges d’été et d’hiver : crookneck, straightneck, gland, pétoncle, cocozelle, moelle végétale, courgette et citrouille 2,3,4,5. C. moschata se compose principalement de types de marchés de courges d’hiver, y compris le noyer cendré, le Dickinson et le groupe de fromages¹. Les deux espèces sont morphologiquement et phénotypiquement diverses, avec C. pepo considéré pour son rendement, sa précocité, son habitude de croissance dans les buissons et divers traits de fruits, y compris la forme du fruit, la taille du fruit, la couleur de la chair et le motif de l’écorce. D’autre part, C. moschata est prisé pour son adaptation à la chaleur et à l’humidité, ainsi que pour sa résistance aux maladies et aux ravageurs ^6,7. L’hybridation interspécifique entre C. moschata et C. pepo est non seulement une stratégie importante pour l’introgression des caractéristiques souhaitables entre les deux espèces, mais permet également l’élargissement de la base génétique dans les programmes de sélection ^7,8.

Les premiers croisements entre C. moschata et C. pepo ont été effectués pour déterminer leur compatibilité et/ou leurs barrières taxonomiques 9,10,11, tandis que les études ultérieures se sont principalement concentrées sur le transfert des caractères souhaitables^12,13,14. L’hybridation interspécifique entre les deux espèces a ciblé le transfert de caractères nouveaux tels qu’un mode de croissance buisson ou semi-arbuste et un rendement amélioré de C. pepo ainsi qu’une résistance aux maladies, une adaptabilité au stress abiotique et une vigueur accrue de C. moschata^14,15,16. Par exemple, des croisements spécifiques entre C. pepo (P₅) et C. moschata (MO₃) ont entraîné un rendement en fruits plus élevé 13, tandis que les accessions de C. moschata (Nigerian Local et Menina) ont été largement utilisées comme principale source de résistance aux potyvirus dans les cultivars cultivés de C. pepo ^17,18.

Des études antérieures ont montré que l’hybridation entre C. moschata et C. pepo est possible mais difficile ^8,15. Les croisements interspécifiques pourraient aboutir à l’absence de nouaison (avortement), à des fruits parthénocarpiques dépourvus de graines viables (graines vides), à des fruits sans pépins où les embryons immatures ne se développent pas (sténospermocarpie) ou à des fruits avec peu d’embryons immatures qui peuvent être sauvés en plantes matures par le sauvetage d’embryons^15,16. Par exemple, aucune graine viable n’a été obtenue en croisant C. pepo (reine de table, maternelle) avec C. moschata (gros fromage, paternel), mais le croisement réciproque a donné 57 graines viables issues de 134 pollinisations⁹. Hayase n’a obtenu des graines viables à partir de croisements de C. moschata et de C. pepo que lorsque des croisements ont été effectués à 04h00 du matin en utilisant du pollen stocké à 10 ° C pendant la nuit¹⁹. Baggett a croisé huit variétés différentes de C. moschata avec C. pepo (delicata) et a rapporté que sur 103 pollinisations totales, 83 fruits semblaient normaux avaient été obtenus, mais aucun d’entre eux ne contenait de graines viables⁸. Dans un croisement entre C. pepo (S179) et C. moschata (NK), Zhang et al. ont obtenu 15 fruits avec 2 994 graines, mais seulement 12 de ces graines étaient viables tandis que les autres ne présentaient qu’un développement rudimentaire. Ces études suggèrent que même si le croisement interspécifique entre C. moschata et C. pepo est très bénéfique, l’obtention de fruits avec des graines viables à partir des croisements est exigeante¹⁶.

Le sauvetage d’embryons a été suggéré comme une méthode appropriée pour surmonter les problèmes découlant d’embryons avortés précocement ou mal développés et est l’une des techniques de culture in vitro les plus anciennes et les plus efficaces pour la régénération d’embryons immatures^16,20. Le sauvetage embryonnaire implique la culture in vitro d’embryons sous-développés/immatures, suivie d’un transfert dans un milieu nutritif stérile pour faciliter la récupération des plantules et, finalement, des plantes matures²¹. Bien que le sauvetage d’embryons soit couramment utilisé dans l’élevage de courges, il n’existe pas de description détaillée de la méthodologie appropriée qui permettrait son application courante. L’utilisation d’une technique de sauvetage d’embryons pour surmonter les obstacles à l’hybridation interspécifique chez les espèces de Cucurbita a été signalée dès 1954²². Cependant, le succès du sauvetage d’embryons dans les premières études n’a pas été rapporté ou était très faible. Metwally et al. ont rapporté un taux de réussite de 10% (régénération en plantes matures) parmi 100 embryons hybrides interspécifiques sauvés d’un croisement entre C. pepo et C. martinezii²³. Sisko et al. ont rapporté un taux de réussite variable de la régénération embryonnaire parmi les embryons obtenus à partir de différentes combinaisons croisées : le taux de régénération des hybrides obtenus en croisant C. maxima (Bos. Max) et C. pepo (ruée vers l’or) était de 15,5 %, pour C. pepo (courgette) et C. moschata (Hokaido) était de 20 %, tandis que pour C. pepo (ruée vers l’or) et C. moschata (Dolga), il était de 37,5 %²⁴. Outre le génotype, les milieux et les conditions de culture in vitro sont des facteurs importants pour le succès de la technique^25,26. Dans la présente étude, diverses combinaisons croisées entre C. moschata et C. pepo ont été testées, et une méthodologie simple pour utiliser la technique de sauvetage d’embryons dans les courges a été développée. La mise au point d’une technique simple et facilement reproductible de sauvetage d’embryons facilitera l’hybridation interspécifique et l’amélioration du germoplasme dans les programmes de sélection des courges.

1. Plantation et pollinisation

REMARQUE : Il est important d’identifier les génotypes compatibles dont l’hybridation aboutirait à la nouaison et à la production d’embryons viables.

1. Conditions de plantation et entretien
   1. Obtenir des semences de génotypes de courges (cultivars/accessions) pour l’hybridation (tableau 1).
   2. Remplir 50 cellules plates de départ (25 cm de largeur x 50 cm de longueur) avec du terreau amendé avec de l’engrais NPK complet contenant 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P et 1,38 g/kg K.
   3. Semez les graines à une profondeur égale à leur longueur et recouvrez-les d’un terreau. Arrosez les appartements sans créer d’eau stagnante. Ensuite, gardez le média humide en l’arrosant à la main une fois par jour.
   4. Au deuxième stade de la vraie feuille, transplanter les plantules dans des pots de 25 cm à 30 cm de diamètre amendés avec un engrais NPK complet à 3 cuillères à soupe / pot. Fertilisez les plantes une fois par semaine avec 500 mL/pot d’engrais liquide contenant du NPK 20:20:20 ajouté à une concentration de 1 g par gallon d’eau.
   5. Maintenez les plantes dans la serre à des températures comprises entre 22 et 28 °C sous régime de lumière naturelle. Pour les génotypes de vinage, prévoir un treillis de soutien dans la serre (Figure 1).
2. Effectuer des pollinisations
   1. Habituellement, la floraison des courges commence 6 à 8 semaines après le semis, selon le cultivar (figure 2A,B). Commencez à faire une hybridation contrôlée (croisements) dès que les plantes commencent à fleurir. Dans des conditions de serre, la pollinisation peut se faire toute l’année.
   2. Identifier les fleurs mâles et femelles des cultivars de C. pepo et de C. moschata qui seront prêtes pour la pollinisation le lendemain. Pour identifier ces fleurs, vérifiez les fleurs dont les pétales ont une teinte jaune mais ne sont pas ouverts. Collez délicatement les fleurs fermées au sommet à l’aide de ruban de masquage pour empêcher la pollinisation accidentelle par les insectes (figure 2C,D).
   3. Le matin du lendemain, les fleurs sont prêtes à polliniser. Effectuer la pollinisation avant 10h00 pour améliorer le taux de réussite de l’hybridation²⁷.
   4. Ouvrez les fleurs femelles et mâles en retirant doucement la partie supérieure collée des pétales. Retirer les pétales de la fleur mâle et transférer le pollen en frottant doucement l’anthère sur le stigmate de la fleur femelle (Figure 3A).
   5. Après la pollinisation, fermez immédiatement la fleur femelle pollinisée avec du ruban de masquage. Utilisez une étiquette pour noter la date de pollinisation et pour indiquer les parents paternels et maternels utilisés dans le croisement (Figure 3B).
   6. Un croisement réussi est indiqué par un ovaire élargi qui forme rapidement un petit fruit en 1 semaine (Figure 4A). La plante est alors prête pour la récolte 45 à 55 jours après la pollinisation²⁸ (figure 4B).

2. Technique de sauvetage d’embryons

1. Préparation des médias
   1. Préparer des stocks d’antibiotiques : Pour le céfotaxime (sel de sodium), dissoudre l’antibiotique dans 4 mL d’eau désionisée ou distillée, filtrer à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 μm et fabriquer des aliquotes de 0,5 mL. Conserver à -20 °C. La solution mère résultante aura une concentration de 250 mg/mL.
   2. Pour l’ampicilline (sel de sodium), dissoudre la poudre dans 10 mL d’eau, filtrer à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 μm et l’aliquote dans un stock de 1 mL à une concentration finale de 100 mg/mL. Conserver à -20 °C.
   3. Faire du milieu Murashige et Skoog (MS) en dissolvant 2,45 g de milieu (concentration de 4,91 g/L) dans 500 mL d’eau distillée dans une bouteille de 1 L. Ajouter 1,5 g de gomme gellane et autoclaver à 121 °C pendant 20 min. La gomme gellane se dissout complètement pendant l’autoclavage.
   4. Après autoclavage, refroidir le milieu en plaçant la bouteille au bain-marie à 50 °C. Retirez les stocks d’antibiotiques du congélateur et décongelez-les dans l’armoire à flux laminaire.
   5. Transférer le flacon moyen sur la hotte à flux laminaire. Ajouter 0,6 mL de solution mère de céfotaxime (250 mg/mL) et 0,25 mL de bouillon d’ampicilline (100 mg/mL) dans le flacon moyen et bien mélanger. Verser environ 7 mL du milieu dans une boîte de Petri stérile (60 mm x 15 mm).
   6. Laisser le milieu se solidifier dans les boîtes de Petri pendant environ 15-20 min. Fermez les boîtes de Petri avec une pellicule de scellement et placez-les dans une boîte de rangement. Conserver à température ambiante.
2. Sauvetage d’embryons
   1. Avant de commencer, nettoyez et stérilisez l’armoire à flux d’air laminaire avec de l’alcool éthylique à 70%.
   2. Récolter les fruits de la courge en les cassant ou en les coupant de la vigne principale et désinfecter la surface des fruits en les lavant avec un détergent liquide (p. ex. 0,3 % de chloroxylénol) dans l’évier de laboratoire jusqu’à ce que toute la saleté meuble soit enlevée (figure 5A).
   3. Rincer abondamment à l’eau du robinet. Sécher les fruits avec des serviettes en papier propres. Déplacez les fruits vers l’armoire à flux d’air laminaire (Figure 5B).
   4. Stériliser le fruit en surface en pulvérisant de l’éthanol à 70% sur le fruit dans l’armoire laminaire stérile à flux d’air. Couper le fruit en deux avec un couteau stérile (figure 5C) et extraire les graines.
   5. Utilisez des pinces stériles pour ouvrir de manière aseptique le tégument et exposer les embryons immatures (figure 6). Placer délicatement les embryons immatures dans une boîte de Pétri contenant un milieu de SEP additionné de céfotaxime et d’ampicilline (figure 7A). Fermez la boîte de Petri et scellez avec un film d’emballage.
      NOTE: Selon la taille de l’embryon, il est possible de faire tenir cinq ou six embryons dans une boîte de Pétri.
   6. Placer les boîtes de Petri scellées avec des embryons dans une chambre de croissance sous 16 h photopériode à 25 °C et 70% d’humidité relative. En cas de contamination, sous-cultiver rapidement les embryons non contaminés dans une nouvelle plaque avec le même milieu.
   7. Les cotylédons commenceront à se développer après 4 jours et verdiront en 10 jours (Figure 7B). À ce stade, si nécessaire, effectuez la sous-culture dans de nouvelles plaques contenant le même milieu pour permettre l’expansion tissulaire. Les racines commenceront à apparaître à 14 jours (figure 7C), et à 21 jours, les plantules auront des racines et des cotylédons étendus (figure 7D).
      NOTE: Le milieu de culture utilisé dans le protocole est approprié pour la différenciation en pousses et racines sans régulateurs de croissance supplémentaires.
   8. À ce stade, retirez les plantules de la boîte de Petri et lavez doucement le média des racines avec de l’eau du robinet (figure 8). Placer les plantules dans un récipient en plastique (14 cm x 9 cm x 4 cm) et couvrir les racines avec des serviettes en papier humides (figure 9A). Couvrez le contenant et réhumidifiez les serviettes en papier au besoin.
   9. Conserver les récipients à température ambiante (25-28 °C) et avec une photopériode de 16 h. Cette étape permettra d’acclimater les plantules. Après une acclimatation de 7 à 10 jours dans le récipient, les plantules mesureront environ 3 à 4 pouces de long. Pendant cette période, réhumidifiez les serviettes en papier au besoin.
   10. Transférer les semis dans des plateaux de départ de 50 cellules (25 cm de largeur x 50 cm de longueur) modifiés avec de l’engrais comme décrit précédemment et les déplacer vers la serre (figure 9B). Ne pas trop arroser les semis pour éviter la pourriture; ajouter environ 10 à 20 mL par cellule au besoin.
   11. Du deuxième au troisième stade foliaire, transplanter les plantules dans des pots de 30 cm de diamètre remplis de terreau amendé avec de l’engrais comme décrit précédemment (figure 10A). Fournir un support en treillis pour les plants de vigne et effectuer une hybridation contrôlée lorsque les plants commencent à fleurir, comme décrit précédemment (figure 10B).
   12. Maintenez les plantes dans la serre à des températures comprises entre 22 et 28 °C sous régime de lumière naturelle. Évaluer les caractéristiques des plantes pour les fruits et les graines.

Viabilité de la nouaison et des graines
Un essai initial a été effectué pour déterminer la viabilité de la nouaison et des graines dans diverses combinaisons croisées. Au total, 15 génotypes de courges, quatre C. pepo et 11 C. moschata, ont été choisis (tableau 1). Sur les 24 combinaisons croisées interspécifiques tentées, une nouaison a été obtenue pour 22 (tableau 2), ce qui représente un succès global de >92 % dans la nouaison. Aucun fruit mûr n’a été obtenu en croisant O et M et E et J, tandis que le plus grand nombre de fruits (n = 6) a été obtenu en croisant F et J (tableau 2). Le nombre de fleurs pollinisées pour différentes combinaisons croisées variait de un à 11, et le taux de réussite de la pollinisation variait de 0% à 100%. Le nombre de fleurs pollinisées dans différentes combinaisons croisées variait en fonction du nombre de fleurissages et de la synchronisation de la floraison entre les fleurs mâles et femelles. Même si les fruits ont été obtenus à partir de tous les croisements sauf deux, l’évaluation des fruits après les avoir coupés a révélé que la plupart des fruits avaient des embryons avortés sans graines viables. Les fruits de la plupart des croisements semblaient normaux mais étaient dépourvus de graines ou constitués de graines avec des embryons rudimentaires. Au total, 44 fruits ont été produits à partir de toutes les combinaisons croisées, et un seul fruit, développé en croisant C et J, avait des embryons peu développés qui pouvaient être récupérés grâce à la technique de sauvetage d’embryons.

Sauvetage d’embryons et progrès ultérieurs
L’hybride interspécifique F1 développé en croisant C et J avait 44 graines au total, mais seulement 10 d’entre elles avaient des embryons qui pouvaient être sauvés pour l’avancement de la génération. Les graines restantes n’avaient pas d’embryons. Les 10 embryons ont été cultivés dans les milieux de sauvetage embryonnaires et vérifiés quotidiennement pour leur croissance et leur développement. La taille des 10 embryons immatures variait de 3,51 mm à 8,26 mm. Le taux de réussite du sauvetage embryonnaire était de 80%. Les hybrides interspécifiques F 1 (lignes de pont) développés en croisant C. moschata et C. pepo (C et J) contenaient les génomes des deux espèces dans un rapport de 1:1 (50% chacun). Ces plantes ont été utilisées comme lignes de pont pour l’introgression de caractères économiquement importants chez les deux espèces. Par exemple, le franchissement de ces lignes de pont avec C. moschata donnerait des hybrides avec 75% de C. moschata et 25% de C. pepo de fond génétique, respectivement. Les fruits obtenus à partir de ces lignes de pont avaient un mélange de graines non viables et de graines avec des embryons immatures qui ont ensuite nécessité une culture tissulaire pour la régénération. Par exemple, l’un des fruits avait un total de 54 graines, parmi lesquelles 14 graines avaient des embryons immatures qui ont été sauvés en utilisant le protocole décrit ici.

Figure 1 : Treillis de soutien pour les plants de courges à croissance verticale dans la serre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Illustration de fleurs ouvertes et collées. Ouvrir (A) les fleurs de courge mâle et (B) femelle dans la serre. (C) Une fleur mâle collée de Cucurbita moschata parent paternel. (D) Une fleur femelle collée de Cucurbita pepo parent maternel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Illustration de la pollinisation. (A) Transférer le pollen de la fleur mâle en frottant doucement l’anthère sur le stigmate de la fleur femelle. (B) Après la pollinisation, scotcher la fleur femelle et utiliser une étiquette pour enregistrer la date de pollinisation et les parents paternels et maternels utilisés dans la croix. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : nouaison. (A) Après la pollinisation, l’ovaire se développera rapidement, formant un petit fruit en 1 semaine. (B) Le fruit est prêt à être récolté 45 jours après la pollinisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Préparation de fruits. (A) Laver les fruits avec un détergent. Récoltez et désinfectez la surface du fruit en le lavant avec un détergent liquide dans l’évier de laboratoire. (B) Rincer et sécher les fruits. Séchez les fruits avec des serviettes en papier propres, après un rinçage abondant à l’eau du robinet, et déplacez-les dans l’armoire à flux d’air laminaire. (C) Couper le fruit en deux à l’aide d’un couteau stérile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Extraire l’embryon des graines. Utilisez des pinces stériles pour ouvrir de manière aseptique le tégument et exposer l’embryon immature. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Régénération embryonnaire dans les milieux de la SEP. (A) Placer soigneusement les embryons immatures dans une boîte de Pétri contenant un milieu SEP. (B) Les cotylédons se dilatent et deviennent verts dans les 10 jours. (C) Les racines commenceront à apparaître à 14 jours. (D) À 21 jours, les plantules auront des racines étendues et des cotylédons qui sont prêts à être transférés dans un récipient en plastique pour l’acclimatation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Lavez les racines. Retirez les plantules de la boîte de Petri et lavez doucement le média des racines avec de l’eau du robinet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Acclimater les plantules. (A) Placez les plantules dans un récipient en plastique et couvrez les racines avec une serviette en papier humide pendant 5 jours pour les acclimater. (B) Transférer les plantules dans des plateaux cellulaires contenant un terreau commercial amendé avec de l’engrais NPK complet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Transplanter les plantules dans des pots. (A) Au deuxième au troisième stade de la vraie feuille, transplanter les plantules dans des pots de 30 cm de diamètre remplis de terreau amendé avec de l’engrais. (B) Fournir un support en treillis pour les plants de vigne et procéder à une hybridation contrôlée lorsque les plants commencent à fleurir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Au total, 15 génotypes de courges, quatre de C. pepo et 11 de C. moschata, ont été utilisés dans l’étude pour les croisements interspécifiques.

Tableau 2 : Combinaisons croisées tentées avec les 15 génotypes de courges et la nouaison correspondante, le nombre de graines avortées, les embryons immatures et les sauvetages d’embryons réussis.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.