Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval

Le terme « biopsie liquide » a été défini en 2010¹ comme la présence de molécules (p. ex. protéines, acide désoxyribonucléique (ADN), acide ribonucléique (ARN)), de cellules ou de vésicules extracellulaires (p. ex., exosomes) dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire. L’utilisation d’échantillons de biopsie liquide a révolutionné la recherche translationnelle en oncologie, car les biopsies tissulaires, limitées à une région particulière à un moment donné, peuvent manquer des clones pertinents en raison de l’hétérogénéité tumorale. En outre, la biopsie liquide joue un rôle important dans les types de tumeurs où le tissu primaire est rare ou inaccessible, car elle peut éviter une biopsie invasive, réduisant ainsi les coûts et les risques pour les patients. En outre, les caractéristiques moléculaires de la tumeur évoluent constamment principalement en raison de la pression thérapeutique, et les échantillons de biopsie liquide peuvent capturer la dynamique clonale de la tumeur car ils peuvent être prélevés longitudinalement, à différents moments cliniques et thérapeutiques de la maladie tels que la ligne de base, le traitement, la meilleure réponse et à la progression de la maladie ou même avant. Le concept de « biopsie liquide en temps réel » signifie que les changements dynamiques dans la tumeur peuvent être surveillés en temps réel, permettant ainsi une médecine de précision dans cette maladie. La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles en clinique, notamment le dépistage et la détection précoce du cancer, la surveillance en temps réel de la maladie, la détection de la maladie résiduelle minimale, l’étude des mécanismes de résistance au traitement et la stratification des patients au niveau thérapeutique¹. La détection précoce de la récurrence et de la progression de la maladie est un besoin clinique non satisfait dans de nombreux types de tumeurs et est un facteur clé dans l’augmentation de la survie et de la qualité de vie des patients atteints de cancer. Les modalités d’imagerie de routine et les marqueurs tumoraux solubles peuvent manquer de la sensibilité et / ou de la spécificité requises pour cette tâche. Ainsi, de nouveaux marqueurs prédictifs sont nécessaires de toute urgence en clinique, tels que ceux basés sur les acides nucléiques libres circulants.

Les types d’échantillons utilisés pour les études de biopsie liquide comprennent, sans toutefois s’y limiter, des échantillons de sang, d’urine, de salive et de selles. D’autres échantillons spécifiques à la tumeur peuvent être des aspirateurs cellulaires, du liquide céphalo-rachidien, du liquide pleural, du liquide kystique et ascite, des expectorations et du suc pancréatique². Les premiers liquides peuvent contenir différents types de matériaux dérivés du cancer, des cellules tumorales circulantes (CTC) ou des fragments tels que des exosomes et de l’ADN tumoral circulant sans cellules (ADNct). Les acides nucléiques peuvent être encapsulés dans des vésicules extracellulaires (VE) ou libérés dans les fluides corporels en raison de la mort cellulaire et des dommages. L’ADN libre circulant (cfDNA) est principalement libéré dans la circulation sanguine par les cellules apoptotiques ou nécrotiques et est présent chez tous les individus, montrant des niveaux accrus dans les maladies inflammatoires ou oncologiques³. Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires (~30-150 nm) sécrétées par des cellules contenant des acides nucléiques, des protéines et des lipides. Ces vésicules font partie du réseau de communication intercellulaire et se trouvent couramment dans de nombreux types de fluides corporels². Les acides nucléiques enfermés à l’intérieur des VE sont protégés de l’environnement hostile dans les fluides corporels, offrant ainsi un moyen plus robuste d’étudier ces molécules dans le cadre de la biopsie liquide.

Dans l’ensemble, les niveaux d’acides nucléiques circulants dans les échantillons de biopsie liquide sont très faibles et, par conséquent, des méthodes sensibles sont nécessaires pour la détection, telles que la PCR numérique ou le séquençage de nouvelle génération (NGS). La gestion préanalytique de l’échantillon est cruciale pour prévenir la lyse des cellules sanguines et la libération d’ADN intact, provoquant une contamination de l’ADNf par l’ADN génomique. En outre, des précautions doivent être prises lors de l’extraction des échantillons pour éviter la présence d’inhibiteurs des méthodes d’analyse à base d’enzymes.

Nous présentons ici une méthode standardisée pour la collecte et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum, qui est une première étape cruciale pour les applications en aval basées sur la biopsie liquide, y compris les analyses d’acides nucléiques circulants.

Une approbation éthique préalable a été obtenue auprès des centres participants avant l’extraction des échantillons de sang. Les protocoles suivants pour l’isolement du sérum et du plasma ont été réalisés conformément aux principes éthiques de la recherche biomédicale.

REMARQUE: Les considérations préalables avant de commencer le protocole sont fournies ici. Une approbation éthique préalable est requise pour l’utilisation d’échantillons humains dans la recherche biomédicale, avec le consentement éclairé correspondant. Une armoire de biosécurité de classe II est nécessaire pour traiter les échantillons de sang. Une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes doivent être portés tout au long de la procédure pour éviter l’infection par des agents pathogènes transmissibles par le sang. Un minimum de 30 min est requis pour le traitement des échantillons de sérum. Après extraction du sang dans des tubes sans anticoagulant, maintenir à température ambiante (RT) pendant 30-45 min pour permettre la formation de caillots. Un minimum de 40 minutes est requis pour la préparation du plasma, et les échantillons doivent être traités dans les 4 h suivant le moment de l’extraction lors de l’utilisation de tubes d’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) ou dans les 24 à 48 heures si vous utilisez des tubes de prélèvement stabilisateurs cellulaires ou des tubes de prélèvement d’ADN spécifiques sans cellules. Cependant, selon certains fabricants, les échantillons sont stables jusqu’à 2 semaines dans ces tubes spécialisés. Il est important de vérifier l’hémolyse, qui donnera au plasma ou à la fraction sérique un aspect rougeâtre. Consultez la section de dépannage pour les exemples hémolysés dans la discussion.

1. Préparation du sérum pour les études de biopsie liquide

REMARQUE : Le temps total requis pour effectuer cette étape est de 30 min (Figure 1).

1. Extraire 4-10 mL de sang dans des tubes ne contenant pas d’anticoagulant (capuchon rouge ou rouge/gris-noir) et maintenir à TA pendant 30-45 min. Traiter ces échantillons dans les 4 heures suivant l’extraction.
2. Consignez l’heure et la date de l’extraction de l’échantillon et l’identification du sujet (ID) dans une base de données d’échantillons conçue de manière appropriée.
3. En portant une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes, centrifuger le tube contenant du sang frais à RT (15 °C-25 °C) pendant 10 min à 1 600 (± 150) x g, avec la pause maximale appliquée.
4. Après centrifugation, retirer soigneusement le tube de la centrifugeuse; la phase supérieure du surnageant sérique apparaîtra claire et jaunâtre (Figure 2). Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse (Figure 3) et notez la présence d’hémolyse le cas échéant.
5. Dans une armoire de biosécurité de classe II, transférer le sérum dans des tubes de collecte sous forme d’aliquotes de 250 μL.
   REMARQUE : Le volume des aliquotes doit être ajusté aux exigences de l’étude.
6. Congelez immédiatement le sérum à la verticale dans une boîte de stockage à -80 °C et enregistrez le temps de stockage de l’échantillon.
7. Vérifier que les échantillons ont été traités dans les 4 heures requises.

2. Préparation plasmatique pour les études de biopsie liquide

REMARQUE : Le temps total requis pour effectuer cette étape est de 40 min (Figure 4).

1. Extraire 4 à 10 mL de sang dans des tubes contenant de l’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA). Traiter les échantillons dans les 4 heures suivant l’extraction.
2. Enregistrez l’heure et la date de l’extraction de l’échantillon et l’ID du sujet dans une base de données d’échantillons conçue de manière appropriée.
3. En portant une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes, centrifugez le tube EDTA à RT (15 °C-25 °C) pendant 10 min à 1 600 (± 150) x g, avec la pause maximale appliquée.
   REMARQUE: Reportez-vous aux instructions du fabricant lorsque vous utilisez d’autres tubes de collecte.
4. Après centrifugation, le surnageant plasmatique apparaîtra clair et jaunâtre. Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse (Figure 3) et transférez le plasma (surnageant) dans un tube centrifuge de 15 mL sans perturber la couche cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique jetable (ou d’une pipette à bulbe jetable ou de pipettes p1000 avec embout de filtre). Laissez un petit volume résiduel de plasma au-dessus de la couche cellulaire (environ 5 mm).
5. Si une hémolyse est observée, jeter l’échantillon pour d’autres analyses. (Figure 5). Consultez la section de dépannage de la discussion pour évaluer l’hémolyse.
6. Centrifuger le plasma dans un tube de centrifugeuse de 15 mL à RT (15 °C-25 °C) pendant 10-20 min à 3 000 (±150) x g. Effectuez cette étape pour éliminer toutes les cellules sanguines intactes résiduelles reportées de la première étape de centrifugation.
7. Après centrifugation, retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse et transférez 1 à 4 mL de plasma dans des flacons cryogéniques en polypropylène de 1 à 4 mL à l’aide d’une pipette sérologique jetable (ou d’une pipette à bulbe jetable ou de pipettes p1000 avec embout filtrant). Un volume résiduel de plasma (environ 0,3 mL ou 7 mm de hauteur) doit être laissé au fond du tube pour éviter de contaminer le plasma avec des cellules sanguines (figure 5).
8. Congelez immédiatement le plasma à la verticale dans la boîte de stockage à -80 °C et enregistrez le temps de stockage de l’échantillon. Vérifier que les échantillons ont été traités dans les 4 heures requises.
9. Recueillir la couche cellulaire (buffy coat) à l’aide d’une pointe P1000 et filtrée et la transférer dans un tube de 2 mL. Congeler et conserver immédiatement à -80 °C.

Après centrifugation des tubes sanguins sans anticoagulant, la phase supérieure apparaît jaune pâle et correspond à la fraction sérique (Figure 2). Cette fraction est soigneusement enlevée et alicitée pour une analyse ultérieure.

L’hémolyse peut être présente dans la fraction plasmatique ou sérique, et la phase supérieure aura un aspect rougeâtre, ce qui indique la présence et le degré d’hémolyse (Figure 3).

Après centrifugation des tubes EDTA, plusieurs phases ou couches seront apparentes; la phase supérieure (jaune pâle) est la fraction plasmatique, qui représente 55% du volume sanguin total; la fine interface gris-blanc est la couche de pelage bouffant qui contient des globules blancs et des plaquettes, et représente <1% du volume sanguin total; la phase inférieure (couleur rouge) contient des globules rouges, qui représentent 45% du volume sanguin total). Aspirer 1 cm au-dessus de la couche leucocytaire et s’assurer que la couche cellulaire n’est pas perturbée pour réduire la contamination du plasma par les cellules sanguines (Figure 5). Cette fraction doit être soigneusement enlevée et alicitée pour une analyse ultérieure.

La concentration et l’intégrité de l’ADNf extrait des échantillons de plasma doivent être évaluées à l’aide de méthodes basées sur l’électrophorèse. CfDNA a été extrait à l’aide d’un kit à base de colonnes disponible dans le commerce. La quantification a été réalisée à l’aide d’un kit à base de gel disponible dans le commerce spécifique aux applications cfDNA (Table des matériaux). La figure 6A montre un exemple d’extraction d’ADNf de haute qualité qui peut être utilisée pour des applications en aval. Tandis que la figure 6B montre un exemple d’échantillon inapproprié avec un niveau élevé de contamination génomique.

Figure 1 : Préparation sérique pour les études de biopsie liquide. Un aperçu du processus de préparation du sérum est montré, de la centrifugation de l’échantillon au stockage des aliquotes. Étape 1: Échantillon de sang dans un tube sans anticoagulant pour l’isolement du sérum. Étape 2 : Centrifuger le tube sanguin pour obtenir du sérum dans les 4 h suivant l’extraction. Étape 3: Retirez la phase supérieure du surnageant sérique pour un stockage ultérieur. Étape 4: Congelez le tube de sérum à la verticale à -80 ° C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Échantillons de sang prélevés dans des tubes sans anticoagulant après centrifugation. La phase supérieure correspond à la fraction sérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Exemple d’échantillon hémolysé après centrifugation. La phase supérieure correspondant à la fraction plasma/sérum apparaît rouge en raison de l’hémolyse. Idéalement, ces échantillons devraient être jetés, ou au moins la présence d’hémolyse dans l’échantillon devrait être enregistrée, car cela peut affecter certaines applications en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Préparation plasmatique pour les études de biopsie liquide. Un aperçu du processus de préparation du sérum est montré, de la centrifugation de l’échantillon au stockage des aliquotes et à la collecte du pelage bouffant. Étape 1 : Échantillon de sang dans un tube contenant de l’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) pour l’isolement du plasma. Étape 2 : Centrifuger le tube sanguin pour obtenir du plasma dans les 4 h suivant l’extraction. Étape 3 : Transférer le surnageant plasma dans un tube centrifuge de 15 mL sans perturber la couche cellulaire. Étape 4 : Centrifugez le plasma pour éliminer les cellules sanguines transférées de la première étape de centrifugation. Étape 5 : Transférer le plasma dans des flacons cryogéniques et congeler le tube de plasma à la verticale à -80 °C. Étape 6: Collectez la couche cellulaire (manteau bouffant) et conservez-la à -80 ° C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 : Échantillons de sang EDTA après centrifugation. Trois couches visibles sont visibles après centrifugation des tubes contenant du sang frais. La phase supérieure correspond à la fraction plasmatique, la fine interface gris-blanc correspond au pelage bouffant et contient des globules blancs et des plaquettes, et la phase inférieure contient des globules rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse par électrophorèse de l’ADNcf isolé du plasma. (A) Un exemple d’expérience optimale. (B) Exemple d’expérience sous-optimale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Beatriz Bellosillo (BB) : BB a reçu des honoraires pour son rôle de conférencière, de consultante ou de conseil de la part d’Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer et BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL a reçu des honoraires pour son rôle de conférencière, de consultante ou de conseil de la part d’Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline et Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT a reçu des honoraires pour conférencier, consultant ou conseiller d’Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM et ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL) : a reçu des honoraires pour conférencier, consultant ou conseiller de la part d’Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly et Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) rapporte avoir reçu des subventions de recherche liées à cette étude de Novartis et des subventions de recherche sans rapport avec cette étude d’AstraZeneca et Beigene. Les autres auteurs n’ont aucune divulgation concernant le manuscrit.