Method Article

Combinaison d’un actionneur de force magnétique 3D et d’une imagerie par fluorescence multifonctionnelle pour étudier la mécanobiologie du noyau

DOI:

10.3791/64098

⸱

July 5th, 2022

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1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude présente un nouveau protocole pour appliquer directement une force mécanique sur le noyau cellulaire par le biais de microbilles magnétiques livrées dans le cytoplasme et pour effectuer simultanément l’imagerie fluorescente de cellules vivantes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une question fondamentale en mécanobiologie est de savoir comment les cellules vivantes perçoivent les stimuli mécaniques extracellulaires dans le contexte de la physiologie et de la pathologie cellulaires. On pense que la mécano-sensation cellulaire des stimuli mécaniques extracellulaires se fait à travers les récepteurs membranaires, le complexe protéique associé et le cytosquelette. Les progrès récents de la mécanobiologie démontrent que le noyau cellulaire du cytoplasme lui-même peut détecter indépendamment simultanément les stimuli mécaniques. Cependant, une compréhension mécaniste de la façon dont le noyau cellulaire détecte, transduit et répond aux stimuli mécaniques fait défaut, principalement en raison des défis techniques liés à l’accès et à la quantification de la mécanique du noyau par des outils conventionnels. Cet article décrit la conception, la fabrication et la mise en œuvre d’un nouvel actionneur de force magnétique qui applique des stimuli mécaniques 3D précis et non invasifs pour déformer directement le noyau cellulaire. En utilisant des cellules modifiées par CRISPR/Cas9, cette étude démontre que cet outil, combiné à l’imagerie confocale fluorescente à haute résolution, permet la révélation de la dynamique en temps réel d’une protéine associée oui (YAP) mécano-sensible dans des cellules individuelles en fonction de la déformation du noyau. Cette méthode simple a le potentiel de combler le fossé technologique actuel dans la communauté de la mécanobiologie et de fournir des réponses au manque de connaissances qui existe dans la relation entre la mécanotransduction du noyau et la fonction cellulaire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude vise à développer et à appliquer une nouvelle technique pour élucider la mécanobiologie du noyau en combinant les actionneurs magnétiques qui appliquent une force mécanique directement sur le noyau cellulaire et la microscopie confocale à fluorescence qui imagera simultanément les changements subcellulaires structurels et fonctionnels. Les cellules détectent les signaux biophysiques extracellulaires, y compris la rigidité tissulaire 1,2,3,4, la pression du fluide interstitiel et la contrainte de cisaillement 5,6,7, la topologie/géométrie de surface 8,9,10,11,12 et la contrainte de tension/compression13,14, 15,16. Les signaux biophysiques sont convertis en signaux biochimiques et déclenchent des changements potentiels en aval de l’expression génique et des comportements cellulaires - un processus connu sous le nom de mécanotransduction 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Pour étudier les processus de mécanotransduction, une myriade de techniques ont été développées pour appliquer une force mécanique sur les cellules, telles que la microscopie à force atomique28, le dispositif d’étirement cellulaire29, le capteur de force bio-MEMS (systèmes micro-électromécaniques) 15,30,31, la rhéologie de cisaillement 32 et le système de vision stéréoscopique 33 . Une revue récente résume les approches pour appliquer des signaux mécaniques extracellulaires et interférer avec la mécanodétection34. À ce jour, la plupart de ces méthodes appliquent une force sur la membrane plasmique cellulaire, et les cellules reçoivent directement ces signaux biophysiques extracellulaires via des récepteurs membranaires tels que l’intégrine, la cadhérine, les canaux ioniques et les récepteurs couplés aux protéines G. Par la suite, ils transmettent le signal au cytosquelette intracellulaire et au noyau. Par exemple, en utilisant la translocation de protéines associées à l’oui (YAP) comme indicateur de mécano-détection, il est démontré que les cellules détectent les signaux mécaniques de rigidité du substrat et de tension extracellulaire de la membrane cellulaire et les transmettent à travers le cytosquelette dans le noyau pour induire la translocation du cytoplasme au noyauYAP 28,35.

Des preuves récentes suggèrent que le noyau cellulaire lui-même est un mécano-capteur indépendant 8,36,37. Ceci est prouvé par des expériences effectuées sur le noyau isolé prélevé sur des cellules, où il a été révélé que les noyaux modifient adaptativement leur rigidité en réponse à la force mécanique directement appliquée sur eux36. Au cours de nombreuses conditions physiologiques, les noyaux des cellules tumorales et saines détectent les signaux biophysiques extracellulaires et modifient leurs propriétés mécaniques et leurs assemblages38,39,40. Par exemple, lors de l’extravasation, la rigidité nucléaire des cellules tumorales diminue et maintient la douceur pendant plus de 24 h38. Au cours de la migration à travers l’espace interstitiel confiné, les noyaux des cellules tumorales perdent fréquemment et retrouvent leur intégrité structurelle39. Cependant, la façon dont le noyau détecte le signal biophysique est inconnue, bien que plusieurs protéines d’enveloppe nucléaire et familles de protéines se soient révélées impliquées, telles que Lamin A / C et linker of nucleoskeleton and cytoskeleton complex (LINC)38,41. Par conséquent, de nouvelles méthodes non invasives capables d’appliquer directement une force au noyau découpleront l’effet de la transmission de la force de la membrane cellule-plasma et du cytosquelette, et aideront à élucider les mécanismes moléculaires auparavant inaccessibles de la mécano-détection nucléaire.

Les recherches utilisant des pincettes optiques pour manipuler les organites42 et les microbilles injectées dans les cellules43 ont montré la capacité technologique d’appliquer directement une force sur le noyau. Cependant, la technique de la pince optique présente plusieurs limites : (1) les pinces optiques à faible débit ne manipulent souvent qu’une seule cellule ou microbille à la fois; et (2) les photodommages potentiels et la déformation des artefacts de température du nucléaire nécessitent des dizaines de pN36, et la puissance laser nécessaire correspondante est d’environ 10 mW par pN44,45. Une telle intensité laser est suffisante pour déclencher des photodommages dans les cellules et perturber les fonctions cellulaires au cours de l’expérience46.

La force magnétique appliquée à travers les microbilles dans les cellules vivantes montre le potentiel d’appliquer directement une force sur le noyau et surmonte les limites des pincettes optiques. Une fois que les microbilles sont livrées dans le cytoplasme, un champ magnétique peut exercer une force magnétique sur plusieurs microbilles simultanément à haut débit. Le champ magnétique n’influence pas les fonctions cellulaires47, mais génère une force de pN à nN, ce qui est suffisant pour induire une déformation nucléaire 36,48,49. À ce jour, la manipulation de microbilles magnétiques a été appliquée sur la membrane plasmique cellulaire48, à l’intérieur du cytoplasme50, sur la F-actine51, à l’intérieur du noyau47 et sur le noyauisolé 36. Cependant, la manipulation magnétique des microbilles n’a jamais été utilisée pour appliquer une force mécanique directe sur l’enveloppe nucléaire afin d’étudier la mécanotransduction dans le noyau.

Dans cet article, une technique simple est développée pour délivrer de manière non invasive des microbilles magnétiques dans le cytoplasme et utiliser ces microbilles pour appliquer une force mécanique sur le noyau (Figure 1). Ici, des lignées cellulaires B2B humaines normales conçues par CRISPR / Cas9 qui expriment de manière endogène mNeonGreen21-10/11-marqué YAP sont utilisées pour valider la méthode. YAP est une protéine mécano-sensible, et la translocation de YAP est régulée par le mécano-détection nucléaire 14,28. L’approche knock-in régulée par CRISPR/Cas9 a été choisie pour marquer le YAP endogène avec une protéine fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Bien que l’édition CRISPR soit connue pour avoir une efficacité incomplète et un effet hors cible, les protocoles des publications précédentes ont intégré le tri par fluorescence pour sélectionner l’insertion correcte d’un cadre de lecture ouvert52,53,54. Avec cette couche supplémentaire de sélection, aucun événement de marquage hors cible n’a été observé dans 20+ lignées cellulaires précédemment générées52,53,54,55. Il s’agit d’une construction protéique fluorescente divisée, mais en principe, n’importe quelle étiquette fluorescente exprimable pourrait être utilisable. Cette approche de marquage est supérieure aux méthodes de transgène ou d’anticorps. Premièrement, contrairement à l’expression transgénique, la protéine marquée maintient le dosage du gène en une seule copie et s’exprime dans le contexte physiologique du réseau de régulation des gènes natifs, limitant ainsi les écarts dans la concentration, la localisation et l’interaction des protéines. La méthode de marquage utilisée dans cette étude permet d’atteindre un débit et une efficacité supérieurs d’un ordre de grandeur à ceux du marquage FP complet. Il évite également les défis associés à l’immunofluorescence en raison des artefacts de fixation et de la disponibilité limitée d’anticorps de haute qualité et de haute spécificité. Deuxièmement, l’approche utilisée dans cet article perturbe le moins possible la physiologie cellulaire et permet la révélation en temps réel de tous les YAP endogènes de manière authentique. En revanche, d’autres méthodes transgéniques courantes conduisent souvent à une surexpression de YAP. La distribution artificielle qui en résulte peut potentiellement provoquer une cytotoxicité et affecter la mécano-détection des cellules56,57,58.

Cette étude présente un protocole permettant d’appliquer directement une force sur le noyau par le biais de microbilles magnétiques introduites dans le cytoplasme et de réaliser simultanément une imagerie fluorescente de cellules vivantes. En résumé, les protocoles présentés ici démontrent comment (1) délivrer des microbilles magnétiques dans la cellule à l’extérieur du noyau, (2) manipuler les microbilles pour appliquer une force magnétique sur le noyau, (3) effectuer une imagerie confocale fluorescente des cellules pendant la manipulation et (4) analyser quantitativement le rapport nucléaire / cytoplasme YAP (N / C) tout au long du processus d’application de la force. Les résultats suggèrent que (1) par endocytose, les microbilles magnétiques peuvent être livrées de manière non invasive dans le cytoplasme des cellules B2B en 7 heures (Figure 2 et Figure 3); et (2) la force magnétique quantifiée directement appliquée sur le noyau (Figure 4, Figure 5 et Figure 6) seule peut déclencher divers changements du rapport YAP N/C dans les cellules B2B modifiées par CRISPR/Cas9 (Figure 7 et Figure 8).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Maintenance des cellules B2B conçues par CRISPR/Cas9

  1. Culture de cellules B2B dans une fiole T25 avec RPMI-1640 supplémentée avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine.
  2. Maintenir les cellules B2B dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.
  3. Sous-culture des cellules B2B lorsque la confluence atteint 70% à 80%.
  4. Conservez la lignée cellulaire B2B dans un milieu de culture RPMI-1640 contenant 10 % (v/v) de DMSO dans un congélateur à -80 °C.
  5. Utilisez les cellules B2B avec un nombre de passage inférieur à 10 dans les expériences.

2. Culture cellulaire

  1. Ensemencez les cellules sur une boîte de Petri à fond de verre.
    1. Déplacez le flacon contenant des cellules B2B à l’intérieur de l’incubateur vers l’enceinte de biosécurité.
    2. Retirer le milieu de culture dans le ballon à l’aide d’une pipette d’aspiration munie d’une pompe à vide.
    3. Laver la fiole avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    4. Retirez le PBS à l’aide de la pipette d’aspiration.
    5. Ajouter 0,5 mL de solution de trypsine à 0,05 % pour détacher les cellules du fond du substrat de la fiole.
    6. Mettez la fiole dans l’incubateur pendant 5 min.
    7. Déplacer la fiole dans l’enceinte de biosécurité. Ajouter 5 mL de nouveau milieu de culture dans la fiole et pipeter la solution de haut en bas.
    8. Déposer 50 μL du milieu avec des cellules (300 cellules/μL) sur la boîte de Petri à fond de verre. Ajouter 2 ml de milieu de culture dans la boîte de Pétri.
    9. Placez la boîte de Petri dans l’incubateur. Attendez 12 h pour que les cellules se fixent.
  2. Culture des cellules avec des microbilles magnétiques.
    1. Peser 0,2 g de microbilles de fer carbonyle de diamètre moyen de 7 μm (ci-après appelées microbilles de 7 μm, voir le tableau des matières).
    2. Utilisez une pipette pour suspendre les microbilles dans 1 mL de milieu de culture RPMI-1640.
    3. Apportez la boîte de Petri avec des cellules B2B à l’armoire de biosécurité.
    4. Ajouter 200 μL du milieu contenant des microbilles dans la boîte de Pétri.
      REMARQUE : Ajouter le milieu rapidement pour éviter la précipitation des microbilles.
    5. Remettez la boîte de Petri dans l’incubateur jusqu’à ce que les microbilles soient internalisées par les cellules. Vérifiez l’internalisation toutes les 6 heures pour déterminer le temps optimal d’internalisation pour différentes lignées cellulaires.
    6. Pour vérifier l’internalisation, effectuez une imagerie confocale par fluorescence pour visualiser la limite microbille, nucléaire et cellulaire. Si la microbille est internalisée par la cellule, elle sera à l’intérieur des limites cellulaires.

3. Visualisation du noyau

  1. Réchauffer 1,5 mL du milieu de culture dans l’incubateur pendant 15 min.
  2. Éteignez la lumière de l’enceinte de biosécurité. Prenez la boîte de Petri qui contient la cellule, le milieu de culture chauffé, la coloration nucléaire et le HCl de vérapamil dans l’armoire de biosécurité.
    NOTE: Les composants de coloration nucléaire sont sensibles à la lumière. Évitez l’exposition à la lumière pendant le fonctionnement.
  3. Diluer la coloration nucléaire 1000x par DMSO à 100x.
  4. Diluer 100 mM de vérapamil HCl par DMSO à 10 mM.
  5. Ajouter 15 μL de colorant nucléaire 100x et 15 μL de 10 mM de vérapamil HCl à 1,5 mL de milieu de culture. Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
  6. Retirer le milieu de culture de la boîte de Pétri. Ajouter le milieu de culture contenant la coloration nucléaire dans la boîte de Pétri.
  7. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant plus de 2 h.

4. Préparation du matériel d’application de la force magnétique

  1. Imprimez en 3D toutes les pièces à l’aide d’acrylonitrile butadiène styrène (ABS) et assemblez-les selon la conception CAO (Figure 1A). La conception CAO est incluse dans le tableau des matériaux.
  2. Utilisez du ruban adhésif double face pour fixer l’aimant au dispositif de déplacement de l’aimant (Figure 1A).
  3. Placez le dispositif de déplacement magnétique à côté de l’étage du microscope. Utilisez les trois boutons pour ajuster l’emplacement spatial de l’aimant jusqu’à ce qu’il puisse se déplacer au-dessus de la boîte de Petri entre 13 mm et 120 mm.
    REMARQUE: Assurez-vous que la limite supérieure de la distance entre l’aimant et la boîte de Petri est aussi grande que possible pour éviter l’application de force indésirable sur les microbilles magnétiques. 120 mm est la valeur maximale dans cette configuration expérimentale. Assurez-vous que l’aimant n’interfère pas avec les parties du microscope, y compris les objectifs et les étages motorisés.
  4. Réglez l’aimant à la position z la plus élevée (à 120 mm).

5. Application de force et imagerie de cellules vivantes

  1. Mise en place de la chambre environnementale pour l’imagerie à long terme
    1. Appliquez une solution d’éthanol à 75% pour stériliser et nettoyer soigneusement la chambre environnementale.
    2. Placez la chambre d’environnement sur la platine motorisée du microscope inversé.
    3. Ouvrez le réservoir de CO 2 et réglez le débit entrant de CO2 à 160 mL/min.
    4. Ajustez la température de la chambre à 44 °C (en haut), 42 °C (bain) et 40 °C (étage).
    5. Ajouter 20 ml d’eau purifiée dans le bain de la chambre environnementale pour maintenir 90% d’humidité.
    6. Sortez la boîte de Petri à fond de verre qui contient les cellules cibles de l’incubateur de culture tissulaire et placez-la dans la chambre.
    7. Appliquez la pince métallique de la chambre d’environnement pour fixer la position de la boîte de Pétri.
      REMARQUE: La boîte de Petri doit être serrée fermement dans la chambre car la force magnétique peut déplacer la boîte si elle n’est pas serrée.
    8. Fermez le couvercle de la chambre.
  2. Optimisation des paramètres d’imagerie
    1. Optimiser la taille du sténopé : Le sténopé bloque les photons flous. Une taille de sténopé plus grande donne plus de photons flous mais une image plus lumineuse. Une taille de sténopé plus petite donne une image plus nette et plus sombre. Assurez-vous d’optimiser la taille du sténopé pour obtenir des images confocales nettes avec le rapport signal sur bruit approprié.
    2. Optimiser l’intensité du laser: L’intensité laser détermine l’intensité de l’excitation et donc l’émission de lumière. La faible intensité laser donne un faible rapport signal sur bruit. Une intensité laser trop élevée provoquera un photoblanchiment. Ajustez l’intensité du laser en conséquence.
    3. Optimiser la taille et les étapes : les étapes et la taille des étapes déterminent le nombre d’images qui seront prises dans une pile Z. Des pas plus petits et plus d’étapes augmenteront la résolution Z-stack, mais augmenteront également le photoblanchiment. Dans cette expérience, une taille de pas de 1 μm a été utilisée pour les cellules avec une hauteur de cellule de ~ 15 μm.
    4. Optimiser le temps d’exposition: Le temps d’exposition détermine combien de temps la cellule sera exposée au laser d’excitation. Un temps d’exposition faible diminuera le rapport signal sur bruit. Un temps d’exposition élevé provoquera un photoblanchiment. Un temps d’exposition de 1 image toutes les 4 s a été utilisé dans cette expérience.
    5. Optimisation des paramètres d’imagerie : modifiez l’un des quatre paramètres de manière itérative et conservez la cohérence des autres paramètres. Chaque fois, mesurez le rapport YAP N/C de chaque image et comparez le changement de rapport YAP N/C pour déterminer le niveau de photoblanchiment. Répétez le processus d’optimisation jusqu’à atteindre un équilibre entre le rapport signal sur bruit, la vitesse d’imagerie et le photoblanchiment.
    6. Définissez les configurations d’imagerie à l’aide des paramètres d’imagerie optimisés pour des paramètres d’imagerie plus rapides pendant les expériences.
      REMARQUE : Les configurations utilisées dans cette étude sont décrites à la section 5.3 des paramètres d’imagerie. Pour optimiser les paramètres d’imagerie des configurations de la section 5.3, utilisez la même méthode qu’à l’étape 5.2.5.
  3. Application à petite force et imagerie confocale
    REMARQUE: Le microscope Nikon Ti2-E a été utilisé pour l’imagerie dans cette étude, et les étapes détaillées pour l’acquisition d’images sont données ci-dessous.
    1. Ouvrez le microscope inversé. Ouvrez l’application logicielle Elements.
    2. Définissez les magnetic_find de configuration. Vérifiez uniquement le canal FITC. Régler PMT HV = 70, Décalage = 0, Intensité laser = 10. Réglez la vitesse de numérisation sur 1 image toutes les 2 s en cliquant sur le bouton 1/2 . Définissez la taille du sténopé sur 1,2 UA en cliquant sur le bouton 1,2 UA . Cette configuration sera utilisée à l’étape 5.3.5.
    3. Définissez magnetic_YAP_Nucleus de configuration. Vérifiez le canal FITC. Régler PMT HV = 70, Décalage = 0, Intensité laser = 10. Réglez la vitesse de numérisation sur 1 image toutes les 4 s en cliquant sur le bouton 1/2 . Définissez la taille du sténopé sur 1,2 UA en cliquant sur le bouton 1,2 UA . Pour imager la limite du noyau et l’intensité de la coloration nucléaire, vérifiez le canal Cy5. Régler PMT HV = 70, Décalage = 0, Intensité laser = 10. La taille du sténopé est optimisée pour l’imagerie 3D YAP. Ne cliquez plus sur le bouton 1.2 A.U . après avoir vérifié le canal Cy5. Cette configuration sera utilisée à l’étape 5.3.7.
    4. Activez DIA via Elements si nécessaire. Ouvrez SpinView, utilisez un champ clair et ajustez la mise au point de l’objet pour obtenir une image nette des cellules. Utilisez un objectif 10x pour trouver plusieurs cellules individuelles appropriées dans trois conditions : avec une seule microbille à l’intérieur, avec plusieurs microbilles à l’intérieur et sans microbilles à l’intérieur. Passez à l’objectif 40x. Nommez ce poste avec le numéro de poste approprié.
    5. Éléments ouverts. Cliquez sur magnetic_find. Cliquez sur le bouton Supprimer le verrouillage.
    6. Cliquez sur Numériser et réglez la position Z du plan focal. Cliquez sur les boutons Haut et Bas pour définir la limite inférieure et supérieure de la pile Z des cellules sélectionnées. Arrêtez l’analyse en cliquant à nouveau sur Analyser .
    7. Passez à la configuration magnetic_YAP_Nucleus . Définissez le nom de fichier sur before_small_force.nd2. Cliquez sur le bouton Exécuter avec la pile Z enregistrée.
    8. Passez sur le bon chemin lumineux et activez DIA. Ouvrez SpinView et cliquez sur le bouton Enregistrement . Pendant ce temps, faites tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant pour déplacer l’aimant jusqu’à 46 mm au-dessus du fond de la boîte de Pétri. Enregistrez une séquence d’images ou une vidéo en champ clair. Regardez la vidéo pour confirmer que les microbilles montrent un déplacement induit par la force magnétique.
    9. Répéter les étapes 5.3.5 à 5.3.7; Définissez le nom de fichier sur after_small_force.nd2.
    10. Passez sur le bon chemin lumineux et activez DIA. Ensuite, ouvrez SpinView et cliquez sur le bouton Enregistrement . Pendant ce temps, faites tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant pour déplacer l’aimant jusqu’à 120 mm au-dessus du fond de la boîte de Pétri. Enregistrez une séquence d’images ou une vidéo en champ clair.
    11. Répétez les étapes 5.3.5 à 5.3.7 et définissez le nom de fichier sur before_large_force.nd2.
  4. Application de grande force et imagerie confocale
    1. Retirez le couvercle de la chambre d’environnement pour permettre à l’aimant d’atteindre 13 mm au-dessus du fond de la boîte de Pétri.
    2. Passez sur le bon chemin lumineux et activez DIA. Ouvrez SpinView et cliquez sur le bouton Enregistrement . Pendant ce temps, faites tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant pour déplacer l’aimant jusqu’à 13 mm au-dessus du fond de la boîte de Pétri. Enregistrez une séquence d’images ou une vidéo en champ clair. Regardez la vidéo pour confirmer que les microbilles montrent un déplacement induit par la force magnétique.
    3. Répétez les étapes 5.3.5 à 5.3.7 et définissez le nom de fichier sur after_large_force.nd2.
    4. Passez sur le bon chemin lumineux et activez DIA. Ensuite, ouvrez SpinView et cliquez sur le bouton Enregistrement . Pendant ce temps, faites tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant pour déplacer l’aimant jusqu’à 120 mm au-dessus du fond de la boîte de Pétri. Enregistrez une séquence d’images ou une vidéo en champ clair.
    5. Répéter les étapes 5.3.5 à 5.3.7; Définissez le nom de fichier sur retract_large_force.nd2.
    6. Fermez le couvercle de la chambre environnementale.
  5. Répétez les étapes 5.2 et 5.3 pour plusieurs champs de vision afin d’obtenir plus de données si nécessaire.

6. Traitement d’images et analyse de données

  1. Quantification du rapport YAP N/C
    1. Ouvrez Fiji ImageJ. Ouvrez les images .nd2 prises à l’étape 5.
    2. Cliquez sur Analyser > définir les mesures. Vérifiez la surface, la densité intégrée, la valeur moyenne de gris et les descripteurs de forme.
    3. Utilisez le canal Cy5 pour identifier le noyau. Cliquez sur Freehand Selections pour utiliser l’outil de sélection libre pour définir le noyau. Vérifiez également la macro du masque nucléaire automatique dans ImageJ (voir le tableau des matériaux).
    4. Cliquez sur Analyser > mesurer dans le canal FITC. La valeur mesurée de la moyenne est l’intensité moyenne du YAP nucléaire DN.
    5. Utilisez le canal Cy5 pour identifier le noyau. Utilisez le canal FITC pour identifier la cellule. Cliquez sur Sélections à main levée pour utiliser l’outil de sélection libre afin de sélectionner une région d’intérêt dans le cytoplasme et d’éviter la microbille magnétique. Cette région d’intérêt ne doit pas inclure le noyau.
    6. Cliquez sur Analyser > mesurer dans le canal FITC. La valeur mesurée de la moyenne est l’intensité moyenne cytoplasmique YAP DC.
    7. Calculer le rapport YAP N/C = D N / DC.
  2. Quantification de la forme nucléaire et de l’intensité normalisée de la coloration nucléaire
    1. Ouvrez Fiji ImageJ. Ouvrez les images .nd2 prises à l’étape 5.
    2. Cliquez sur Analyser > définir les mesures. Vérifiez la surface, la densité intégrée, la valeur moyenne de gris et les descripteurs de forme.
    3. Utilisez le canal Cy5 pour identifier le noyau. Cliquez sur Freehand Selections pour utiliser l’outil de sélection libre pour définir le noyau.
    4. Cliquez sur Analyser > mesurer dans le canal Cy5. La valeur mesurée de la moyenne est l’intensité de la coloration nucléaire. La valeur mesurée de Circ. est la circularité nucléaire.
    5. Pour comparer l’intensité de la coloration nucléaire à différents états de force, toute l’intensité de la coloration nucléaire est divisée par l’intensité de la coloration nucléaire en « before_small_force.nd2 » pour générer l’intensité normalisée de la coloration nucléaire.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conception d’un dispositif de déplacement d’aimant et application d’une force magnétique
Pour appliquer une force sur le noyau à travers les microbilles magnétiques, un dispositif de déplacement d’aimant a été conçu et construit pour contrôler la position spatiale de l’aimant. Le dispositif de déplacement de l’aimant contient un cadre central, trois boutons et des rails pour déplacer l’aimant attaché dans les directions x, y et z indépendamment à la résolution spatiale de 1,59 mm par cycle (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’internalisation des microbilles magnétiques (section 2.2) est essentielle parce que les microbilles extracellulaires ne peuvent pas appliquer de force directement sur le noyau. L’application de force et l’imagerie (section 5.3) sont des étapes critiques dans cette expérience, et la force nécessaire pour déformer le noyau et induire des conséquences biologiques significatives pourrait dépendre de l’échantillon. L’amplitude de la force dans cette expérience (0,8 nN et 1,4 nN) peut encore être augmentée pour déclencher la...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il n’y a pas de conflits d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce projet est financé par UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), le UFHCC Pilot Award (X. T. et Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) et UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Nous apprécions sincèrement les discussions intellectuelles et le soutien technique du Dr Jonathan Licht (UFHCC), du Dr Rolf Renne (UFHCC), du Dr Christopher Vulpe (UFHCC), du Dr Blanka Sharma (BME), du Dr Mark Sheplak (MAE & ECE), du Dr Daniel Ferris (BME), du Dr Malisa Sarntinoranont (MAE), du Dr Ashok Kumar (MAE), du Dr Benjamin Keselowsky (BME), du Dr Brent Gila (RSC), du Dr Philip Feng (ECE), Dr Gregory A. Hudalla (BME), Dr Steven Ghivizzani (OSSM), Dr Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr Roger Fillingim (CD-BS), Dr Robert Caudle (OMS), Dr John Neubert (DN-OR), Dr Justin Hiliard (neurochirurgie), Dr Tian He (Université Harvard), Dr Youhua Tan (Université polytechnique de Hong Kong), Dr Jessie L-S Au (Institut de pharmacologie des systèmes quantitatifs), Dr David Hahn (Université de l’Arizona), et l’équipe de soutien de Nikon (Drs Jose Serrano-Velez, Larry Kordon et Jon Ekman). Nous sommes profondément reconnaissants pour le soutien efficace de tous les membres des laboratoires de recherche de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann et Guan et de tous les membres du personnel du département UF MAE.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05 % TrypsineCorning25-051-CI
25 cm2 flaconCorning156340
7-µ ; m diamètre moyen microbilles de fer carbonyleN/AN/A
A1R système confocalNikon
Poudre de fer carbonyle CMBASF30042253Microbilles magnétiques
Milieu de culture (RPMI-1640)Ordinateurde
Dellavec système d’exploitation Windows 10
Chambre environnementale TIZBTokai HitTIZB
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJInstitutes of Health et le Laboratoire d’instrumentation
Boîte de Pétri à fond de verreMatTekP35G-1.5-14-C
AimantK& J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochrome Appareil photoFLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements plate-forme logicielleNikonPlate-forme logicielle
Nucleus mask ImageJ macrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear
masque NucSpot Live 650Biotium#40082Coloration nucléaire
Pénicilline-streptomycineGibco15140122
Phosphate tamponné sérum physiologique (PBS)Gibco10010023
Ti2-E microscope inverséNikon
XYZ mover (fichiers CAD)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
bureau Gibco 11875093 National optique et computationnelle

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