Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Felix A. Kyere; Ian Curtin; Oleh Krupa; Carolyn M. McCormick; Mustafa Dere; Sarah Khan; Minjeong Kim; Tzu-Wen Winnie Wang; Qiuhong He; Guorong Wu; Yen-Yu Ian Shih; Jason L. Stein

doi:10.3791/64096

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Article de méthode

Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

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DOI :

10.3791/64096

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1 août 2022

Felix A. Kyere^*¹^,² , Ian Curtin^*¹^,² , Oleh Krupa¹^,² , Carolyn M. McCormick¹^,² , Mustafa Dere³ , Sarah Khan³^,⁷ , Minjeong Kim⁷ , Tzu-Wen Winnie Wang⁴^,⁵^,⁶ , Qiuhong He⁴^,⁵^,⁶ , Guorong Wu³ , Yen-Yu Ian Shih⁴^,⁵^,⁶ , Jason L. Stein¹^,²

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes d’imagerie par résonance magnétique, d’effacement et d’immunomarquage de cerveaux de souris intacts à l’aide d’iDISCO+, suivies d’une description détaillée de l’imagerie à l’aide de la microscopie à feuille de lumière et des analyses en aval à l’aide de NuMorph.

Résumé

Le nettoyage des tissus suivi de la microscopie à feuille de lumière (LSFM) permet l’imagerie à résolution cellulaire de la structure cérébrale intacte, permettant une analyse quantitative des changements structurels causés par des perturbations génétiques ou environnementales. L’imagerie du cerveau entier permet une quantification plus précise des cellules et l’étude des différences spécifiques à la région qui peuvent être manquées avec la microscopie couramment utilisée des tissus sectionnés physiquement. L’utilisation de la microscopie à feuille de lumière pour imager les cerveaux dégagés augmente considérablement la vitesse d’acquisition par rapport à la microscopie confocale. Bien que ces images produisent de très grandes quantités de données structurelles sur le cerveau, la plupart des outils informatiques qui effectuent la quantification des caractéristiques dans les images de tissus clairsemés se limitent à compter des populations de cellules clairsemées, plutôt que tous les noyaux.

Ici, nous démontrons NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un groupe d’outils d’analyse, pour quantifier tous les noyaux et marqueurs nucléaires dans les régions annotées d’un cerveau de souris postnatal du jour 4 (P4) après élimination et imagerie au microscope à feuille de lumière. Nous décrivons l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour mesurer le volume cérébral avant le rétrécissement causé par les étapes de déshydratation de l’élimination des tissus, le nettoyage des tissus à l’aide de la méthode iDISCO +, y compris l’immunomarquage, suivi de la microscopie à feuille de lumière à l’aide d’une plate-forme disponible dans le commerce pour imager les cerveaux de souris à la résolution cellulaire. Nous démontrons ensuite ce pipeline d’analyse d’images à l’aide de NuMorph, qui est utilisé pour corriger les différences d’intensité, assembler des tuiles d’image, aligner plusieurs canaux, compter les noyaux et annoter les régions du cerveau grâce à l’enregistrement dans des atlas accessibles au public.

Nous avons conçu cette approche à l’aide de protocoles et de logiciels accessibles au public, permettant à tout chercheur disposant du microscope et des ressources informatiques nécessaires pour effectuer ces techniques. Ces outils de nettoyage tissulaire, d’imagerie et de calcul permettent de mesurer et de quantifier l’organisation tridimensionnelle (3D) des types cellulaires dans le cortex et devraient être largement applicables à toute conception d’étude de souris de type sauvage / knockout.

Introduction

L’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire est un défi important en neurosciences. Les images cérébrales à résolution cellulaire permettent une analyse détaillée et une cartographie au niveau du système des circuits cérébraux et de la façon dont ces circuits sont perturbés par des facteurs de risque génétiques ou environnementaux de troubles neuropsychiatriques, le comportement cellulaire dans les embryons en développement, ainsi que les circuits neuronaux dans le cerveau adulte ^1,2,3. Il existe de multiples méthodes histologiques qui permettent d’obtenir des....