Les modèles de transplantation cardiaque de souris représentent des outils de recherche précieux pour étudier l’immunologie de la transplantation. Le présent protocole détaille la transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris qui implique la mise en place de brassards sur l’artère carotide commune du receveur et le tronc de l’artère pulmonaire du donneur pour permettre le flux sanguin laminaire.
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Article de méthode
Transplantation cardiaque cervicale hétérotopique de souris utilisant des brassards vasculaires
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les modèles murins de transplantation cardiaque sont fréquemment utilisés pour étudier les lésions d’ischémie-reperfusion, les réponses immunitaires innées et adaptatives après la transplantation, et l’impact des thérapies immunomodulatrices sur le rejet du greffon. La transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris a été décrite pour la première fois en 1991 à l’aide d’anastomoses suturées, puis modifiée pour inclure des techniques de brassard. Cette modification a permis d’améliorer les taux de réussite et, depuis lors, de nombreux rapports ont proposé d’autres améliorations techniques. Cependant, la traduction en utilisation plus répandue reste limitée en raison de la difficulté technique associée aux anastomoses du greffon, qui nécessite une précision pour atteindre une longueur et un calibre adéquats des brassards afin d’éviter une torsion anastomotique vasculaire ou une tension excessive, ce qui peut endommager le greffon. Le présent protocole décrit une technique modifiée pour effectuer une transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris qui implique la mise en place du brassard sur l’artère carotide commune du receveur et l’artère pulmonaire du donneur en alignement avec la direction du flux sanguin.
Introduction
Abbott et al. ont publié1 la première description de la transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez le rat en 1964. Ces techniques chirurgicales ont été affinées et simplifiées par Ono et al. en 19692. Corry et al. ont décrit pour la première fois une méthode de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez la souris en 1973; Semblable aux modèles de rats précédemment rapportés, cela impliquait une greffe dans l’abdomen de l’hôte avec revascularisation par anastomoses de bout en bout de l’artère pulmonaire du donneur et de l’aorte ascendante à la veine cave inférieure et à l’aorte abdominale du receveur, respectivement3. La transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez le rat a été décrite par Heron en 1971 à l’aide de brassards en téflon fabriqués à partir de cathéters intraveineux de 16 G (1,6 mm de diamètre extérieur)4. Chen5 et Matsuura et al.6 ont rapporté plus tard une transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris en 1991, dont les techniques différaient principalement par leur méthode de réanastomose. L’approche de Chen impliquait des anastomoses suturées de l’aorte ascendante du donneur à l’artère carotide du receveur et de l’artère pulmonaire du donneur à la veine jugulaire externe du receveur5. En raison des compétences techniques avancées requises pour ces anastomoses suturées microchirurgicales, une quantité importante de temps et d’expérience a été nécessaire pour atteindre un taux de réussite élevé. Matsuura et al. ont décrit une méthode utilisant une technique de brassard sans suture, similaire à celle utilisée par Heron, qui impliquait des anastomoses de bout en bout utilisant le placement extra-luminal des poignets. Il a fabriqué des brassards en téflon à partir de cathéters intraveineux de 22 G (0,8 mm de diamètre extérieur) et 24 G (0,67 mm de diamètre extérieur) et les a placés sur la veine jugulaire externe et l’artère carotide commune du receveur, respectivement6. Ces brassards ont ensuite été placés à l’intérieur de l’artère pulmonaire et de l’aorte du donneur et fixés en attachant une ligature de suture autour de la connexion. Cette approche s’est traduite par une amélioration du taux de réussite. Plus important encore, il en a résulté un raccourcissement du temps nécessaire pour compléter les deux anastomoses cervicales, réduisant ainsi le temps ischémique chaud de la greffe à moins d’un tiers de celui utilisé par la méthode de suture abdominale. De plus, comme les brassards sont placés autour de la surface externe du vaisseau, il n’y a pas de corps étranger exposé à la lumière du vaisseau, ce qui réduit considérablement la possibilité de thrombose après la chirurgie7. Pendant ce temps, l’utilisation de la technique du brassard fournit un soutien autour des vaisseaux sur le site de l’anastomose sans nécessiter de suture, ce qui réduit le risque de saignement après revascularisation6.
De nombreuses révisions de cette technique ont été proposées. Pour tenir compte de la courte longueur de l’artère carotide commune de la souris (environ 5 mm), Tomita et al.8 ont développé une modification de cette technique avec un brassard artériel plus petit (0,6 mm de diamètre extérieur) tout en omettant de tenir les sutures et de tirer l’artère directement à travers le brassard avec une pince fine. Wang et coll. ont simplifié cette approche en plaçant des brassards de 22 G et 24 G sur l’artère pulmonaire droite du donneur et sur l’artère carotide commune droite du receveur, respectivement9. Divers rapports ont décrit des modifications à ces approches, y compris l’utilisation de brassards spécialisés, de pinces microchirurgicales, de dilatateurs de vaisseaux et de cardioplégie10,11,12. Notamment, toutes ces méthodes impliquent la circulation rétrograde du sang à travers le cœur, le sang circulant de l’artère carotide commune du receveur vers l’aorte du donneur, les artères coronaires, le sinus coronaire, puis se vidant dans l’oreillette droite et sortant de l’artère pulmonaire dans la veine jugulaire externe du receveur.
Par rapport à la greffe dans l’abdomen, la transplantation cardiaque cervicale offre de multiples avantages. Comme mentionné précédemment, l’exposition cervicale permet une revascularisation plus rapide et des temps ischémiques chauds plus courts6. La méthode cervicale est également moins invasive et est associée à des temps de récupération postopératoire plus courts car elle évite une laparotomie6. Il est important de noter que des anastomoses de bout en bout avec des brassards peuvent être effectuées à la place des anastomoses de bout en bout, ce qui diminue le risque de complications telles que les saignements anastomotiques. L’approche abdominale présente également un risque accru de développer des complications thrombotiques dans l’aorte abdominale ou la veine cave inférieure, entraînant une ischémie de la moelle épinière et une paralysie des membres postérieurs. L’emplacement cervical superficiel de la greffe permet un accès facile à l’évaluation de la viabilité du greffon par palpation, électrocardiographie et imagerie invasive ou non invasive. Bien que les greffes cervicales reprennent une activité cardiaque spontanée après reperfusion, elles n’ont pas d’impact significatif sur les paramètres systoliques et diastoliques de la receveuse. Ce modèle fournit des informations précieuses pour étudier les réponses cellulaires après une transplantation, telles que les lésions d’ischémie-reperfusion et le rejet de greffe. De plus, ce modèle offre une approche idéale pour permettre l’imagerie post-transplantation, comme la microscopie intravitale à deux photons ou l’imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP). À cette fin, notre laboratoire a déjà mis au point des méthodes pour imager les tissus et les organes en mouvement chez la souris, y compris des cœurs murins battants et des greffes d’arc aortique après une transplantation cervicale hétérotopique pour visualiser le trafic des leucocytes au cours d’une lésion d’ischémie-reperfusion et dans des plaques d’athérosclérose, respectivement13,14,15 . De plus, en raison de son emplacement superficiel et de sa facilité d’exposition, ce modèle convient à la retransplantation cardiaque16.
Ce rapport décrit une technique qui permet un flux sanguin laminaire avec le placement externe des brassards vasculaires sur les vaisseaux d’où provient le flux sanguin. Cela permet une transition en douceur du flux sanguin d’un vaisseau à l’autre, évitant ainsi l’exposition du bord distal du vaisseau dans la lumière vasculaire. De plus, la technique utilise un brassard plus grand de 20 G, au lieu des brassards de 22 G utilisés auparavant, pour l’artère pulmonaire du donneur afin d’assurer un retour suffisant du flux sanguin vers le receveur.
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Protocole
Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été menées conformément aux directives des NIH sur les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le Comité des études animales de la faculté de médecine de l’Université de Washington. Des cœurs de souris C57BL/6 (B6) et BALB/c (pesant 20 à 25 g) ont été transplantés chez des receveurs B6 appariés (âgés de 6 à 8 semaines). Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). Des greffes syngéniques ont été effectuées pour évaluer les réponses cellulaires liées aux lésions d’ischémie-reperfusion, et des greffes allogéniques ont été effectuées pour étudier les mécanismes immunitaires impliqués dans la tolérance et le rejet du greffon. B6 lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) souris rapporteures17, obtenues à l’origine de Klaus Ley de La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, et élevées par la suite dans notre établissement, ont été utilisées comme récipients pour des expériences sélectionnées visant à visualiser l’infiltration de neutrophiles dans des greffes cardiaques. La chirurgie de survie a été réalisée en utilisant des procédures aseptiques.
1. Procédure de donneur
- Anesthésier les souris en injectant de la kétamine (80−100 mg/kg) et de la xylazine (8−10 mg/kg) (voir le tableau des matières) par voie intrapéritonéale à la souris donneuse. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie avec pincement des orteils et de la queue.
- Préparez la zone chirurgicale en rasant les cheveux de la poitrine et de l’abdomen à l’aide d’un rasoir électrique.
- Administrer 100 unités d’héparine (voir le tableau des matières) par voie intraveineuse dans la veine du pénis (hommes) ou la veine jugulaire externe (hommes ou femmes).
- Placez les souris en décubitus dorsal avec les membres antérieurs au-dessus de la tête. Fixez les membres antérieurs et postérieurs avec du ruban chirurgical et désinfectez la peau avec trois gommages alternés de 0,75% d’iode et d’éthanol à 70%.
- Effectuer une incision, laparosternotomie médiane, de l’ombilic à l’angle sternal (3-4 cm), suivie d’une thoracotomie bilatérale le long de chaque marge costale (2 cm bilatéralement). Pliez la paroi thoracique antérieure sur le cou pour une exposition complète du médiastin.
- Extrayez le thymus et exposez la veine cave inférieure intrathoracique.
- Transect sur toute la largeur de l’aorte abdominale pour l’exsanguination.
- Pour la perfusion rétrograde, injecter 1,5 mL de solution saline à 4 °C dans la veine cave inférieure intrathoracique avec l’aiguille orientée vers le greffon, comme décrit précédemment13.
- Ligate la veine cave supérieure en utilisant un 8-0 suture de soie et diviser distalement.
- Répétez la perfusion rétrograde en injectant 1,5 mL de solution saline à 4 °C par la veine cave inférieure.
- Liguer la veine cave inférieure en utilisant un 8-0 suture de soie et diviser distalement.
- Disséquer l’arc aortique et le tronc de l’artère pulmonaire pour le prélèvement du greffon et transecter les deux distalement. Litruez les veines pulmonaires sur la surface postérieure du cœur à l’aide d’une suture de soie 6-0 et divisez distalement.
- Effectuer la préparation de la greffe en retirant le cœur du donneur de la cavité thoracique. Placer le cœur excisé dans un récipient en plastique rempli de solution saline héparinée à 4 °C pendant 1-2 min. Transférer le greffon sur une fiole en plastique stérile remplie de glace pour la mise en place du brassard (figure 1A).
REMARQUE: La greffe cardiaque doit rester sur le ballon pendant environ 5 minutes pour placer la coiffe de l’artère pulmonaire du donneur. - Placez un brassard angiocathéter de 1 mm de long et 20 G (voir le tableau des matériaux) sur l’artère pulmonaire pour le brassard du donneur. À l’aide d’une pince fine, repliez doucement les bords de l’artère sur le brassard. Fixez le récipient plié au brassard à l’aide d’une attache en nylon 10-0, comme décrit précédemment18 (figure 1B,C).
- Conserver le cœur du donneur dans une solution saline héparinée ou une autre solution de conservation à 4 °C.
REMARQUE : Bien que certains puissent préférer des solutions de préservation spécifiques (p. ex., la solution de l’Université du Wisconsin) pour une conservation ischémique prolongée, cela peut être coûteux19. La solution saline peut être une alternative appropriée pour de courtes périodes d’ischémie (<1 h)20. En fin de compte, le choix de la solution de préservation dépend du plan expérimental21.
2. Procédure du destinataire
- Injecter de la kétamine (80−100 mg/kg) et de la xylazine (8−10 mg/kg) par voie intrapéritonéale à la souris receveuse pour l’anesthésie. Injecter de la buprénorphine à libération prolongée (0,5-1,0 mg/kg) par voie sous-cutanée pour l’analgésie. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie avec pincement des orteils et de la queue.
- Préparez la zone chirurgicale en rasant les cheveux de la région cervicale à l’aide d’un rasoir électrique. Appliquez une pommade ophtalmique stérile et non médicamenteuse sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
- Placez l’animal en décubitus dorsal, les membres antérieurs adjacents au corps et la tête légèrement tournée vers la gauche. Fixez les membres antérieurs et postérieurs avec du ruban chirurgical. Désinfectez la peau avec trois gommages alternés à 0,75% d’iode et à 70% d’éthanol.
- Faites une incision cervicale médiane de la mandibule inférieure au sternum.
- Transecter le muscle sternocléidomastoïdien droit. Extrayez le lobe droit de la glande sous-maxillaire pour créer de l’espace pour l’implantation du greffon.
- Attachez un nœud glissant sur la veine jugulaire externe proximale à l’aide d’une suture en soie 6-0. Liguer la veine jugulaire externe distale et les branches adjacentes à l’aide d’un 8-0 suture de soie. Faites une incision transversale à travers la paroi antérieure de la veine jugulaire externe.
- Placez une suture en nylon 10-0 à travers le bord de la veine jugulaire externe proximale et le tissu sous-jacent pour fixer la veine pendant l’insertion du brassard (Figure 1D).
- Liguer l’artère carotide commune droite distale à l’aide d’un 8-0 suture de soie juste inférieure à la bifurcation carotidienne. Attachez un nœud glissant sur l’artère carotide commune proximale à l’aide d’une suture de soie 6-0. Transecter l’artère distalement entre les sutures.
- Comme pour le brassard du donneur, placez un brassard d’angiocathéter de 0,6 mm de long de 24 G sur l’artère carotide commune droite du receveur. À l’aide d’une pince fine, repliez doucement les bords de l’artère sur le brassard. Fixez le récipient plié au brassard à l’aide d’une attache en nylon 10-0.
- Placez le cœur du donneur au-dessus de la région cervicale droite.
- Verser une solution saline froide sur la greffe cardiaque toutes les quelques minutes pendant l’implantation.
- Placez une suture en nylon 10-0 à travers le bord de l’aorte donneuse et à travers une morsure superficielle du tissu sous-jacent pour fixer le greffon en place (Figure 1E).
- Rincer l’aorte donneuse avec 0,5 mL de solution saline héparinée à 0,9 %.
- Insérez le brassard de l’artère carotide commune du receveur dans l’aorte du donneur. Sécurisez l’anastomose avec un 8-0 cravate en soie (figure 1F). Retirez la suture d’ancrage aortique.
- Désaérez la veine jugulaire externe en rinçant la veine jugulaire externe du receveur avec 0,5 mL de solution saline héparinée à 0,9 %.
- Effectuer une anastomose de l’artère pulmonaire en insérant la coiffe de l’artère pulmonaire donneuse dans la veine jugulaire externe du receveur et sécuriser avec un 8-0 cravate en soie (figure 1G). Retirez la suture d’ancrage de la veine jugulaire externe et transectez la paroi postérieure restante de la veine jugulaire externe pour libérer le greffon du tissu sous-jacent. Assurez-vous que le greffon est correctement orienté sans plier ou tordre les anastomoses.
- Relâchez les nœuds glissants sur la veine jugulaire externe du receveur, suivis de l’artère carotide commune, pour initier la reperfusion du greffon cardiaque (Figure 1H).
- Fermez l’incision cervicale à l’aide d’une suture en nylon interrompue 6-0.
3. Soins postopératoires
- Placez le receveur dans une chambre de récupération chaude immédiatement après la chirurgie et surveillez étroitement jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli de l’anesthésie (environ 1 h).
- Continuez à surveiller étroitement l’animal (toutes les 6 à 8 heures) pendant au moins 72 heures après la chirurgie pour détecter tout signe de comportement anormal, comme la léthargie, les tremblements, la respiration rapide ou l’anorexie.
- Pour le contrôle de la douleur, injecter du carprofène (5 mg / kg) par voie sous-cutanée toutes les 8-12 heures pour l’analgésie, en plus de la buprénorphine sous-cutanée (0,05 mg / kg) toutes les 8-12 heures pendant 24-48 heures à partir de la fin de la chirurgie.
4. Imagerie intravitale à deux photons du trafic des leucocytes dans la greffe cardiaque
- Injecter de la kétamine (80-100 mg/kg) et de la xylazine (8-10 mg/kg) par voie intrapéritonéale à une souris receveuse B6 LysM-GFP17 à 2 h après la reperfusion du greffon pour l’anesthésie.
- Effectuer une intubation orotrachéale à l’aide d’un angiocathéter de 20 G, comme décrit précédemment18.
- Connectez l’angiocathéter à la tubulure d’un ventilateur mécanique de souris et ventilez avec de l’air ambiant à un débit de 120 respirations/min et un volume courant de 0,5 mL18.
- Injecter 12 μL de points quantiques non ciblés de 655 nm (voir le tableau des matériaux), en suspension dans 50 μL de PBS par voie intraveineuse, comme décrit précédemment13.
- Rouvrez l’incision du cou pour exposer la greffe cardiaque. Placez la souris dans une chambre de stabilisation.
- Fixez une partie de la paroi libre du ventricule gauche à l’aide d’un mince anneau d’adhésif tissulaire (voir le tableau des matériaux), appliqué sur une lame de verre fixée à la plaque de la chambre supérieure.
- Placer la chambre sous l’objectif du microscope à deux photons pour acquérir des images et des vidéos, comme décrit précédemment13.
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Résultats
Ce modèle de transplantation cardiaque hétérotopique cervicale de souris a été utilisé pour effectuer plus de 1 000 greffes dans notre laboratoire, avec un taux de survie d’environ 97%. Le taux de réussite est légèrement supérieur à celui des rapports précédents utilisant d’autres techniques de transplantation cardiaque hétérotopique cervicale chez la souris10,11,20. Cela pourrait être attribué au brassard plus grand de 20 G pla...
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Discussion
En utilisant cette technique, la transplantation cardiaque cervicale hétérotopique de souris peut être réalisée en moins de 40 minutes par un microchirurgien expérimenté et en environ 60 minutes par un microchirurgien débutant. Alors que la transplantation cardiaque cervicale a été étudiée dans de nombreux modèles animaux, un modèle murin reste l’étalon-or en raison de multiples souches génétiques bien définies, des capacités d’altération génétique et de la disponibilité de nombreux réactifs, y compris des anticorps mono...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
DK est soutenu par les subventions 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078 des National Institutes of Health, la subvention 1I01BX002730 de l’Administration des anciens combattants et la Fondation pour l’hôpital Barnes-Juif.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 6-0 cravates en soie tressée | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0,75 % Providone iosine gommage | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 suture en nylon | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm non ciblé Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70 % Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 cravates en soie tressée | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Pince Adson | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c et C57BL/6 souris (6-8 semaines) | Jackson Laboratories | ||
| Coagulateur bipolaire | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofène (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofène (Rimadyl) comprimé oral à croquer | Transpharm | 38995/37919 | |
| Microscope 2P sur mesure exécutant le logiciel d’acquisition ImageWarp | A& B Software | ||
| Dumont no. 5 pinces | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Ciseaux à ressort fins de style vannas | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Porte-aiguille Halsey | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp pointe incurvée | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus ventilateur de souris modèle 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Solution d’héparine (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Kétamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope&mdash ; Leica Wild M651 & fois ; 6&ndash ; Grossissement 40 | Leica Microsystems | ||
| Ciseaux à ressort extra fins Moria | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Vaporisateur isoflurane Ohio | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S& Pince T SuperGrip pointe coudée | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S& Pince T SuperGrip à pointe droite | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Solution saline normale stérile (0,9 % (poids/vol) chlorure de sodium | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Embouts Q stériles (mini applicateurs coniques en coton de 3 pouces) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow Angiocathéter en téflon de calibre 20 1/4 pouce | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Angiocathéter en téflon de calibre 24 de 3/4 po | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| Système de soins intensifs pour petits animaux (réglages de récupération 3 L/min, O2, 80 ° ; C, 40 % d’humidité) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
Références
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Réimpressions et autorisations
