Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval

Résumé

La biopsie liquide a révolutionné notre approche des études translationnelles en oncologie, la collecte, la qualité et le stockage des échantillons étant des étapes cruciales pour son application clinique réussie. Nous décrivons ici un protocole standardisé et validé pour les applications d’ADN libre circulant en aval qui peut être appliqué dans la plupart des laboratoires de recherche translationnelle.

Résumé

Le terme biopsie liquide (LB) fait référence à des molécules telles que les protéines, l’ADN, l’ARN, les cellules ou les vésicules extracellulaires dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire et / ou métastatique. LB est devenu un pilier de la recherche translationnelle et a commencé à faire partie de la pratique clinique en oncologie, offrant une alternative mini-invasive à la biopsie solide. Le LB permet la surveillance en temps réel d’une tumeur via une extraction d’échantillon mini-invasive, comme le sang. Les applications comprennent la détection précoce du cancer, le suivi des patients pour la détection de la progression de la maladie, l’évaluation de la maladie résiduelle minimale et l’identification potentielle de la progression moléculaire et du mécanisme de résistance. Afin d’obtenir une analyse fiable de ces échantillons qui peut être rapportée en clinique, les procédures préanalytiques doivent être soigneusement examinées et strictement suivies. La collecte, la qualité et le stockage des échantillons sont des étapes cruciales qui déterminent leur utilité dans les applications en aval. Nous présentons ici des protocoles standardisés de notre module de travail de biopsie liquide pour la collecte, le traitement et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum pour l’analyse de biopsie liquide en aval basée sur de l’ADN sans circulation. Les protocoles présentés ici nécessitent un équipement standard et sont suffisamment flexibles pour être appliqués dans la plupart des laboratoires axés sur les procédures biologiques.

Introduction

Le terme « biopsie liquide » a été défini en 2010¹ comme la présence de molécules (p. ex. protéines, acide désoxyribonucléique (ADN), acide ribonucléique (ARN)), de cellules ou de vésicules extracellulaires (p. ex., exosomes) dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire. L’utilisation d’échantillons de biopsie liquide a révolutionné la recherche translationnelle en oncologie, car les biopsies tissulaires, limitées à une région particulière à un moment donné, peuvent manquer des clones pertinents en raison de l’hétérogénéité tumorale. En outre, la biopsie liquide joue un rôle important dans les types de tumeur....

Protocole

Une approbation éthique préalable a été obtenue auprès des centres participants avant l’extraction des échantillons de sang. Les protocoles suivants pour l’isolement du sérum et du plasma ont été réalisés conformément aux principes éthiques de la recherche biomédicale.

REMARQUE: Les considérations préalables avant de commencer le protocole sont fournies ici. Une approbation éthique préalable est requise pour l’utilisation d’échantillons humains dans la recherche biomédicale, avec le consentement éclairé correspondant. Une armoire de biosécurité de classe II est nécessaire pour traiter les échantillons de sang. Une blouse de laboratoire, des....

Résultats

Après centrifugation des tubes sanguins sans anticoagulant, la phase supérieure apparaît jaune pâle et correspond à la fraction sérique (Figure 2). Cette fraction est soigneusement enlevée et alicitée pour une analyse ultérieure.

L’hémolyse peut être présente dans la fraction plasmatique ou sérique, et la phase supérieure aura un aspect rougeâtre, ce qui indique la présence et le degré d’hémolyse (Figure 3).

Discussion

La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles à différents moments de la prise en charge du cancer. Tout d’abord, au moment du diagnostic, identifier les marqueurs moléculaires tumoraux qui suggéreraient la présence d’une lésion tumorale potentielle qui pourrait faire l’objet d’une étude clinique plus approfondie. Deuxièmement, pendant le traitement pour la surveillance en temps réel de la maladie, l’évaluation de la réponse moléculaire du traitement, l’évolution clonale et la détection précoce des rechute.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tous les tubes/équipements standard peuvent être utilisés
Pipettes sérologiques jetables de 10 mL	BIOFIL	GSP010010	Tous les tubes/équipements standard peuvent être utilisés
10 mL Tube Vacutainer K2 EDTA	Becton Dickinson	367525	Ces tubes peuvent être utilisés pour la collecte de plasma
Tubes à centrifuger en polypropylène de 15 mL	BIOFIL	CFT411150	Tous les tubes/équipements standard peuvent être utilisés
Tube BD Vacutainer de 3,5 ml sans anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Des tubes de 8,5 ou 3,5 ml peuvent être utilisés pour la collecte de sérum
Flacon cryogénique en polypropylène de 4 ml, à fond rond, autoportant	Corning	430662	Tous les tubes/équipements standard peuvent être utilisés
Tube Vacutainer K2 EDTA de 4 ml Becton	Dickinson	367864	Ces tubes peuvent être utilisés pour la collecte de plasma
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Plusieurs méthodes de quantification sont disponibles avec une application spécifique pour cfDNA
5 mL pipettes sérologiques jetables	BIOFIL	GSP010005	N’importe quel tube/équipement standard peut être utilisé
8,5 mL BD Vacutainer tube sans anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Des tubes de 8,5 ou 3,5 mL peuvent être utilisés pour le prélèvement
de sérum Centrifugeuse, capable de ~3000 x g avec un rotor à godets pivotants	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16   ; 10688725	Tous les tubes/équipements standard peuvent être utilisés
Boîtes de rangement de congélateur pour 1&ndash ; Flacons cryogéniques de 4 mL	Corning	431120	Ces boîtes sont nécessaires lors de l’utilisation de flacons de 4 mL pour le stockage
des pointes de pipette p1000	CORNING	4809	N’importe quel tube/équipement standard peut être utilisé
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Tout kit disponible dans le commerce qui est spécifique pour l’isolement de cfDNA peut être utilisé avec ce protocole de traitement du sang.
Streck  ; Tubes DNA BCT CE sans cellule 10 mL	Streck	218997	Ces tubes peuvent être utilisés pour la collecte de plasma
Température Congélateur (-80 ° ; C)	ESCO	2180104	Tous les tubes/équipements standard peuvent être utilisés