Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

Résumé

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes, un modèle intestinal tridimensionnel, à partir de tissu intestinal fœtal. L’imagerie immunofluorescente de biomarqueurs épithéliaux a été utilisée pour la caractérisation du modèle. L’exposition apicale aux lipopolysaccharides, une endotoxine bactérienne, à l’aide d’une technique de micro-injection a induit une perméabilité épithéliale d’une manière dose-dépendante mesurée par la fuite de dextrane fluorescent.

Résumé

Les entéroïdes dérivés de tissus fœtaux humains apparaissent comme un modèle in vitro prometteur pour étudier les lésions intestinales chez les nouveau-nés prématurés. Les entéroïdes présentent une polarité, composée d’une lumière avec une bordure apicale, de jonctions serrées et d’une couche externe basolatérale exposée aux milieux de croissance. Les conséquences des lésions intestinales comprennent une inflammation des muqueuses et une perméabilité accrue. Tester la perméabilité intestinale chez des sujets humains prématurés vulnérables n’est souvent pas réalisable. Ainsi, un modèle intestinal in vitro dérivé du tissu fœtal est nécessaire pour étudier les lésions intestinales chez les nouveau-nés prématurés. Les entéroïdes peuvent être utilisés pour tester les changements de perméabilité épithéliale régulés par des protéines de jonction serrée. Chez les entéroïdes, les cellules souches intestinales se différencient en tous les types de cellules épithéliales et forment une structure tridimensionnelle sur une matrice membranaire basale sécrétée par les cellules du sarcome de souris. Dans cet article, nous décrivons les méthodes utilisées pour établir les entéroïdes à partir du tissu intestinal fœtal, caractériser les protéines de jonction serrée entéroïdes avec imagerie immunofluorescente et tester la perméabilité épithéliale. Comme la dysbiose bactérienne dominante à Gram négatif est un facteur de risque connu de lésions intestinales, nous avons utilisé le lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine produite par des bactéries à Gram négatif, pour induire la perméabilité des entéroïdes. Le dextrane marqué à la fluorescéine a été microinjecté dans la lumière entéroïde, et les concentrations de dextran en série qui ont fui dans les milieux de culture ont été mesurées pour quantifier les changements de perméabilité paracellulaire. L’expérience a montré que l’exposition apicale au LPS induit une perméabilité épithéliale d’une manière dépendante de la concentration. Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle la dysbiose dominante à Gram négatif contribue au mécanisme des lésions intestinales chez les nouveau-nés prématurés.

Introduction

Les nouveau-nés prématurés sont exposés à une inflammation fréquente et prolongée qui les expose à un risque accru de lésions intestinales entraînant une invalidité à long terme ou la mort¹. La recherche dans ce domaine est mise à l’épreuve par la capacité limitée de mener des expériences sur des nouveau-nés prématurés vulnérables. De plus, le manque de modèles appropriés a entravé l’étude approfondie de l’environnement intestinal prématuré². Les modèles in vitro et in vivo existants n’ont pas réussi à représenter de manière exhaustive l’environnement intestinal humain prématuré. Plus précisément, les lignées cellulaires fœtales épithéliales uniques peuvent ne pas former de jonctions serrées, et les modèles animaux présentent des réponses inflammatoires et immunologiques différentes de celles des nouveau-nés prématurés humains. Avec la découverte de la signalisation Wnt comme voie principale dans la prolifération et la différenciation des cellules souches de la crypte intestinale et des nouvelles cellules souches tissulaires Lgr5⁺, les organoïdes dérivés du tissu intestinal tels que les entéroïdes et les colonoïdes ont été établis comme modèles in vitro ^3,4,5. Grâce à cette technologie, il est possible de créer et d’utiliser des modèles entéroïdes tridimensionnels (3D) développés à partir de tissus entiers ou d’une biopsie de l’intestin pour étudier les réponses épithéliales à l’environnement intestinal ^6,7.

Contrairement aux lignées cellulaires intestinales typiques cultivées en culture, les entéroïdes présentent une polarité avec une lumière reliée par des protéines de jonction serrée⁸. Cela permet une exposition à la bordure basolatérale dans le milieu de croissance, ainsi qu’une microinjection luminale pour évaluer la bordure apicale. De plus, les entéroïdes présentent des caractéristiques génétiques, physiologiques et immunologiques similaires à celles de l’épithélium^{humain 9,10}. Les entéroïdes dérivés du tissu fœtal permettent d’examiner le rôle de la prématurité sur la fonction épithéliale. Les caractéristiques uniques des entéroïdes peuvent ressembler plus étroitement à l’environnement intestinal prématuré⁹. Les entéroïdes dérivés de tissus peuvent être utilisés pour tester l’intégrité des jonctions serrées sous forme monocouche ou en tant que structures 3D intégrées dans un mélange de protéines de membrane basale solidifiée. Une technique de micro-injection est nécessaire pour cette dernière forme si une exposition apicale est souhaitée. La mesure des réponses épithéliales dans les modèles entéroïdes comprend l’expression génique par séquençage de l’ARN, les biomarqueurs par immunoessai enzymatique (ELISA) ou les techniques d’imagerie avancées. La technique présentée ici offre une autre option réalisable pour mesurer la perméabilité brute par fluorométrie.

Les lésions intestinales chez les nouveau-nés prématurés ont une pathogenèse multifactorielle qui comprend le déséquilibre de la communauté microbienne intestinale. Les entéroïdes peuvent fournir d’excellents modèles pour étudier certains aspects des maladies intestinales prématurées telles que l’entérocolite nécrosante qui impliquent des fonctions épithéliales¹¹. Les entéroïdes présentent des caractéristiques similaires à celles de l’intestin fœtal humain¹⁰. L’exposition des entéroïdes au lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine produite par des bactéries à Gram négatif, dans les milieux de culture en tant qu’exposition basolatérale induit une expression génique qui peut entraîner une inflammation accrue et une perméabilité intestinale⁷. Cette étude vise à évaluer les changements dans la perméabilité épithéliale brute après une exposition apicale à des produits bactériens tels que le LPS. Les résultats peuvent donner un aperçu des interactions microbes-épithéliales impliquées dans la pathogenèse des lésions intestinales. La méthode conçue pour tester la perméabilité brute nécessite une configuration et des compétences en micro-injection.

Protocole

La collecte de tissus humains a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Washington (ID d’étude: STUDY380 et CR ID: CR3603) et réalisée par le Birth Defects Research Laboratory. Le laboratoire de recherche sur les malformations congénitales a été soutenu par le NIH numéro de récompense 5R24HD000836 de l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain. Les échantillons ont été prélevés auprès de participants consentants et envoyés comme étant anonymisés et sans aucune information sur la santé. Les échantillons de l’intestin grêle ont été entreposés dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et postés pendant la nuit au laboratoire de réception.

1. Préparation du réactif

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour obtenir la liste des réactifs et les numéros de catalogue. Les volumes recommandés sont pour une plaque de 6 puits, sauf indication contraire.

1. Préparer de l’albumine sérique bovine (BSA) à 0,1 % en dissolvant 50 mg de poudre de BSA dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 100 μg/mL d’un antibiotique primocine à large spectre pour enduire tous les articles en plastique et les embouts qui entrent en contact avec les tissus ou les entéroïdes.
   1. Pour enrober de BSA, placer les pointes de pipettes non filtrées dans un tube conique de 50 ml avec suffisamment de BSA pour couvrir les pointes, ajouter 1 à 2 mL de BSA pour couvrir la surface de la boîte de Petri ou remplir des tubes coniques de 15 ml avec du BSA pendant au moins 20 à 30 minutes à température ambiante avant utilisation.
2. Préparer le milieu DPBS en mélangeant 50 mL de DPBS avec 100 μg/mL de primocine et 50 μg/mL de gentamicine. Préparer ce milieu avec et sans 2,5 μg/mL d’amphotéricine.
3. Préparer le milieu de croissance entéroïde en mélangeant 2 mL de milieu de croissance organoïde, 100 μg/mL de primocine, 10 μM Y27632 et 2,5 μM CHIR99021. Faire du média frais tous les jours et le réchauffer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C.
   NOTA: Le facteur de dilution pour Y27632 est de 1:250. Pour CHIR99021, diluer la solution mère CHIR à 1:100 dans un milieu chaud, puis à 1:40 dans un milieu de croissance entéroïde pour obtenir une dilution de 1:4000.
4. Préparer le mélange de matrice membranaire basale en ajoutant à la matrice membranaire basale 10 μM Y27632 et 2,5 μM CHIR99021. Faire un total de 285 μL du mélange final de matrice membranaire basale à une concentration de protéines de 8 mg/mL pour un puits d’une plaque de 6 puits.
   REMARQUE: La matrice de membrane de base doit être glacée pour rester sous forme liquide et se solidifiera à des températures plus chaudes. La concentration en protéines de la matrice membranaire basale mère détermine le volume requis pour obtenir une concentration finale de protéines de 8 mg/mL à l’aide de l’équation suivante :
   Volume 1 × Concentration 1 = Volume 2 × Concentration 2
5. Préparer le paraformaldéhyde (PFA) à 4 % en diluant le PFA à 32 % dans du PBS de 1:8 et conserver à température ambiante. Faire 0,5 mL pour chaque puits d’entéroïdes à fixer.
6. Préparez un tampon de blocage en ajoutant 5% de sérum de chèvre et 0,5% de Triton X-100 dans du PBS. Préparer 1 mL pour le premier anticorps par puits et 0,5 mL pour l’anticorps supplémentaire par puits.
   REMARQUE : Utilisez du sérum de la même espèce que l’hôte des anticorps secondaires.
7. Préparer des anticorps primaires et secondaires, dilués dans un tampon de blocage à la concentration recommandée par le fabricant pour chaque anticorps.
8. Préparer 5 μg/mL de Dmidino-2-phénylindole (DAPI) en diluant à 1:200 à partir de 1 mg/mL de solution mère dans du PBS. Faire 0,5 mL par puits d’entéroïdes colorés.
9. Préparer 70% de glycérol dans PBS et faire 0,5 mL pour monter les entéroïdes sur des lames de microscope.
10. Préparer 5 mg/mL de dextran-FITC (fluorescéine-isothiocyanate) en diluant la solution mère à 25 mg/mL dans du PBS dans un rapport de 1:5. Faire 20 μL pour la micro-injection.
11. Préparer les lipopolysaccharides (LPS) et le dextran-FITC en reconstituant la poudre de LPS dans du PBS en une solution mère à 5 mg/mL. Diluer les solutions mères de LPS et de dextran dans du PBS à 0,1 mg/mL et 0,5 mg/mL de LPS et 5 mg/mL de dextran-FITC. Faire 20 μL pour la micro-injection.
12. Préparer l’acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N',N'-tétraacétique (EGTA) en faisant une solution mère de 0,2 M en dissolvant la poudre d’EGTA dans de l’eau distillée et en ajustant le pH à environ 8 à l’aide d’acide chlorhydrique (HCl). Préparer une concentration d’essai de 2 mM dans des milieux de culture en effectuant une dilution de 1:100.

2. Prélèvement de spécimens

1. Une fois les échantillons reçus, effectuer l’isolement et le placage des cellules épithéliales dans les 24 heures suivant le prélèvement de l’échantillon.

3. Placage des cellules épithéliales intestinales dans la matrice membranaire basale à partir d’échantillons entiers

REMARQUE: Cette procédure suit les protocoles modifiés du Laboratoire de modélisation tissulaire translationnelle de l’Université du Michigan^12,13,14. L’utilisation de milieux de croissance avec un facteur Wnt élevé donne des résultats cohérents pour l’établissement entéroïde. Une fois les entéroïdes établis, utilisez le même milieu avec un facteur Wnt élevé pour conduire les entéroïdes à des formes sphériques pour la micro-injection.

1. Transférer les segments intestinaux dans une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm avec du DPBS glacé avec de l’amphotéricine et laisser tremper pendant 20 minutes sur de la glace. Pendant que le tissu trempe, identifiez les régions (duodénum, jéjunum ou iléon) de l’intestin grêle et retirez le tissu conjonctif et les vaisseaux sanguins avec une pince et des ciseaux. Lavez la teneur en lumière au besoin à l’aide d’une petite aiguille de 23 à 25 G et d’une seringue de 3 ml sans perturber l’épithélium.
2. Couper les segments intestinaux en morceaux de 3 à 5 mm à l’aide d’un scalpel et placer 1 à 2 morceaux (pour placage dans un puits d’une plaque de 6 puits) dans une boîte de Petri de 35 mm x 15 mm contenant 0,5 à 1 mL de milieu de croissance organoïde sur de la glace.
3. À l’aide de micro-ciseaux et de pinces à dissection, couper le tube intestinal longitudinalement. Utilisez l’embout de la pince pour gratter les cellules épithéliales du fascia sous un stéréomicroscope 10x. Retirez le fascia et faites tourbillonner le plat pour briser les amas de cellules.
4. Utiliser un embout coupé à pipette de 20 μL pour transférer les cellules et les milieux par incrément de 5 à 10 μL dans le mélange de matrice membranaire basale pour obtenir une solution de 285 μL à une concentration de protéines de la matrice de 8 mg/mL. Monter et descendre lentement 20x pour mélanger les cellules dans la matrice membranaire basale sur la glace à l’aide d’une pointe coupée de 200 μL.
5. Placer cinq bandes de 50 μL du mélange matriciel membranaire de la base cellulaire dans un puits d’une plaque de 6 puits préchauffée conservée sur une brique de mousse chaude. Incuber la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 10 min pour permettre à la matrice membranaire basale de polymériser et de durcir.
6. Ajouter 2 mL du milieu de croissance entéroïde dans le puits des bandes de matrice membranaire basale solidifiées et le remettre à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire. Changez le média quotidiennement pour stimuler la croissance des entéroïdes. Vérifiez quotidiennement la différenciation des cellules souches intestinales au microscope inversé 10x.
7. Après 10-14 jours, passez les entéroïdes dans un puits d’une plaque de 12 puits ou 6 puits, selon la densité entéroïde. Commencez à changer le média tous les deux jours et passez dans un rapport de 1: 2 tous les 5-7 jours que les entéroïdes commencent à se développer.
   1. Enlevez les cellules qui ne se différencient pas en entéroïdes avec la couche matricielle de la membrane basale pendant les passages. Créer un stock congelé d’entéroïdes à faible passage en les congelant dans 80 % de milieux de croissance, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), si nécessaire.

4. Coloration immunofluorescente des entéroïdes

REMARQUE: Le processus de fixation et de coloration prend 3 jours. Dans ce protocole, nous avons fixé et coloré les noyaux (DAPI), les marqueurs épithéliaux (villin, CDX2), le lysozyme, la mucine et les protéines de jonction serrée (claudine 2, claudine 3, occludine, zonula occluden-1) en utilisant un protocole modifié¹⁵. Les images fluorescentes ont été prises par un microscope confocal.

1. Fixage
   NOTE: Ce processus est généralement effectué en même temps que le passage entéroïde ou la procédure de congélation.
   1. Placez la plaque entéroïde sur de la glace. Retirez le milieu de culture et lavez doucement 2x avec du DPBS froid.
   2. Identifier les entéroïdes à fixer et à colorer. Transférez-les dans une plaque de 12 puits en les pipetant soigneusement avec une pointe coupée de 200 μL ou en utilisant une boucle d’inoculation de 1 μL. Placez les entéroïdes dans des puits séparés si une coloration avec différents anticorps doit être effectuée.
   3. Retirez autant de liquide que possible avec un embout de 200 μL sans perturber les entéroïdes. Ajouter 0,5 mL de PFA à 4 % et incuber pendant 30 min à température ambiante. Remuer la plaque de temps en temps pour faciliter le détachement des entéroïdes de la matrice membranaire basale.
   4. Examiner grossièrement pour déterminer le détachement des entéroïdes de la matrice membranaire basale. Aspirer soigneusement et jeter le PFA liquide sans perturber les entéroïdes. Laver avec PBS 3x pour éliminer le PFA et toute matrice résiduelle de membrane basale
      REMARQUE: L’aspiration du liquide sous un stéréomicroscope peut être utile pour éviter les entéroïdes. Les entéroïdes fixes peuvent être conservés dans du PBS à 4 °C jusqu’à 1 mois.
2. Bloquant
   1. Retirez délicatement le PBS résiduel à l’aide d’une pipette de 200 μL, sans perturber les entéroïdes. Ajouter 0,5 mL de tampon bloquant et incuber pendant 2 h à température ambiante.
   2. Retirez et jetez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette de 200 μL, en prenant soin de ne pas perturber les entéroïdes.
3. Coloration des anticorps
   1. Ajouter 500 μL d’anticorps primaire dans un tampon de blocage à chaque puits contenant des entéroïdes. Pour les anticorps primaires et pour le lysozyme, le facteur de dilution est de 1:100, pour CDX2 le facteur de dilution est de 1:100 et pour la villosline, le facteur de dilution est de 1:50. Incuber à 4 °C pendant une nuit.
   2. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez 3x avec du PBS. Prévoir 10 à 15 minutes de temps d’incubation pour chaque lavage.
   3. Répétez les étapes 4.3.1.-4.3.2. pour l’anticorps secondaire avec un facteur de dilution de 1:400.
   4. Ajouter 500 μL de DAPI à 5 μg/mL dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 15 min. Après l’incubation, laver 3x avec PBS et prévoir 10-15 min de temps d’incubation pour chaque lavage
4. Montage
   1. Supprimez autant de PBS que possible. Lavez les entéroïdes colorés avec 70% de glycérol 1x.
   2. Soulevez les entéroïdes hors de la plaque à l’aide d’une boucle d’inoculation de 1 μL ou d’une pointe coupée de 200 μL et montez avec 70% de glycérol sur une lame de microscope en verre.
   3. Pour préserver la structure 3D des entéroïdes, assurez-vous d’un espace de 0,5 à 1 mm entre la lame de verre inférieure et la lamelle de couverture. Utilisez des découpes de fine feuille de caoutchouc de silicone ou de couvercle en verre pour créer un espace entre la lame de verre et la lamelle de couverture. Les entéroïdes peuvent maintenant être imagés avec un microscope confocal.

5. Préparation pour micro-injection d’entéroïdes

REMARQUE : Le protocole de microinjection est un protocole modifié de Hill et ^coll.16 pour s’adapter aux ressources et au contexte. Certaines des étapes de préparation doivent être complétées quelques jours à l’avance.

1. Configuration de la configuration de la micro-injection
   1. Installer l’appareil de micro-injecteur soit à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, soit sur un comptoir propre, selon l’objectif des expériences, comme suit: un stéréomicroscope pour la visualisation, un micromanipulateur avec des nobs de contrôle des axes X, Y et Z montés sur un support lourd à côté du microscope, un support de micropipette monté sur le bras du micromanipulateur, un tube de micro-injecteur reliant le support de micropipette et une seringue avec un robinet d’arrêt à trois voies, puis à une pompe pneumatique et à une source d’air murale connectée à la pompe (Figure 1).
   2. Désinfecter l’appareil de micro-injection avec de l’éthanol à 70 % avant et après l’utilisation expérimentale. Testez le positionnement du microscope et du micromanipulateur pour qu’il corresponde aux spécifications physiques souhaitées, y compris en déplaçant les boutons d’axe pour vous assurer que la micropipette peut atteindre l’échantillon ciblé.
2. Préparation de la micropipette
   Remarque : Effectuez ces étapes à l’avance.
   1. Utilisez un extracteur de micropipettes pour tirer les tubes capillaires en verre dans les micropipettes.
   2. Sous le stéréomicroscope, placez la micropipette sur un support de micropipette horizontal (Figure 2), concentrez-vous sur les pointes et coupez les pointes à l’aide d’une paire de micro-ciseaux tout en regardant à travers les oculaires du microscope. Préparez environ 10 à 15 micropipettes à une pointe de taille similaire pour chaque expérience.
   3. Testez la taille de la pointe en tirant vers le haut 0,5-1 μL de liquide et comptez combien de pompes sont nécessaires pour vider le volume. Testez plusieurs tailles de pointe pour trouver la taille appropriée pour l’expérience. Une taille de pointe appropriée éjecte environ 10 à 30 nL de volume par pompe.
   4. Conservez les micropipettes en verre coupé dans une boîte ou un tube propre sans endommager les embouts.
      REMARQUE : Les micropipettes prédécoupées sont disponibles dans le commerce.
3. Préparation entéroïde
   1. Placez une assiette composée principalement d’entéroïdes gros et sphériques sur de la glace. Remplacez l’ancien milieu de croissance par un milieu frais.
   2. Dissociez délicatement les points de la matrice de la membrane basale de la plaque à l’aide d’un élévateur de cellule. Faites tourbillonner les points de gel d’un côté à l’autre sur la glace pour briser la matrice de la membrane basale sans déranger les entéroïdes.
   3. Sélectionner environ 10 à 15 entéroïdes sphériques avec une pointe de pipette coupée de 20 μL au microscope stéréoscopique et les ajouter à la matrice membranaire basale pour obtenir 285 μL de mélange de concentration de protéines de 8 mg/mL.
   4. Pipeter doucement de haut en bas avec une pointe coupée de 200 μL pour mélanger les entéroïdes sans les casser. Plaquez cinq points de gel de 50 μL au centre d’une boîte de Petri ronde de culture cellulaire de 35 mm x 10 mm ou d’une boîte de Pétri de dimensions similaires.
   5. Incuber les points de gel entéroïde à 37 °C pendant 10 min pour les solidifier. Ensuite, ajoutez 1 mL de milieu de croissance frais dans le plat. Incuber les entéroïdes pendant au moins 2-3 jours pour la stabilisation et jusqu’à ce que les entéroïdes atteignent une taille appropriée de 0,5-1 μL.
      NOTE: Il est important d’avoir une boîte avec une paroi basse pour un accès plus facile aux entéroïdes et un petit diamètre pour moins de volume de milieu de croissance.
4. Microinjection de dextran-FITC et de matériel testé
   1. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies vers la pompe pneumatique. Remplissez la micropipette avec le matériau injecté, dans ce cas dextran-FITC avec ou sans LPS.
   2. Préparez une boîte de Petri recouverte d’une bande de film transparent. Placez deux à quatre points de 1 μL de matériau injecté sur le film.
   3. Utilisez le micromanipulateur pour conduire l’extrémité de la micropipette juste à l’intérieur du liquide, mais au-dessus du film sous la visualisation d’un stéréomicroscope. Tirez doucement sur la seringue pour retirer le matériau injecté dans la micropipette.
   4. Remplissez la micropipette avec 2-4 μL de matériau injecté et appuyez sur la seringue pour éliminer tout air à l’extrémité de la micropipette. Inspectez la colonne de matériau injecté dans la micropipette pour vous assurer qu’il n’y a pas de poche d’air. Notez le volume de matière injectée qui s’est retirée à l’intérieur de la micropipette.
      REMARQUE: Le liquide est visible dans une couleur verdâtre en raison de dextran-FITC.
   5. Allumez la source d’air connectée à la pompe pneumatique, qui fournit une pression d’air d’environ 60 psi. Allumez la pompe et réglez la durée de la pompe sur 10-15 ms. Tournez le robinet d’arrêt de la seringue pour ouvrir la conduite de la pompe à la micropipette.
      REMARQUE: La durée plus longue de la pompe permet de libérer plus de matériau par pompe. Il est recommandé d’utiliser la même durée de pompe et des micropipettes avec des tailles d’embout similaires pour toute l’expérience pour estimer le volume injecté.
   6. Retirez les entéroïdes de l’incubateur de culture cellulaire et placez les plats sur une brique de mousse chaude dans un récipient couvert pour limiter l’exposition à la lumière après la micro-injection.
   7. Placez la boîte de Petri avec entéroïdes sous le stéréomicroscope et déplacez les boutons du micromanipulateur pour placer l’extrémité de la micropipette à un angle d’environ 35°-45° par rapport à la surface horizontale (Figure 3). Cela nécessite une certaine pratique à l’avance.
   8. Visualisez et cartographiez les entéroïdes dans chaque boîte de Petri au microscope pour faire un plan pour injecter environ 3-5 entéroïdes sphériques par boîte.
   9. Une fois que l’extrémité de la micropipette est proche de la surface du liquide, regardez dans les oculaires du microscope pour avancer la pointe vers l’entéroïde ciblé.
   10. Percez l’entéroïde avec la pointe de la micropipette en avançant le bouton de l’axe z à l’aide d’un mouvement lent précis. La paroi entéroïde va s’enfoncer et revenir une fois que la pointe traverse la surface entéroïde, après quoi l’avancement devrait s’arrêter.
   11. Appuyez sur la pédale de pompe avec un pied et remplissez l’entéroïde avec la solution verdâtre de dextran-FITC jusqu’à ce qu’elle soit légèrement dilatée. Noter le nombre de pompes pour calculer le volume pompé et la concentration de dextran.
   12. Retirez l’embout de la micropipette après avoir terminé la micro-injection et passez à l’entéroïde suivant. Avec de la pratique, le processus peut se dérouler sans heurts.
       1. Si l’embout se casse, remplacez-le par une autre micropipette avec une taille d’embout similaire. Tirez suffisamment de volume de matière injectée pour tous les entéroïdes du même groupe d’exposition et changez la micropipette entre les matières injectées pour éviter la contamination croisée.
   13. Placez le plat entéroïde injecté sous le couvert pour éviter l’exposition à la lumière.
5. Collecte et mesure Dextran-FITC
   1. Après la procédure de micro-injection, retirez immédiatement le milieu de culture. Laver avec un milieu de croissance frais 2x pour éliminer tout résidu de dextran-FITC. Ajoutez un nouveau média et enregistrez le temps comme temps 0 après la micro-injection.
      REMARQUE: Vous aurez peut-être besoin d’une deuxième personne pour effectuer cette étape sans perturber le processus de micro-injection.
   2. Prélever 200 μL de milieu de culture dans un tube opaque de 0,5 mL, puis remplacer le milieu de culture retiré par le même volume de milieu de culture frais à 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h et 12 h après les microinjections.
      Remarque : L’intervalle de temps peut varier en fonction de l’expérience. En cas d’exposition basolatérale, le milieu de remplacement doit contenir l’exposition à la même concentration.
   3. Conserver les milieux de culture collectés à 4 °C et mesurer la concentration de dextrane en 24 h. Conservez les milieux restants à −80 °C pour d’autres analyses. À la fin de la collecte des milieux de culture, récoltez les entéroïdes pour l’extraction ou l’imagerie de l’ARN, si nécessaire.
   4. Mesurez les concentrations de dextran-FITC à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence. Construire une courbe standard pour chaque plaque en utilisant des dilutions en série et en ajustant une droite de régression linéaire comme le montre la figure 4.
   5. Corriger l’absorbance du volume retiré des milieux de culture contenant du dextrane qui a été remplacé par un milieu de croissance frais sans dextran comme suit : l’élimination de 200 μL sur 2 mL de milieu de culture représente 10 % en volume.
      Absorbance corrigée à 2 h = (absorbance à 1 h x 10%) + absorbance mesurée à 2 h
      L’absorbance du premier milieu corrigé n’a pas besoin de correction. Ensuite, calculez la concentration de dextrane à partir de la valeur d’absorbance corrigée à l’aide de l’équation de la courbe standard.
   6. Pour la normalisation, diviser la concentration de dextrane par le nombre total de pompes pour chaque boîte de Pétri, puis multiplier par le plus grand nombre total de pompes par boîte.
      NOTE: Toutes les expositions sont effectuées en trois exemplaires (trois boîtes de Petri par exposition avec 3 à 5 entéroïdes micro-injectés par boîte). Les valeurs moyennes des triplicates sont comparées entre les expositions à l’aide d’un test t de Student.

Résultats

Nous avons établi une lignée cellulaire entéroïde à partir de tissus fœtaux iléon donnés en suivant des protocoles modifiés fournis par nos collaborateurs du Translational Tissue Modeling Laboratory¹² de l’Université du Michigan. La lignée cellulaire entéroïde a été testée négative pour l’infection à Mycoplasma . Les entéroïdes ont été colorés positifs pour la villine, la CDX2, le lysozyme, la mucine, la claudine, l’occludine et la zonula-occludène 1 (Figure 5), confirmant leur origine épithéliale de l’intestin grêle. Les entéroïdes ont été micro-injectés avec 4 kDa dextran-FITC à 5 mg/mL dans du PBS (figure 6). Les expositions à l’essai étaient le LPS à différentes concentrations, 0,1 mg/mL et 0,5 mg/mL, mélangé avec du dextran-FITC pour l’exposition apicale. Comme témoin positif, nous avons utilisé 2 mM d’EGTA et l’avons ajouté au milieu de culture 4 h après la micro-injection de dextran. L’EGTA est un chélateur du calcium qui augmente la perméabilité des jonctions serrées. Les témoins négatifs ont été micro-injectés avec du dextran-FITC dans PBS seul. Pour l’exposition basolatérale, le milieu de remplacement pour la collecte de milieux de culture en série avait la même concentration de l’exposition (c.-à-d. 2 mM EGTA). Les résultats montrent une nette augmentation de la concentration de dextran dans les milieux de culture après l’ajout d’EGTA par rapport au témoin négatif, PBS. L’exposition apicale au LPS a induit une perméabilité plus élevée du dextrane environ 8 heures après l’exposition d’une manière dépendante de la concentration (figure 7).

Figure 1 : Configuration du micro-injecteur. La configuration comprend un stéréomicroscope, un micromanipulateur monté sur un support magnétique sur une lourde plaque de base en acier, un porte-micropipette connecté à une seringue avec un robinet d’arrêt à trois voies et une pompe pneumatique. L’alimentation en air mural fournit la pression d’air, qui est régulée par la pompe pour générer un volume de pompe constant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Support de micropipette horizontal. Cette plate-forme en plastique est conçue pour maintenir la micropipette après avoir tiré du tube capillaire en verre pour couper la pointe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Positionnement de la micropipette. Un angle de 35°-45° est idéal pour l’injection d’entéroïdes situés au milieu de la boîte de Pétri. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Courbe standard de Dextran. La courbe a été construite avec une absorbance fluorescente de 10 dilutions en série de dextrane en doubles. Une droite de régression linéaire a été ajustée pour générer une équation de régression. Les barres d’erreur sont SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Biomarqueurs fluorescents des entéroïdes. DAPI pour la coloration du noyau est bleu. Les biomarqueurs suivants sont représentés : (A) villine, (B) CDX2, (C) lysozyme, (D) mucine, (E) claudine, (F) occlusion et (G) zonula-occludène 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6: Entéroïdes à différents stades . (A) Un entéroïde âgé de 7 à 10 jours est petit et avec une paroi épaisse. (B) Un entéroïde prêt pour la micro-injection avec une grande taille, une lumière et une paroi de réflexion, et (C) un dextran-FITC fluorescent à l’intérieur d’un entéroïde 2 jours après la micro-injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Perméabilité du dextran-FITC après micro-injection. (A) Les concentrations mesurées de dextran dans le milieu étaient plus élevées après l’ajout d’EGTA par rapport au PBS. (B) Le LPS microinjecté à 0,5 mg/mL a induit une plus grande fuite de dextrane de la lumière entéroïde dans le milieu que le LPS microinjecté à 0,1 mg/mL à partir de 8 heures après l’injection. *La valeur de p < 0,05, les barres d’erreur sont SEM, n = 3, un test t de Student a été utilisé pour calculer la signification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes à partir de tissu intestinal fœtal, ainsi que la caractérisation du modèle avec coloration immunofluorescente et tests de perméabilité épithéliale. La perméabilité des entéroïdes a été testée à l’aide d’une technique de micro-injection et de mesures en série de la concentration de dextran-FITC qui a fuité dans les milieux de culture. La nouveauté de ce protocole est l’exposition apicale qui ressemble plus à la physiologie intestinale humaine par rapport à l’exposition basolatérale dans les milieux de culture⁷. Dans des études antérieures, Hill et al. ont utilisé l’imagerie en série et le calcul de l’intensité de fluorescence au fil du temps¹⁶. Ares et al. ont exposé la membrane basolatérale d’un modèle épithélial au LPS, puis ont comparé le modèle d’expression génique^{cellulaire 7}. En comparaison, nous utilisons l’exposition apicale des réactifs testés, puis examinons les altérations potentielles de la perméabilité brute en mesurant les concentrations en série de dextrane qui fuient dans les milieux de culture. Notre méthode permet également une analyse comparative en série des cytokines produites par les cellules épithéliales dans les milieux de culture et l’expression génique en collectant de l’ARNm cellulaire. Le LPS a été couramment utilisé pour étudier les lésions intestinales dans des modèles animaux et in vitro en raison de sa capacité à induire la perméabilité et l’inflammation ^7,17. Lorsque le LPS a été testé dans ce modèle, la perméabilité épithéliale a été différenciée en fonction de la concentration d’exposition. Ce protocole peut être étendu pour étudier d’autres pathologies pathologiques en utilisant différents matériaux microinjectés et mesures de résultats.

Les étapes critiques de ce protocole comprennent l’établissement des entéroïdes à partir de tissus intestinaux fœtaux, la caractérisation des entéroïdes et la technique de micro-injection. L’intégrité de cette étude dépend d’un échantillonnage cellulaire précis. L’utilisation de repères anatomiques et de vaisseaux sanguins est utile pour assurer la sélection des cellules de l’intestin grêle. En raison de la croissance robuste et de la différenciation des cellules souches intestinales fœtales, une procédure extensive pour isoler les cellules souches d’autres cellules épithéliales n’est pas nécessaire. Une fois les entéroïdes établis, il est important de confirmer les caractéristiques du modèle en colorant les protéines et les marqueurs cellulaires. Dans ce protocole, les entéroïdes ont été colorés pour les entérocytes à l’aide de villosline et CDX2, les cellules de Paneth à l’aide de lysozyme et les cellules caliciformes à l’aide de mucine, toutes les cellules qui se trouvent dans l’épithélium de l’intestin grêle^18,19,20. Contrairement aux lignées cellulaires uniques traditionnelles qui présentent un type de cellule, les entéroïdes établissent tous les types de cellules à partir des cellules souches progénitrices intestinales⁸. La partie coloration de ce protocole peut être modifiée pour les marqueurs cellulaires spécifiques d’intérêt. La technique de micro-injection est cruciale pour la fiabilité de ce protocole. La consistance des pointes de micropipettes peut être vérifiée en mesurant le volume par pompe à l’aide de la solution dextran-FITC et en visualisant le diamètre des pointes au microscope. En raison du risque de contamination, la même micropipette ne peut pas être utilisée pour plus d’une exposition. De plus, la forme et la croissance des entéroïdes peuvent être influencées par le contenu de leur milieu de croissance. Nous avons constaté que les entéroïdes sphériques plutôt que les entéroïdes en forme de chou-fleur fournissaient de meilleurs modèles pour la micro-injection. La forme sphérique peut être induite par un facteur Wnt plus important dans le milieu²¹.

Ce protocole dépend en grande partie de l’habileté de l’interprète en micro-injection pour réduire les variations, en particulier dans les mesures sensibles au temps. Les variations peuvent être minimisées en ayant le même interprète expérimenté avec des techniques cohérentes, en utilisant la même origine cellulaire pour éviter la variation génétique, en testant au même passage pour éliminer le biais de maturité et en cultivant les cellules dans le même type de milieu pour une différenciation cellulaire similaire. Les composants du milieu de croissance peuvent induire une différenciation variable des cellules souches in vitro plutôt que dans un environnement in vivo . Par exemple, in vivo, le lysozyme n’est pas exprimé avant les semaines 22-24 du développement gestationnel, lorsque les cellules de Paneth se forment et deviennent fonctionnelles²². Cependant, nous avons pu détecter le lysozyme dans nos entéroïdes établis à partir d’intestins fœtaux de 10 semaines. Cette méthode peut limiter le nombre d’expositions testées en même temps en raison de la haute compétence technique requise pour la micro-injection. La fuite de dextrane du trou de perforation de la microinjection peut affecter l’évaluation de la perméabilité. Pour éliminer cet effet, des lavages triples immédiatement après la micro-injection sont recommandés pour éliminer le dextran résiduel de la procédure. La concentration de dextrane dans le milieu doit être mesurée toutes les heures pendant 4 à 6 heures après la micro-injection. Les expériences présentant une augmentation significative de la concentration de dextrane dans les 2 à 4 heures suivant l’injection doivent être exclues de l’analyse finale.

Cette méthode présente plusieurs avantages. Il nécessite un coût inférieur et moins de ressources par rapport aux monocouches dérivées d’entéroïdes sur transwell. De plus, il peut être étendu à d’autres expositions telles que des bactéries vivantes ou des virus pour étudier l’interaction initiale entre les microbes intestinaux et l’épithélium. La lumière fermée de l’entéroïde peut maintenir une croissance stable des bactéries vivantes microinjectées sans contamination du milieu de croissance¹³. Contrairement à la monocouche exposée aux milieux de croissance et à l’oxygène d’incubation, la lumière fermée est un espace étroit et isolé. Une lumière fermée ne permet aucune communication avec le milieu de croissance et une teneur en oxygène luminal qui diminue avec le temps avec la croissance bactérienne vivante¹³.

L’utilisation de tissus intestinaux fœtaux représente plus précisément l’épithélium intestinal des nouveau-nés prématurés par rapport aux cellules souches intestinales adultes ou aux modèles animaux⁷. De plus, la polarité des entéroïdes permet à la fois des expositions et des mesures apicales et basolatérales²³. Les entéroïdes forment une lumière fermée avec une concentration d’oxygénation plus faible, qui imite plus étroitement la concentration d’oxygénation des intestins²⁴. Contrairement aux protocoles plus avancés sur le plan technologique¹⁶, l’utilisation de mesures du milieu brut permet une plus grande accessibilité de cette technique. L’expérience a démontré que la fuite épithéliale peut être induite par l’exposition apicale au LPS et dépend de la concentration. Étant donné que cette méthode examine les changements dans la concentration de dextrane qui fuit, elle est utile pour détecter les changements fonctionnels bruts dans les jonctions serrées. La collecte et le séquençage de l’ARN messager des entéroïdes exposés et l’analyse par transfert Western peuvent compléter l’analyse des changements fonctionnels bruts. Ce modèle étudie l’intégrité de l’épithélium intestinal dans un système qui ressemble beaucoup à l’environnement prématuré et, par conséquent, peut être utilisé pour mieux comprendre les lésions intestinales prématurées et d’autres pathologies pathologiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amphotéricine 250 uL/mL	Gibco	15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0,5mL concentré souris, IgG, monoclonal	Biogenex	MU392A-5UC
Anticorps anti-Claudin 2 (ab53032)	abcam	ab53032
Anticorps anti-Claudin 3 (ab15102)	abcam	ab15102
Anticorps anti-LYZ produit chez le lapin	Millipore Sigma	HPA066182-100UL
Anticorps anti-mucine 2/MUC2 (F-2) : sc-515032	Santa Cruz	sc-515032
Anti-Villin, clone VIL1/4107R 0,5 ml concentré Lapin, IgG, monoclonal	Biogenex	NUA42-5UC
Albumine sérique bovine (BSA)	Millipore Sigma	A8806
Plaques de culture cellulaire, CytoOne 12 puits non traités  ;	USA Scientific Inc	50-754-1395
Plaques de culture cellulaire, plaques non traitées CytoOne 6 puits  ;	USA Scientific Inc	50-754-1560
Centrifugeuse avec seaux tubulaires de 15 mL	Eppendorf  ;	05-413-110
CHIR 99021	Tocris Bioscience	4423
Microscope confocal.	Olympus FV1200	N/A	Ou un microscope similaire
Tubes à centrifuger coniques, 15 ml	Falcon	05-527-90
Verre de protection pour lames de microscope	Fisher Scientific	12-544-DP
Scalpels jetables	Mopec	22-444-272
Solution de dmidino-2-phénylindole (DAPI) (1 mg/mL)	Fisher Scientific	62248
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, 1X)	Fisher Scientific	AAJ67802K2
Ethylene glycol-bis(&beta ;-aminoethyl ether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-sel tétrasodique d’acide tétraacétique (EGTA)	Millipore Sigma	E8145-10G
Fluorescéine isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa	Millipore Sigma	46944
Lecteur de	microplaques FuorescenceAgilent BioTek	Synergy HTX
Gentamicin 50 mg/mL	Gibco	15-750-060
Tubes capillaires en verre, borosilicate à baril unique, 1x0,5mm, 6" (coupé en deux avant de tirer)	Systèmes A-M	626500
Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 594	Fisher Scientific	A32742
Anticorps secondaire anti-lapin IgG (H+L) hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 488	Fisher Scientific	A32731
chèvre	Fisher Scientific	16210064
ImageJ software	NIH	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stem Cell  ; Technologies	; 06010
Lipopolysaccharides de  ; Escherichia coli  ; O111 :B4	Millipore Sigma	L4391-1MG
Support magnétique	World Precision Instruments  ;	M10
Matrigel Matrice de membrane basale, sans LDV, 10 mL  ;	Corning	354234	concentration en protéines > 9 mg/mL de préférence
Micro-pince	Fisher Scientific	13-820-078
Micro-ciseaux	Fisher Scientific	08-953-1B
Micromanipulateur	World Precision Instruments  ;	M3301
Extracteur de micropipettes	World Precision Instruments  ;	SU-P1000	Ou un équipement similaire
Lames de microscope	Fisher Scientific	22-034486
Occludine Anticorps polyclonal	Fisher Scientific	; 71-1500
Paraformaldéhyde 32 % solution aqueuse	ELECTRON  ; MICROSCOPY SCIENCES	RT 15714
Boîtes de Pétri, 35x10 mm	Fisher Scientific	150318
Boîtes de Pétri, 60x15 mm	Fisher Scientific	12-565-94
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher Scientific	10010031
Pédale PicoPump	World Precision Instruments	3260
Pointes de pipette, non filtrées, 1000 uL	Fisher Scientific	21-402-47
Pointes de pipette, non filtrées, 20 uL	Fisher Scientific	21-402-41
Pointes de pipette, non filtrées, 200 uL	Fisher Scientific	21-236-54
Système pneumatique PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820	ou un système de picopompe similaire
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml flacon	InvivoGen	ant-pm-1
Plaque de base en acier	World Precision Instruments	5052
Stéréomicroscope	Zeiss stemi 350		Ou un microscope similaire
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks	Sonoco	03-531-53
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Alimentation en air mural	N/A	/A
Chlorhydrate d’y-27632	Tocris Bioscience	1254
ZO-1 Anticorps polyclonal	Fisher Scientific	61-7300