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Article de méthode

Construction d’un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour récapituler la contrainte biomécanique dans la paroi aortique

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DOI :

10.3791/64122

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6 juillet 2022

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1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Institutes of Biomedical Sciences and the Shanghai Key Laboratory of Medical Epigenetics, Shanghai Medical College, Fudan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous avons développé un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour reproduire la souche biomécanique in vivo des cellules musculaires lisses dans la paroi aortique humaine.

Résumé

Des techniques conventionnelles de culture cellulaire bidimensionnelle et des modèles animaux ont été utilisés dans l’étude de l’anévrisme et de la dissection de l’aorte thoracique humaine (TAAD). Cependant, le TAAD humain ne peut parfois pas être caractérisé par des modèles animaux. Il existe un écart apparent entre les études cliniques sur les humains et les expériences sur les animaux qui peut entraver la découverte de médicaments thérapeutiques. En revanche, le modèle de culture cellulaire conventionnel est incapable de simuler des stimuli biomécaniques in vivo . À cette fin, les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui reproduisent le microenvironnement biomécanique. Dans cette étude, un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-on-a-Chip) a été développé pour simuler les paramètres physiopathologiques de la biomécanique aortique, y compris l’amplitude et la fréquence de la déformation cyclique subie par les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) qui jouent un rôle vital dans TAAD. Dans ce modèle, la morphologie des HASMC est devenue allongée, alignée perpendiculairement à la direction de la déformation et présentait un phénotype plus contractile dans des conditions de déformation que dans des conditions conventionnelles statiques. Cela était cohérent avec l’orientation cellulaire et le phénotype dans les parois aortiques humaines natives. De plus, en utilisant des TAAD liés à la valve aortique bicuspide (BAV-TAAD) et des HASMC primaires dérivés des patients liés à la valve aortique tricuspide (TAV-TAAD), nous avons établi des modèles de maladie BAV-TAAD et TAV-TAAD, qui reproduisent les caractéristiques HASMC dans TAAD. Le modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro complémentaire aux modèles animaux pour explorer davantage la pathogenèse du TAAD et découvrir des cibles thérapeutiques.

Introduction

L’anévrisme et la dissection de l’aorte thoracique (TAAD) sont une dilatation ou une délamination localisée de la paroi aortique associée à une morbidité et une mortalité élevées1. Les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse du TAAD. Les HASMC ne sont pas des cellules différenciées en phase terminale, et les HASMC conservent une plasticité élevée, ce qui leur permet de changer de phénotype en réponse à différents stimuli2. Les HASMC sont principalement soumis à une contrainte de traction rythmique in vivo, et c’est l’un des facteurs clés régulant les changements morphologiques des muscles lisses, la différenciation et les fonctions physiologiques 3,4. Par conséquent, le rôle de la déformation cyclique dans l’étude des HASMC ne peut être ignoré. Cependant, les cultures cellulaires 2D conventionnelles ne peuvent pas reproduire la stimulation biomécanique de la souche cyclique subie par les HASMC in vivo. De plus, la construction d’un modèle TAAD animal ne convient pas à certains types de TAAD, tels que le TAAD lié à la valve aortique bicuspide (BAV). De plus, l’écart entre les études cliniques sur l’homme et l’expérimentation animale ne peut être ignoré. Elle entrave la traduction pharmaceutique dans la pratique clinique. Ainsi, il existe un besoin urgent de systèmes physiologiques plus complexes pour simuler l’environnement biomécanique in vivo dans la recherche sur les maladies de l’aorte.

Les expériences sur les animaux utilisées dans la recherche biomédicale et le développement de médicaments sont coûteuses, longues et éthiquement discutables. En outre, les résultats des études animales ne permettent souvent pas de prédire les résultats obtenus dans les essais cliniques chez l’homme 5,6. L’absence de modèles précliniques humains et le taux élevé d’échec dans les essais cliniques ont entraîné peu de médicaments efficaces pour la clinique, ce qui a augmenté les coûts des soins de santé7. Il est donc urgent de trouver d’autres modèles expérimentaux pour compléter les modèles animaux. Les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui remédient aux inconvénients des techniques traditionnelles de culture cellulaire 2D et établissent un modèle in vitro plus réaliste, peu coûteux et efficace pour les études physiologiques et le développement de médicaments. À l’aide de dispositifs microfluidiques, des organes sur puce sont établis pour cultiver des cellules vivantes dans des chambres de taille micrométrique avec différents stimuli pour reproduire les fonctions clés d’un tissu ou d’un organe. Le système se compose d’un ou de plusieurs microcanaux microfluidiques, avec soit un type de cellule cultivée dans une chambre perfusée répliquant des fonctions d’un type de tissu, soit différents types de cellules cultivées sur des membranes poreuses pour recréer des interfaces entre différents tissus. Les organoïdes microfluidiques combinés à des cellules dérivées de patients ont l’avantage unique de combler la grande différence d’espèces entre les modèles de maladies de souris et d’humains et de surmonter les inconvénients de la culture cellulaire 2D traditionnelle pour la recherche sur le mécanisme de la maladie et la découverte de médicaments. Avec le développement rapide de la microfluidique au cours des dernières années, les chercheurs ont réalisé l’utilité des modèles in vitro d’organes sur puce (OOC) répliquant des paramètres biologiques complexes in vivo 8. Ces organoïdes microfluidiques simulent des environnements biomécaniques in vitro, tels que la déformation cyclique, la contrainte de cisaillement et la pression du liquide, fournissant un environnement de culture cellulaire tridimensionnel (3D). À ce jour, plusieurs modèles OOC ont été établis pour simuler des stimuli biomécaniques dans des organes tels que le poumon9, le rein 10, le foie11, l’intestin 12 et le cœur 13, mais ceux-ci n’ont pas été largement appliqués à l’étude de la maladie aortique humaine.

Dans cette étude, nous présentons un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ On-A-Chip) qui peut contrôler les forces et les rythmes mécaniques biomimétiques appliqués aux HASMC primaires dérivés du patient TAAD. La puce se compose de plaques épaisses à trois couches de polydiméthylsiloxane (PDMS) gravées avec des canaux et de deux membranes PDMS hautement flexibles commercialisées. Les HASMC sont cultivés sur les membranes PDMS. Le canal au milieu de la puce est rempli d’un milieu de culture pour la culture cellulaire. Les canaux supérieur et inférieur de la puce sont connectés à un système d’alimentation en pression sous vide qui peut contrôler le rythme et la fréquence de la déformation mécanique de traction des membranes PDMS. La contrainte rythmique subie par les HASMC peut être simulée dans HASMC-OOC, reproduisant le microenvironnement biomécanique des tissus ou des organes qui n’est pas fonctionnellement réalisable avec les systèmes de culture 2D conventionnels. Avec l’avantage de l’imagerie en temps réel à haute résolution et du microenvironnement biomécanique, les activités biochimiques, génétiques et métaboliques des cellules vivantes peuvent être étudiées pour le développement tissulaire, la physiologie des organes, l’étiologie de la maladie, les mécanismes moléculaires et l’identification des biomarqueurs, les maladies cardiovasculaires et les maladies aortiques. Combiné avec des cellules spécifiques aux tissus et aux patients, ce système peut être utilisé pour le dépistage de médicaments, la médecine personnalisée et les tests de toxicité. Ce modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro pour étudier la pathogenèse de la maladie aortique.

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Protocole

Des échantillons aortiques humains ont été utilisés pour l’isolement primaire HASMC sous l’approbation du comité d’éthique de l’hôpital Zhongshan de l’Université Fudan (NO. B2020-158). Des échantillons aortiques ont été prélevés chez des patients ayant subi une chirurgie de l’aorte ascendante à l’hôpital Zhongshan de l’Université Fudan. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients avant la participation.

1. Isolement primaire des cellules musculaires lisses aortiques humaines

  1. Lavez la région latérale droite de l’aorte ascendante avec du PBS stérile, 1x-2x.
  2. Retirez les couches d’intima et d’adventice du tissu à l’aide de deux pinces ophtalmiques et conservez la couche de média pour prélever les cellules.
  3. Placez la couche de média sur un plat de culture de 10 cm et coupez-la en petits morceaux (2-3 mm) avec des ciseaux. Ajouter 5 mL de milieu de culture de cellules musculaires lisses (CMSM) contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.
  4. Déplacez le petit tissu dans le flacon de culture avec un compte-gouttes stérile, en répartissant le tissu uniformément. Jetez le milieu de culture autant que possible, puis retournez la bouteille à l’envers.
  5. Ajouter 2 mL de SMCM dans le flacon de culture inversé et le placer dans l’incubateur (5% CO 2) à 37 °C pendant 1-2 h, puis tourner lentement vers le haut et ajouter encore2 mL de SMCM.
  6. Après 5 à 7 jours d’incubation, remplacez le CMMS par 4 ml de CMMS frais. Généralement, les cellules musculaires lisses sporadiques disparaissent en environ 2 semaines.
  7. Jetez lentement le SMCM et ajoutez-le lentement lorsque vous changez le support. Transporter le flacon de culture lentement lorsque vous vous déplacez vers une station de microscope; Sinon, les tissus flotteront et les cellules se développeront lentement.
  8. Lorsque les cellules atteignent une confluence d’environ 80 %, laver avec 2 mL de PBS, digérer avec 2 mL de trypsine à 0,25 % et les diviser en deux nouvelles bouteilles de culture contenant 4 mL de SMCM frais.
  9. Identifier les cellules par une analyse d’immunofluorescence de quatre marqueurs spécifiques différents pour les cellules musculaires lisses (CNN1, SM22)14.

2. Préparation de la puce PDMS

  1. Pour polymériser PDMS, ajouter un agent de durcissement (composant B) à la base (composant A) à un rapport pondéral de A: B = 10: 1 p / p et mélanger complètement le complexe pendant 5 min; Le volume dépend de la nécessité de l’étude.
  2. Placez le gel PDMS préparé dans un réservoir d’extraction sous vide pendant 30-60 min et maintenez la pression en dessous de -0,8 mPa.
    REMARQUE: Une pression élevée entraînera une extraction insuffisante des petites bulles à l’intérieur du gel PDMS, ce qui affectera la prochaine étape de la fabrication de la puce.
  3. À l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO), concevoir le moule avec une structure de cadre externe de 100 mm × 40 mm × 8 mm et un canal de 70 mm × 6 mm × 4 mm.
  4. Fabriquez sur mesure les moules des trois couches à l’aide d’une machine de gravure à commande numérique par ordinateur de haute précision. Sculptez le cadre des moules et des microcanaux à l’aide de plaques de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), puis collez-les sur une autre plaque de PMMA.
  5. Versez le gel PDMS préparé sur un moule avec un cadre extérieur de 100 mm × 40 mm × 6 mm et 70 mm × 6 mm × canal de 4 mm, puis réticulez à 70 °C pendant 1-2 h.
  6. Décollez les dalles PDMS réticulées du moule et coupez les membranes PDMS commercialisées en sections de 100 mm × 40 mm.
  7. Traiter les trois dalles PDMS préparées et les deux membranes PDMS avec du plasma d’oxygène pendant 5 minutes pour l’activation de surface PDMS. Appliquer les paramètres spécifiques suivants: air ambiant comme gaz de procédé; pression réglée à -100 kPa; courant réglé à 180--200 Ma; tension réglée à 200 V; Temps de traitement jusqu’à 5 min.
  8. Perforez les trous sur les trois dalles PDMS à l’aide d’un perforateur de trou de 1 mm pour faire l’entrée et la sortie d’air et les microcanaux moyens sur la puce PDMS.
  9. Lier trois dalles PDMS et deux membranes PDMS ensemble dans l’ordre: dalle PDMS canal d’air (couche supérieure) - membrane PDMS - dalle PDMS canal moyen (couche intermédiaire) - membrane PDMS - dalle PDMS canal (couche inférieure). Effectuez cette étape au microscope stéréoscopique à 4x pour chevaucher complètement les microcanaux d’air avec les microcanaux moyens.
  10. Placez la puce PDMS assemblée dans un incubateur à 70 °C pendant 1 h.
  11. Préparez plusieurs tuyaux en latex de 1 mm de diamètre intérieur et 3 cm de longueur. Insérez une aiguille en acier inoxydable de 1 mm de diamètre extérieur et 1 cm de long dans une extrémité du tuyau préparé, puis insérez un Luer dans l’autre extrémité du tuyau pour créer le tube connecté aux microcanaux d’air et de milieu de la puce PDMS.
  12. Insérez les tubes préparés dans les sorties et les entrées de l’air et les microcanaux moyens sur la puce PDMS.

3. Traitement de surface et stérilisation des puces PDMS

  1. Infuser 2 mL de collagène de souris à 80 mg/mL dans le microcanal moyen de la puce PDMS à l’aide d’une seringue de 2 mL et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  2. Après l’incubation, retirez le collagène du canal et recueillez-le avec une seringue de 2 mL. Placez les puces PDMS enrobées de collagène dans un incubateur à 60 °C pendant la nuit.
  3. Placez les puces PDMS dans un stérilisateur UV pendant plus de 1 h. Placez les puces PDMS stérilisées sur un banc ultrapropre en préparation de l’expérience cellulaire.

4. Ensemencement cellulaire sur la puce PDMS et processus d’étirement cellulaire

  1. Culture de 4 x 10 5 cellules musculaires lisses humaines primaires (HASMC) de patients utilisant un milieu de cellules musculaires lisses (SMCM) contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine dans un incubateur à5 % de CO2 à 37 °C.
  2. Lorsque la densité HASMC atteint 80%, jetez le SMCM et lavez les cellules avec 2 mL de PBS.
  3. Digérer les cellules en utilisant 1 mL de trypsine à 0,25% pendant 2 min et centrifuger à 100 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de SMCM frais. Utilisez 8 mL de SMCM pour cultiver les cellules sur une boîte de culture de 10 cm.
  4. Calculer le nombre de cellules à l’aide d’un cytomètre et utiliser les cellules à une concentration finale de 2 x 105 cellules/mL.
  5. Verser lentement 2 mL de PBS dans le microcanal moyen de puce PDMS recouvert de collagène et stérilisé, puis jeter à l’aide d’une seringue de 2 mL.
  6. Verser lentement un total de 2 mL de suspension HASMC de 2 x 105 cellules/mL dans le microcanal moyen de la puce PDMS à l’aide d’une seringue de 2 mL. Ensuite, fermez le Luer à l’entrée et à la sortie de la puce PDMS. Placez la puce PDMS dans un incubateur (5% CO2) à 37 °C pendant 1 jour.
  7. Une fois les cellules fixées à la membrane PDMS dans la puce PDMS, près de 24 heures, connectez la sortie du microcanal d’air sur la puce PDMS au système de contrôleur de vide. Lorsque la cellule est attachée, une forme cellulaire allongée et normale peut être vue au microscope, contrastant avec les cellules rondes en suspension.
  8. Allumez l’électrovanne et la pompe à vide. Ouvrez le régulateur de vide et réglez le niveau de pression à 10 kPa pour une déformation de 7,18 ± 0,44 % et à 15 kPa pour une déformation de 17,28 ± 0,91 %.
  9. Une fois les paramètres du système de contrôle définis, placez les puces PDMS dans un incubateur (5% CO2) à 37 °C et étirez-les pendant 24 h.

5. Préparation du système de commande mécanique

  1. Préparez plusieurs électrovannes, filtres à vide, régulateurs de vide, une pompe à vide, une pompe péristaltique et un contrôleur logique programmable (PLC) contrôlant l’électrovanne.
  2. Programmez le contrôleur PLC et réglez l’intervalle de temps marche/arrêt sur 1 Hz. Connectez les électrovannes au contrôleur programmé.
  3. Connectez l’entrée de la pompe à vide aux filtres à vide, puis connectez la sortie des filtres à vide aux régulateurs de vide. Connectez la sortie des régulateurs de vide aux électrovannes et, enfin, connectez la sortie des électrovannes aux sorties des microcanaux d’air des puces PDMS.
  4. Connectez la sortie de la pompe péristaltique à l’entrée du microcanal moyen de la puce PDMS et l’entrée de la pompe péristaltique à la sortie de la puce PDMS à microcanal moyen pour le remplacement du milieu de culture et la manipulation des médicaments.
  5. Ajustez l’amplitude de la déformation par le régulateur et la fréquence de déformation par le microcontrôleur.

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Résultats

Le modèle HASMC-OOC se compose d’un système de contrôle du vide, d’un système de circulation et de puces PDMS, ainsi que de la conception schématique du modèle HASMC-OOC (Figure 1). Le système de contrôle du vide se compose d’une pompe à vide, d’électrovannes et d’un contrôleur PLC. Pour agir comme système circulant, une pompe péristaltique a été utilisée pour rafraîchir le milieu de culture cellulaire et ajouter des médicaments. La puce PDMS était composée de deux chambres à vide et d’une c...

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Discussion

Avec le développement rapide de la technologie microfluidique, des modèles OOC capables de reproduire la fonction biologique et la structure d’un ou plusieurs organes in vitro ont émergé ces dernières années pour des applications en biologie, médecine et pharmacologie15. OOC peut simuler des fonctions clés du microenvironnement physiologique humain, essentiel pour explorer les mécanismes de la maladie et promouvoir la traduction précliniquedes médicaments 8,16...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent que ce travail a été soutenu par des subventions de la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (20ZR1411700), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81771971) et du programme de voile de Shanghai (22YF1406600).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % de paraformaldéhydeBeyotimeP0099-100mlUtilisé pour l’immobilisation cellulaire
Alexa Fluor 350-labellisé Chèvre Anti-Lapin IgGBeyotimeA0408Anticorps utilisés pour l’immunocoloration Albumine
sériquebovine BeyotimeST025-20g
Calcium AM/PIInvitrogenL3224
Fiole de culture cellulaire  ;Corning430639
CNN1Abcam  ;Ab46794
Commercial flexible
membrane PDMS		Hangzhou Bald Advanced MaterialsKYQ-200
F-actinInvitrogenR415
FBSSigmaM8318
TuyauxRunze Fluid964101 mm de diamètre intérieur ; 3 mm de diamètre extérieur ; 1 mm d’épaisseur de paroi ; Adresse du site officiel : https://www.runzefluidsystem.com
Lignée cellulaire musculaire aortique humaine lisse
CRL1999		ATCCNuméro de lot : 70019189
Image JImagej.net/fiji/downloadsTéléchargement gratuit : https://fiji.scPlate-forme d’imagerie utilisée pour identifier l’intensité de fluorescence
IncubateurThermo Fisher ScientificGarantit que la température, l’humidité
et l’exposition à la lumière sont
exactement les mêmes tout au long de l’expérience
.
LuerRunze FluidRH-M016Adresse du site officiel : https://www.runzefluidsystem.com.
MicroscopeOlympus
souris collagèneSigmaC7661
Plasma d’oxygène  ;Changzhou Hongming InstrumentHM-Plasma5L
Pipette PasteurBiologix30-0138A1
PBSBeyotimeC0221A
Pen-StrepSigmaP4458-100mlAntibiodiques utilisés pour prévenir la contamination bactérienne
des cellules pendant la culture.
pompe péristaltiqueKamoerF01A-STP-B046
Boîte de PétriCorning430167
contrôleur PLCZhejiang Jun Teng (BenT) Usine CNCBR010-11T8X2MLe réglage détaillé du programme peut être trouvé en supplément. Adresse du site officiel : files.http ://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
SM22Abcam  ;ab14106
SMCMScienCellCat 1101
électrovanneSMC (Chine)VQZ300
SeringueBecton,Dickinson and Company300841
Triton-X 100BeyotimeST795Pour pénétrer les membranes cellulaires
TrizolInvitrogen10296010Utilisé pour l’extraction de l’ARN
trypsineSigma15400054
SMC (Chine)ZFC5-6Adresse officielle du site Web : Pompe à
videhttps://www.smc.com.cn KamoerKVP15-KL-S
régulateur de videAirTACGVR-200-06
Primers
Primer NameForward (5' à 3')Marche arrière (5' à 3')
SM22CCGTGGAGATCCCAACTGGCCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1CTCCATTGACTCGAACGACTCCAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA
Filtre à vide

Références

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Cellules musculaires lissesContrainte biom canique aortiqueMod le d aorte humaineTechniques microfluidiquesPuce PDMSContrainte cycliqueAnalyse par immunofluorescenceMorphologie cellulaireAn vrisme de l aorte thoracique
Construction d’un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour récapituler la contrainte biomécanique dans la paroi aortique
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