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Article de méthode

Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

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DOI :

10.3791/64090

⸱

28 juillet 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Résumé

La plupart des cellules peuvent sentir et changer leur forme pour effectuer des processus cellulaires fondamentaux. Chez de nombreux eucaryotes, le cytosquelette septine fait partie intégrante de la coordination des changements de forme tels que la cytocinèse, la croissance polarisée et la migration. Les septines sont des protéines formant des filaments qui s’assemblent pour former diverses structures d’ordre supérieur et, dans de nombreux cas, se trouvent dans différentes zones de la membrane plasmique, notamment dans les régions de courbure positive à l’échelle du micron. La surveillance du processus d’assemblage de la septine in vivo est entravée par les limites de la microscopie optique dans les cellules, ainsi que par la complexité des interactions avec les membranes et les éléments cytosquelettiques, ce qui rend difficile la quantification de la dynamique de la septine dans les systèmes vivants. Heureusement, il y a eu des progrès substantiels au cours de la dernière décennie dans la reconstitution du cytosquelette de septine dans un système sans cellule pour disséquer les mécanismes contrôlant l’assemblage de la septine à des résolutions spatiales et temporelles élevées. Les principales étapes de l’assemblage de la septine comprennent l’association et la dissociation de l’hétérooligomère de septine avec la membrane, la polymérisation en filaments et la formation de structures d’ordre supérieur par le biais d’interactions entre filaments. Ici, nous présentons trois méthodes pour observer l’assemblage de septine dans différents contextes: les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tige. Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les paramètres biophysiques des septines à différents stades d’assemblage: en tant qu’octamères simples liant la membrane, en tant que filaments et en tant qu’assemblages de filaments. Nous utilisons ces paramètres associés à des mesures d’échantillonnage de courbure et d’adsorption préférentielle pour comprendre comment la détection de courbure fonctionne à diverses échelles de longueur et de temps.

Introduction

Les formes des cellules et beaucoup de leurs compartiments internes dépendent des membranes lipidiques qui les entourent. Les membranes sont des structures viscoélastiques qui peuvent être déformées par des interactions avec les protéines, le tri des lipides et l’action des forces internes et externes pour générer une variété de formes 1,2,3,4. Ces formes sont souvent décrites en termes de courbure de la membrane. Les cellules utilisent une suite diversifiée de protéines capables de s’assembler préférentiellement sur des courbures membranaires particulières ou de les « détecter » pour assurer un contrôle spatio-temporel défini sur des processus tels que le trafic cellulaire, la cytocinèse et la migration 5,6. La dynamique de la machinerie cellulaire au niveau de la membrane est particulièrement difficile à observer en raison de la difficulté d’équilibrer le temps et la résolution spatiale avec la santé cellulaire. Bien que les techniques de super-résolution puissent offrir une vue détaillée de ces structures, elles nécessitent de longues acquisitions qui ne se prêtent pas aux délais d’assemblage / démontage pour la plupart des machines. De plus, la complexité moléculaire de ces assemblages dans leur environnement natif et la multitude de rôles qu’un seul composant peut jouer font des systèmes de reconstitution minimaux un outil précieux pour étudier la capacité fonctionnelle des molécules.

Des mimétiques membranaires minimaux ont été développés pour étudier les propriétés membranaires et les interactions protéine-membrane à l’extérieur de la cellule. Les mimétiques membranaires varient des bicouches lipidiques autoportantes, telles que les liposomes ou les vésicules unilamellaires géantes, aux bicouches lipidiques supportées (SLB)7,8,9,10. Les SLB sont des membranes biomimétiques ancrées au support sous-jacent, généralement composées de verre, de mica ou de silice11,12. Une variété de géométries peut être utilisée, y compris des surfaces planes, des sphères, des bâtonnets et même des substrats ondulés ou micromotifs pour sonder les interactions protéine-membrane sur des courbures concaves et convexes simultanément1 3,14,15,16,17,18 . La formation de bicouches commence par l’adsorption des vésicules sur une surface hydrophile, suivie de la fusion et de la rupture pour former une bicouche continue (Figure 1)19. Les bicouches prises en charge se prêtent particulièrement à la lumière et à la microscopie électronique, offrant à la fois un meilleur temps et une meilleure résolution spatiale que ce qui est souvent réalisable dans les cellules. Les SLB incurvés offrent en particulier un moyen attrayant de sonder la sensibilité à la courbure des protéines en l’absence de déformation significative de la membrane, ce qui permet de distinguer la détection de courbure et l’induction de courbure, qui sont souvent impossibles à séparer dans les systèmes autonomes.

Les septines sont une classe de protéines cytosquelettiques formant des filaments bien connues pour leur capacité à s’assembler sur des membranes incurvées positivement 6,18,20. Au cours du cycle cellulaire de la levure, les septines s’assemblent en un anneau et doivent se réorganiser pour former les structures de sablier et de double anneau associées à l’émergence des bourgeons et à la cytokinèse, respectivement21. Bien que de beaux travaux aient été réalisés en utilisant la microscopie électronique à réplique de platine pour observer l’architecture des septines à différents stades du cycle cellulaire22, l’observation de l’assemblage des septines au fil du temps à l’aide de la microscopie optique dans la levure a rencontré une résolution spatiale limitée. Des travaux antérieurs sur les septines utilisant des monocouches lipidiques visualisées par microscopie électronique à transmission (TEM) ont permis de reconstituer plusieurs structures de septines intéressantes telles que des anneaux, des faisceaux et des gazes23. Cependant, les techniques EM sont également limitées dans leur résolution temporelle, contrairement à la microscopie à fluorescence. Afin de mieux résoudre les paramètres cinétiques du processus multi-échelle d’assemblage de septines, nous nous sommes tournés vers les mimétiques membranaires pris en charge, où l’on peut contrôler soigneusement la géométrie de la membrane, les conditions de l’échantillon et la modalité d’imagerie.

Les protocoles décrits ici utilisent des SLB planaires ou incurvés, des protéines purifiées et une combinaison de techniques de microscopie. La microscopie confocale quantitative à fluorescence et la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM) ont été utilisées pour mesurer à la fois la liaison des protéines en vrac sur diverses courbures membranaires, ainsi que pour mesurer la cinétique de liaison de molécules individuelles. De plus, ce protocole a été adapté pour être utilisé avec la microscopie électronique à balayage (MEB) pour examiner l’ultrastructure des protéines sur différentes courbures de membrane. Bien que ces protocoles se concentrent sur le cytosquelette septine, les protocoles peuvent être facilement modifiés pour étudier la sensibilité à la courbure de toute protéine que le lecteur trouve intéressante. En outre, ceux qui travaillent dans des domaines tels que l’endocytose ou le trafic vésiculeux peuvent trouver ces techniques utiles pour sonder les assemblages dépendants de la courbure des complexes multiprotéiques.

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Protocole

REMARQUE: La formation de bicouches lipidiques supportées nécessite la préparation de petites vésicules unilamellaires monodispersées (VUS). Veuillez vous référer à un protocole24 publié précédemment sur la formation de SUV. En bref, tous les VUS sont formés par sonication par sonde pendant 12 min au total à 70% d’amplitude via des périodes de sonication de 4 min suivies de périodes de repos de 2 min dans l’eau glacée. Les solutions SUV doivent être bien clarifiées et monodispersées en taille. Les distributions de taille des VUS peuvent être mesurées, par exemple, par diffusion dynamique de la lumière25.

1. Bicouches lipidiques planes

  1. Nettoyage plasma des lames
    REMARQUE: Le nettoyage au plasma élimine les contaminants organiques et augmente l’hydrophilie du verre, assurant une adsorption efficace des lipides. Les étapes suivantes peuvent changer ou doivent être optimisées en fonction du nettoyeur plasma et des couvercles de verre utilisés.
    1. Purgez le nettoyeur plasma pendant 5 minutes avec de l’oxygène pour éliminer l’air des conduites et de la chambre. Il s’agit de s’assurer que, lorsque le nettoyeur plasma est utilisé, il y a principalement de l’oxygène dans les lignes et la chambre, fournissant des préparations bicouches plus cohérentes.
    2. Pendant la purge, jetez un gaz inerte, tel que N2 ou Ar, sur les glissières de verre de micro-couverture pour éliminer la poussière et les particules.
      FACULTATIF: Les lames de verre de couverture peuvent être lavées en pulvérisant chaque côté avec 100% d’isopropanol suivi d’eau. Répétez le lavage à l’isopropanol-eau 3x, puis séchez avec un jet N2 .
    3. Disposez les glissières de verre de couverture sèche dans un berceau en céramique. Placez le berceau à l’arrière de la chambre à plasma de sorte que les couvercles soient parallèles au long bord de la chambre (cela les maintient en place pendant le nettoyage au plasma). Faites fonctionner le nettoyeur plasma pendant 15 minutes avec de l’oxygène à puissance maximale.
  2. Préparation de la chambre
    REMARQUE: La méthode décrite ici utilise des chambres faites maison à partir de tubes PCR en plastique pour soutenir les volumes de réaction, mais d’autres matériaux à faible adhérence, tels que les puits en silicone, peuvent également convenir.
    1. À l’aide d’une lame de rasoir ou de ciseaux, coupez le capuchon juste en dessous de la partie givrée d’un tube PCR de 0,2 mL (Figure 2).
    2. Peignez le bord du tube PCR avec un adhésif activé par UV, en évitant l’intérieur du tube. Placez doucement le tube PCR collé au centre d’un couvercle nettoyé au plasma.
      REMARQUE: Pour éviter la colle à l’intérieur de la chambre, utilisez la quantité minimale de colle pour obtenir un joint et traitez rapidement avec des UV sans heurter ou perturber la chambre.
    3. Placez la chambre sous une lumière UV de longue longueur d’onde pendant 5 à 7 minutes pour durcir l’adhésif.
  3. Formation de bicouches
    REMARQUE: Les VUS monodispersés doivent être utilisés à cette étape pour une formation efficace de bicouches. Le tableau 1 fournit des recettes pour tous les tampons utilisés dans la formation de la bicouche, y compris les concentrations de stock et de tampon final.
    1. Ajouter 40 μL de tampon de bicouche lipidique supporté (SLBB : 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2 ; Tableau 1), 10 μL de VUS de 5 mM et 1 μL de 100 mM caCl2 au puits. Secouez doucement les chambres d’un côté à l’autre pour perturber les VUS, puis incubez à 37 °C pendant 20 min.
      REMARQUE: Pour limiter l’évaporation, incuber dans une boîte de Petri recouverte d’une lingette humide.
  4. Laver l’excès de lipides
    REMARQUE: Cette étape supprime les VUS excédentaires et agit comme une étape d’échange de tampon. Il est très important de ne pas gratter la bicouche avec la pointe de la pipette pendant le lavage; si le verre est exposé, les septines et de nombreuses autres protéines se lient de manière irréversible, réduisant ainsi la concentration efficace en protéines.
    1. Après l’incubation, rincer la bicouche 6x avec 150 μL de SLBB, en pipetant de haut en bas pour mélanger à chaque fois tout en évitant les bulles.
      REMARQUE: Ajouter 150 μL directement aux 50 μL de tampon et de VUS déjà présents pour un total de 200 μL dans le puits de réaction.
    2. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’incubation avec les septines ou une autre protéine de votre choix, lavez la bicouche 6x avec 150 μL de tampon de réaction (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg / mL BSA, 0,14% méthylcellulose, 1 mM BME).
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, rendez le tampon de réaction frais et soyez très prudent tout en mélangeant bien dans la réaction pour éviter les bulles.
    3. Lors de la dernière étape de lavage, retirez 125 μL de tampon de réaction, en laissant 75 μL dans le puits. Ajouter 25 μL de septines diluées dans un tampon de stockage de septines (SSB : 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) à la concentration souhaitée et image par microscopie TIRF26.
      REMARQUE: Lors de la mise en place de ce test pour la première fois ou de l’incorporation d’une nouvelle composition lipidique, il est recommandé de s’assurer que les lipides diffusent librement sur la surface en utilisant la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Bien que le taux de récupération soit différent pour différentes compositions lipidiques et intrinsèquement inférieur à celui des systèmes autonomes, les lipides ne doivent pas être immobiles.

Tampon bicouche lipidique pris en charge (SLBB)
StockVolumeConcentration finale
2 M KCl1,5 mL300 mM
1 M HEPES200 μL20 mM
500 mM MgCl2 20 μL1 mM
Eau8 mL
Tampon pré-réactionnel (PRB)
StockVolumeConcentration finale
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES500 μL50 mM
Eau9,33 mL
Tampon de réaction
StockVolumeConcentration finale
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES300 μL50 mM
10 mg/mL de BSA1,39 mL1,39 mg/mL
1% méthylcellulose1,39 mL0.0014
EauJusqu’à 10 mL
Bme0,7 μL1 mM
Tampon de stockage Septin (SSB)
StockVolumeConcentration finale
2 M KCl1,5 mL300 mM
1 M HEPES500 μL50 mM
EauJusqu’à 10 mL
Bme0,7 μL1 mM

Tableau 1 : Composants tampons pour la préparation de la bicouche lipidique supportée et des réactions. Les volumes de solutions mères incorporées dans les tampons et les concentrations finales de chaque composant sont indiqués. Le SLB et le PRB peuvent être stockés à température ambiante et réutilisés entre les expériences. Le tampon de réaction et le SSB sont rafraîchis pour chaque expérience.

2. Bicouches lipidiques à support sphérique

REMARQUE: Ce protocole utilise des microsphères de silice en suspension dans de l’eau ultrapure à 10% de densité. Pour tout travail sur les paramètres cinétiques de l’assemblage des protéines, il est important de contrôler strictement la surface totale de la membrane entre les expériences et les courbures. Le tableau 2 montre les volumes corrigés de billes et de tampon pour maintenir 5 mm2 de la surface totale de la membrane. Ce protocole développe une méthodeprécédemment publiée 8,18.

  1. Formation de bicouches
    REMARQUE: En ce qui concerne les bicouches planes, il est important d’avoir des VUS de haute qualité pour une formation bicouche robuste. Le tableau 2 énumère le volume de billes provenant d’une solution de densité à 10 % et leurs volumes SLBB respectifs qui sont utilisés pour obtenir une surface finale de 5 mm2 pour une gamme de diamètres de billes.
    1. Les microsphères de silice (également appelées perles) ont tendance à se déposer et à s’agglutiner; pour mélanger les perles et briser les grappes, vortex la bouteille pendant 15 s, puis bain-sonique pendant 1 min, et vortex à nouveau pendant 15 s.
    2. Mélanger le volume approprié de billes (tableau 2) avec le volume correspondant de SLBB et 10 μL de VUS de 5 mM dans un tube de microcentrifuge à faible adhérence de 0,5 mL.
    3. Faire basculer le mélange perle-lipide bout à bout pendant 1 h à température ambiante. Assurez-vous que cette incubation se fait sur un rotateur pour éviter la sédimentation.
  2. Préparer les chambres sur des couvercles PEGylated
    REMARQUE: En ce qui concerne les bicouches planes, des chambres faites maison à partir de tubes PCR en plastique sont utilisées pour supporter les volumes de réaction, mais d’autres matériaux à faible adhérence, tels que les puits en silicone, peuvent tout aussi bien fonctionner.
    1. Pendant que les perles basculent, décongelez un couvercle PEGylated à température ambiante. Coupez un tube PCR de 0,2 mL et collez-le sur le couvercle comme décrit à l’étape 1.2. Pour les glissières de 24 mm x 50 mm, jusqu’à 10 chambres peuvent tenir sur une seule glissière.
      REMARQUE: Ce protocole utilise des couvercles en verre PEGylated de 24 mm x 50 mm qui sont préparés à l’avance. En bref, les couvercles en verre sont soigneusement nettoyés par sonication dans de l’acétone, du méthanol et du KOH de 3 M. Les couvercles sont ensuite fonctionnalisés avec du n-2-aminoéthyl-3-aminopropyltriméthoxysilane et liés de manière covalente au valérate de succinimidyle mPEG. Les couvercles PEGylés finis sont stockés sous vide scellés à −80 °C. Pour un protocole de passivation similaire, veuillez consulter les travaux de Gidi et al.27. Bien que les couvercles en verre PEGylated soient suggérés ici, d’autres moyens de passivation, tels que les méthodes BSA ou poly-L-lysine, peuvent être efficaces.
  3. Laver l’excès de lipides
    REMARQUE: Cette étape permet de supprimer les VUS excédentaires et d’effectuer un échange de tampon. Les billes sont lavées 4x au total avec un tampon de pré-réaction (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Le tableau 3 répertorie les vitesses de rotation en RCF pour une gamme de diamètres de billes.
    1. Faire tourner les perles au NIVEAU DU FCR désigné pendant 30 s (tableau 3). Si vous utilisez plusieurs tailles de perles, gardez les perles à bascule jusqu’à ce qu’il soit temps de les laver.
      REMARQUE: Il ne vaut pas la peine de sédimenter de plus grandes perles dans le même spin que les perles plus petites avec la plus petite vitesse de sédimentation des perles pour gagner du temps. Cela peut amener les perles à coller les unes aux autres et compromettre l’intégrité de la bicouche.
    2. Après le premier tour, retirer 50 μL de surnageant et ajouter 200 μL de PRB. Après les deuxième et troisième rotations, retirez 200 μL et ajoutez 200 μL de PRB. Après le quatrième tour, retirez 200 μL et ajoutez 220 μL de PRB. Pipette vigoureuse pour chaque lavage.
      REMARQUE: Le volume de remise en suspension finale est différent de celui des lavages. Ne pas vortexer les perles après l’incubation avec les lipides, car cela pourrait laisser des espaces dans les bicouches. Pour éviter la sédimentation lors du travail avec les autres tailles de billes ou de la mise en place d’autres parties du test, replacez les mélanges de billes sur le rotateur d’extrémité à extrémité.
  4. Préparation de la réaction
    REMARQUE: Cette réaction est conçue pour préserver la surface totale de la membrane de la réaction à 5 mm2 et pour produire une condition de réaction finale de 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg / mL BSA, 0,1% méthylcellulose et 1 mM BME.
    1. Si vous faites un test de compétition avec plusieurs tailles de perles, faites un mélange 1: 1 en mélangeant des volumes égaux de chaque taille de perle ensemble. Ensuite, mélanger 29 μL du mélange de billes souhaité (ou d’une seule perle) avec 721 μL de tampon RXN.
      REMARQUE: Il est important de bien mélanger les perles à chaque étape avec une pipette pour éviter les grappes denses de perles; cela se traduira par une distribution plus uniforme des perles et une surface totale précise.
    2. Mélanger 75 μL de billes diluées et 25 μL de protéines diluées dans du SSB dans les puits.
      REMARQUE: Les auteurs imagent généralement les complexes de septine de levure à 1-50 nM.
    3. Si vous mesurez des septines à l’état d’équilibre, incuber à température ambiante pendant 1 h, puis imager par microscopie quasi-TIRF ou confocale.
Diamètre du perle (μm)Volume de billes bien mélangées (μL)Volume du tampon SLB (μL)Volume de VUS (μL)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

Tableau 2 : Volumes normalisés de microsphères. Afin de maintenir une surface égale de chaque taille de perle et de maintenir la surface totale de la membrane cohérente entre les expériences, des volumes pour chaque taille de perle et tampon normalisant la surface totale ont été calculés.

Diamètre de la perle (μm)Vitesse de sédimentation (FCR)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

Tableau 3 : Vitesses de sédimentation pour les microsphères de diamètres variables. Pour chaque diamètre de perle, les vitesses minimales de sédimentation indiquées ont été utilisées pour granuler les billes afin de laver les liposomes non liés.

3. Bicouches lipidiques soutenues par la tige

REMARQUE: Contrairement aux autres essais présentés ici, le test sur tige ne permet pas un contrôle minutieux de la surface totale de la membrane. On peut être cohérent en quantités et en volumes entre les expériences, mais comme il en résulte des tiges de différentes longueurs et diamètres, il est difficile d’extrapoler la surface totale de la membrane dans la réaction. Ainsi, bien qu’il s’agisse d’un excellent test pour explorer la détection de courbure avec plusieurs courbures sur une seule surface et qu’il ait été utile pour explorer l’ultrastructure septine, il n’est pas recommandé pour les mesures cinétiques. Cette méthode a déjà été signalée18 et est développée ici.

  1. Obtention de tiges de borosilicate à partir de filtres en microfibre de verre
    1. Déchirez un seul filtre en microfibre de verre GF/C de 42,5 mm en petits morceaux et placez-les dans un bécher de 100 mL avec 60 mL d’éthanol à 100 %. Bain-sonicate jusqu’à ce que la solution devienne opaque; cela peut prendre aussi peu que 20-30 min avec un filtre finement déchiqueté.
      REMARQUE: Sonicate soigneusement pour briser les gros morceaux; plus il y a de dissociés/opaques, mieux c’est.
    2. Couvrir la solution avec un film et conserver la solution à température ambiante pendant la nuit.
  2. Formation de bicouches sur les tiges
    REMARQUE: Cette étape est effectuée avec un excès de lipides pour obtenir une couverture complète de la tige car il est impossible de quantifier la surface totale dans cette méthode.
    1. Le lendemain, la solution d’éthanol sera réglée (étape 3.1.2.), alors mélangez-la bien avant de l’utiliser. Mélanger 10 μL de solution de tige et 70 μL de SLBB.
    2. Tournez à pleine vitesse dans une mini centrifugeuse pendant 30 s et retirez 50 μL du surnageant. Remettre en suspension dans un autre 50 μL de SLBB et répéter le spin pendant un total de quatre lavages pour diluer l’éthanol.
      REMARQUE: Les supports de tige ne formeront pas de pastille solide au fond du tube. Ils sont plutôt enduits le long du côté du tube; cela les rend difficiles à préserver complètement lors du lavage. Étant donné que la surface totale de ce test n’est pas contrôlée, il est bon qu’ils soient perturbés.
    3. Combiner 10 μL de solution de tige bien mélangée avec 50 μL de VUS de 5 mM et 20 μL de SLBB. Incuber pendant 1 h à température ambiante, en tournant bout à bout comme lors de la formation de bicouches sur les microsphères.
  3. Laver l’excès de lipides
    1. Semblable à l’étape 3.2.2., faire tourner la solution de tige lipidique à vitesse maximale dans une mini-centrifugeuse pendant 30 s pour éliminer les tiges revêtues de membrane de la solution.
    2. Après le premier tour, retirer 50 μL du surnageant et ajouter 200 μL de PRB. Après les deuxième et troisième rotations, retirez 200 μL et ajoutez 200 μL de PRB. Après la quatrième rotation, retirer 200 μL, ajouter 220 μL de PRB et pipeter vigoureusement pour mélanger.
  4. Préparation de la réaction
    1. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, mélanger 721 μL de tampon de réaction avec 29 μL de solution de tige. Bien mélanger.
    2. Dans un tube PCR de 0,2 mL, combiner 75 μL de bâtonnets dans un tampon de réaction et 25 μL de septines à la concentration souhaitée, dilués dans du SSB. Laissez-le incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
  5. Préparation à la microscopie électronique à balayage
    1. Après incubation, ajouter le mélange septine-tige de 100 μL sur un couvercle rond de 12 mm enduit de PEG et incuber à température ambiante pendant 1 h dans une boîte de Pétri fermée.
    2. Fixer l’échantillon en remplissant le fond de la boîte de Petri (10 mL devraient suffire) avec 2,5% de glutaraldéhyde dans 0,05 M de cacodylate de sodium (NaCo), pH 7,4, pendant 30 min. Aspirer le liquide avec une pipette en verre. Lavez l’échantillon en l’incubant avec 10 mL de NaCo de 0,05 M pendant 5 min et répétez pour un total de deux lavages.
    3. Postfixer dans un tampon cacodylate OsO4 à 0,5 % pendant 30 min, puis laver 3x dans 0,05 M NaCo (5 min/lavage).
    4. Incuber l’échantillon avec 1% d’acide tannique pendant 15 min, puis laver dans du NaCo 3x. Incuber pendant 15 min dans 0,5% OsO4 et laver 3x avec du NaCo.
    5. Déshydrater les échantillons en augmentant les concentrations d’éthanol: 30% EtOH pendant 5 min, 2x; 50% EtOH pendant 5 min; 75% EtOH pendant 5 min; et 100% EtOH pendant 5 min, 2x. Suivez avec une autre incubation de 10 minutes.
    6. Incuber dans un liquide de transition (hexaméthyldisilazane) 3x (5 min, 10 min, puis 5 min).
    7. Laisser sécher à l’air, puis placer les échantillons dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’ils soient enduits par pulvérisation. Recouvrir la couche de 4 nm d’un alliage or/palladium, puis l’image sur un microscope électronique à balayage.

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Résultats

Après la préparation de chaque SLB, les septines ou la protéine d’intérêt peuvent être incubées avec le support souhaité et imagées via TIRFM, microscopie confocale ou SEM. Les résultats présentés ici utilisent des septines exprimées de manière recombinante et purifiées à partir d’E. coli17. En utilisant TIRFM sur des SLB planaires, il est possible de déterminer la longueur des filaments et leur flexibilité, de mesurer les coefficients de diffusion et d’observer l’assemblage dans le temps...

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Discussion

Les membranes cellulaires prennent de nombreuses formes, courbures et propriétés physico-chimiques différentes. Afin d’étudier la machinerie à l’échelle nanométrique à travers laquelle les cellules construisent des assemblages à l’échelle micrométrique, il est nécessaire de concevoir des systèmes de reconstitution minimaux de mimétiques membranaires. Ce protocole présente des techniques qui contrôlent avec précision à la fois la courbure et la composition de la membrane tout en permettant à l’utilisateur de prendre facil...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) Grant no. R01 GM-130934 et National Science Foundation (NSF) Grant MCB-2016022. B.N.C, E.J.D.V. et K.S.C. ont été soutenus en partie par une subvention de l’Institut national des sciences médicales générales sous le prix T32 GM119999.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR de 0,2 mL avec capuchon plat, NaturalWatson137-211C(EX)
Tubes à faible adhérence de 0,5 mLUSA Scientific1405-2600
Bêta-mercaptoéthanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Coverglass pour la fabrication de lamelles PEGyléesThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
Egg Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Glutaraldehyde Aqueux 25 %, EM GradeVWR16220
EMS Tampon de cacodylate de sodiumVWR11652
Éthanol, 200 proofFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191
Chlorure de magnésiumVWR7791-18-6
Méthylcellulose 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Lambeaux en microverre pour bicouches planesMatsunamiDiscontinué22x22
Mini centrifugeuse
Microsphères de silice non fonctionnaliséesBangs Laboratories, Inc.Dépend de la taille : SS0200*-SS0500*Silice en suspension aqueuse
Adhésif optiqueNorland ThorlabsNOA 68Adhésif flexible pour verre ou plastiques
Tétroxyde d’osmiumMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Nettoyeur plasmaPlasmaEtch PE-25Tension : 120V, 60Hz. Courant : 15 AMPÈRES
Chlorure de potassiumVWR0395-1kg
Verre de protection rond, #1.5 12mm  ;   ;VWR64-0712
Bain sonicateurBranson1510R-MTNettoyeur à ultrasons Bransonic. 50-60 Hz. Sortie : 70W
Soy PIAvanti Polar Lipids840044
Centrifugeuse de tableEppendorf22331
Lampe UVSpectrolineENF-260C115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Papier filtre en microfibreVWR28455-03042,5 mm de diamètre, grade GF/C

Références

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