Article de méthode

Isolement, caractérisation et application thérapeutique de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines en culture

DOI :

10.3791/64135

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23 septembre 2022

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1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

Dans cet article

Résumé

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Le présent protocole décrit la centrifugation différentielle pour isoler et caractériser les VE représentatifs (exosomes et microvésicules) provenant de CSM humaines en culture. D’autres applications de ces véhicules électriques sont également expliquées dans cet article.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules membranaires hétérogènes libérées par la plupart des types de cellules, et elles sont de plus en plus reconnues comme des régulateurs physiologiques de l’homéostasie de l’organisme et des indicateurs importants de pathologies; Entre-temps, leur immense potentiel pour établir des traitements thérapeutiques accessibles et contrôlables est en train d’émerger. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent libérer de grandes quantités de VE en culture, ce qui s’est révélé prometteur pour relancer une régénération tissulaire efficace et faciliter des applications thérapeutiques étendues avec une bonne évolutivité et reproductibilité. Il existe une demande croissante de protocoles simples et efficaces pour la collecte et l’application des CSM-EV. Ici, un protocole détaillé est fourni basé sur la centrifugation différentielle pour isoler et caractériser les VE représentatifs des CSM humains cultivés, des exosomes et des microvésicules pour d’autres applications. L’adaptabilité de cette méthode est démontrée pour une série d’approches en aval, telles que le marquage, la transplantation locale et l’injection systémique. La mise en œuvre de cette procédure permettra de répondre à la nécessité d’une collecte et d’une application simples et fiables des CSM-EV dans la recherche translationnelle.

Introduction

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Les cellules souches sont des cellules pluripotentes indifférenciées ayant une capacité d’auto-renouvellement et un potentiel translationnel1. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont facilement isolées, cultivées, dilatées et purifiées en laboratoire, ce qui reste caractéristique des cellules souches après plusieurs passages. Au cours des dernières années, de plus en plus de preuves ont soutenu l’opinion selon laquelle les CSM agissent en mode paracrine à usage thérapeutique 2,3. En particulier, la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE) joue un rôle crucial dans la médiation des fonctions biologiques des CSM. En tant que nanoparticules membraneuses hétérogènes libérées par la plupart des types cellulaires, les VE se composent de sous-catégories appelées exosomes (Exos), microvésicules (MV) et même corps apoptotiquesplus grands 4,5. Parmi eux, Exos est l’EV le plus étudié avec une taille de 40-150 nm, qui est d’origine endosomale et activement sécrété dans des conditions physiologiques. Les MV sont formés par excrétion directement à partir de la surface de la membrane plasmique cellulaire d’un diamètre de 100 à 1 000 nm, caractérisés par une expression élevée de phosphatidylsérine et une expression de marqueurs de surface des cellules donneuses6. Les VE contiennent de l’ARN, des protéines et d’autres molécules bioactives, qui ont des fonctions similaires à celles des cellules mères et jouent un rôle important dans la communication cellulaire, la réponse immunitaire et la réparation des lésions tissulaires7. Les CSM-EV ont été largement étudiés en tant qu’outil thérapeutique acellulaire puissant en médecine régénérative8.

L’isolement et la purification des VE dérivés des CSM sont un problème courant dans le domaine de la recherche et de l’application. À l’heure actuelle, l’ultracentrifugationdifférentielle et à gradient de densité 9, le procédé d’ultrafiltration 10, la séparation immunomagnétique 11, le chromatographe d’exclusion moléculaire12 et la puce microfluidique 13 sont des méthodes largement utilisées dans l’isolement et la purification des véhicules électriques. Avec les avantages et les inconvénients de chaque approche, la quantité, la pureté et l’activité des VE collectés ne peuvent pas être satisfaites en même temps14,15. Dans la présente étude, le protocole de centrifugation différentielle d’isolement et de caractérisation des VE à partir de CSM en culture est présenté en détail, ce qui a favorisé une utilisation thérapeutique efficace 16,17,18,19,20. L’adaptabilité de cette méthode à une série d’approches en aval, telles que le marquage fluorescent, la transplantation locale et l’injection systémique, a également été illustrée. La mise en œuvre de cette procédure permettra de répondre à la nécessité d’une collecte et d’une application simples et fiables des CSM-EV dans la recherche translationnelle.

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Protocole

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Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de la quatrième Université médicale militaire et effectuées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris C57Bl/6 âgées de huit semaines (aucune préférence pour les femelles ou les mâles) ont été utilisées. Les CSM humaines dérivées du cordon ombilical humain (UCMSC) cryoconservées, utilisées pour la présente étude, ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). L’utilisation de cellules humaines a été approuvée par le Comité d’éthique de la quatrième Université médicale militaire.

1. Culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)

  1. Préparer les accessoires et les solutions nécessaires aux travaux expérimentaux, y compris les pipettes, les pointes de pipettes, la boîte de Pétri de 10 cm, l’équipement thermostatique (bain-marie), les gants en caoutchouc, l’alcool à 75 %, le milieu de culture (incubé à 37 °C), le sérum bovin mortel (FBS) et la solution 100x de pénicilline-streptomycine (P/S) (voir le tableau des matériaux).
  2. Préparer le milieu essentiel alpha-minimum (α-MEM) disponible dans le commerce en complétant avec 20% FBS et 1% P/S.
    NOTE: Diluer toutes les solutions utilisées pour l’isolation et l’analyse des VE dans de l’eau filtrée ultrapure fabriquée par le système de purification d’eau filtrée ultrapure (voir le tableau des matériaux).
  3. Récupérer les CSM humaines dérivées du cordon ombilical humain cryoconservées (UCMSC) de l’azote liquide en les faisant fondre dans un bain-marie à 37 °C.
  4. Transférer rapidement et délicatement la suspension de cellules fondues dans un tube de 15 mL avec 5 mL de milieu de culture (étape 1.2). Centrifuger à 4 °C, 500 x g pendant 5 min.
  5. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette stérile et retenir le précipité cellulaire. Ajouter 2 mL de milieu de culture dans le tube centrifuge et remettre doucement les cellules en suspension.
  6. Ensemencer les cellules dans une boîte de Petri de 10 cm et ajouter 8 mL de milieu de culture pour un total de 10 mL.
  7. Culture de CSM à 37 °C dans 5% de CO2 dans l’incubateur cellulaire.

2. Centrifugation différentielle pour l’isolation des Exos et des MV

  1. Lorsque les CSM atteignent >90 % de confluence, remplacer le milieu de culture par du α-MEM complété par 20 % de FBS appauvri en EV et 1 % de P/S pour 8 mL de chaque boîte.
    REMARQUE: Centrifuger FBS à 4 °C, 1,50,000 x g pendant la nuit pour éliminer les VE et autres impuretés.
  2. Après 48 h de culture, recueillir le milieu de culture (étape 2.1) dans des tubes à centrifuger de 50 mL.
  3. Centrifuger le milieu de culture MSC à 4 °C, 800 x g pendant 10 min.
  4. Retirez les fragments cellulaires et les débris cellulaires en transférant le surnageant pour nettoyer les tubes coniques de 1,5 mL.
    REMARQUE: L’utilisation de tubes coniques de 1,5 mL est nécessaire pour augmenter le rendement des véhicules électriques.
  5. Centrifuger le surnageant à 4 °C, 16 000 x g pendant 30 min. Les MV de chaque boîte de cellules ont été remises en suspension avec 50 μL de PBS.
  6. Transférer le surnageant obtenu par centrifugation à l’étape 2.5 à l’aide d’une pipette pour nettoyer les tubes à ultracentrifugeuses. Centrifuger à 1,50,000 x g pendant 2 h à 4 °C.
  7. Jetez le surnageant et collectez le résidu, qui est Exos. Resuspendre Exos de sept boîtes de cellules dans 50 μL de PBS.
    NOTE: Les UCMS de sixième passage sont utilisés pour l’isolation EV. Pour obtenir suffisamment de MV et d’Exos pour une utilisation expérimentale, 7-8 boîtes de cellules cultivées sont généralement nécessaires. Les échantillons EV sont utilisés immédiatement pour les étapes de caractérisation suivantes ou pour une application thérapeutique, qu’il est préférable de ne pas stocker.
    ATTENTION : Évitez le gel et la décongélation répétés des VE, et il est préférable de stocker les VE à 4 °C à court terme et non à -80 °C.

3. Détection du nombre de particules et de la distribution granulométrique des VE des CSM

REMARQUE : Pour l’évaluation de la distribution granulométrique, l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est effectuée par un analyseur de suivi des nanoparticules disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).

  1. Diluer 1 μL de VE (à partir des étapes 2.5 et 2.7) dans 1 499 μL de PBS et mélanger suffisamment dans un tube de 15 mL.
  2. Utilisez l’analyseur de suivi en suivant les instructions du fabricant. Tout d’abord, démarrez le logiciel compatible (voir Tableau des matériaux).
  3. Remplissez la cellule d’échantillon avec de l’eau distillée, puis laissez l’instrument démarrer la vérification de la cellule.
  4. Calibrer l’instrument avec une solution étalon préparée. Assurez-vous que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection du logiciel est compris entre 50 et 400 (de préférence autour de 200). Cliquez sur OK.
    REMARQUE : Préparer la solution étalon en reconstituant 1 μL de solution d’étalonnage (voir le tableau des matières) dans 1 mL d’eau distillée pour produire une solution primaire, puis prélever 100 μL de la solution primaire et ajouter 25 mL d’eau distillée pour préparer une solution étalon (1:250 000). Conservez ce réactif fonctionnel à 4 °C pendant une semaine.
  5. Rincer la cellule d’échantillon avec 5 mL d’eau distillée.
  6. Avant l’analyse de l’échantillon, rincer le canal avec 1 mL d’eau distillée. Assurez-vous que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection du logiciel est inférieur à 10.
  7. Injecter 1 mL de l’échantillon de VE préparé à l’étape 3.1. Effectuer le test des vésicules conformément au mode d’emploi de l’instrument.
    ATTENTION : L’échantillon et l’eau distillée sont injectés avec une seringue de 1 mL à une vitesse constante de 0,5 mL/s sous contrôle manuel minutieux.

4. Caractérisation de la morphologie des VE au microscope électronique à transmission (MET)

  1. Diluer 1 μL de VE de l’étape 2,7 dans 199 μL de PBS et mélanger suffisamment. Ajouter 20 μL de gouttes de suspension EV à la maille carrée revêtue de formvar / carbone (voir le tableau des matériaux) et laisser reposer pendant 3 minutes.
  2. Retirer l’excès de liquide à l’aide d’un petit papier filtre et le laisser reposer pendant 15 s pour sécher légèrement la surface.
  3. Colorer négativement les échantillons EV avec des gouttelettes d’acide phosphotungstique à 1,5% pendant 40 s.
  4. Retirez l’excès d’acide phosphotungstique et laissez-le reposer pendant 15 s pour sécher légèrement la surface.
  5. Placer l’échantillon contenant un filet carré enduit de formvar / carbone dans un plat propre recouvert de papiers filtres. Observez et capturez des images avec un microscope électronique à transmission.
    REMARQUE: Dans ce processus, les Exos sont pris comme exemple.

5. Étiquetage des véhicules électriques dérivés des CSM

  1. Après extraction des VE (étape 2.5), remettre en suspension avec 250 μL de PBS dans un tube conique de 1,5 mL.
  2. Utiliser un autre tube conique de 1,5 mL pour préparer la solution de travail du colorant PKH26; utiliser 1 μL de réactif de marquage PKH26 dilué avec 250 μL de Diluant C (un composant de la trousse d’étiquetage EV disponible dans le commerce utilisée pour la présente étude, voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: Préparez la solution de travail immédiatement avant utilisation.
    ATTENTION : Un colorant PKH26 excessif ou un étiquetage sans pré-dilution risque d’endommager les véhicules électriques.
  3. Mélangez les véhicules électriques remis en suspension avec la solution de travail. Laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 minutes, puis ajoutez 500 μL de FBS appauvri en EV pour arrêter la réaction.
  4. Pour les MV, centrifuger à 4 °C, 16 000 x g pendant 30 min, et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de PBS pour rincer le résidu.
  5. Centrifuger à 4 °C, 16 000 x g pendant 30 min, et jeter le surnageant pour enlever le colorant non lié.
  6. Remettez le résidu en suspension avec 200 μL de PBS. Déposez 20 μL de suspension sur la lame et observez-la au microscope à fluorescence.
    REMARQUE: Dans ce processus, les MV sont pris comme exemple.

6. Transplantation locale et injection systémique de CSM-VE

REMARQUE: Pour les procédures suivantes, placez les VE sur la glace avant l’injection.

  1. Effectuez une transplantation locale en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane à 4 % (vol/vol). Maintenir l’anesthésie à 1% -3% isoflurane pendant la procédure.
    2. Avant la chirurgie, administrer 5 mg / kg de carprofène (IP) pour l’analgésie afin de minimiser la douleur post-opératoire.
    3. Avant l’excision de la plaie, rasez les poils dorsaux et stérilisez la surface dorsale en appliquant 3 cycles alternés de 10% de povidone iodée et d’éthanol à 75%.
    4. À l’aide d’un coup de biopsie (voir le tableau des matériaux), créer une plaie de pleine épaisseur de 1 cm de diamètre sur la peau dorsale.
    5. Resuspendre les VE dérivés du CSM à partir de deux boîtes dans 100 μL de PBS et administrer l’injection dans la couche sous-cutanée du lit de la plaie, autour de chaque plaie à quatre sites.
      REMARQUE: Une moyenne de 100 μg de VE par souris (EV de deux boîtes de cellules de 10 cm) est injectée. Dix antennes de 10 cm de CSM sont nécessaires pour produire suffisamment de VE pour mettre en place une expérience de n = 5 dans un modèle murin.
    6. Après le traitement, enveloppez les souris avec de la gaze stérile et placez-les sur des tampons d’isolation thermique (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce qu’elles se réveillent.
    7. Assurez-vous que les souris ne sont pas laissées sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience. Ne remettez pas les souris en compagnie d’autres animaux avant qu’elles ne soient complètement rétablies.
    8. Administrer des doses supplémentaires d’analgésie le jour 2 et le jour 3 après la chirurgie, au besoin.
  2. Effectuer une injection systémique.
    1. Resuspendre les VE dérivés du MSC dans 200 μL de PBS, puis mélanger avec une solution d’héparine à un rapport volumique de 10:1.
    2. Placer les souris dans le système d’imagerie de la veine caudale (voir le tableau des matériaux). Appuyez sur l’interrupteur pour soulever le levier.
    3. Désinfectez la veine de la queue à l’aide d’un tampon d’alcool avant l’injection intraveineuse. Ensuite, injecter systématiquement les souris avec la suspension préparée à l’étape 6.2.1 par la veine de la queue. La procédure est aidée par un illustrateur de veine de queue.
      REMARQUE: Injecter la suspension EV immédiatement après le mélange avec l’héparine. Une moyenne de 100 μg de VE par souris (EV provenant de deux boîtes de cellules de 10 cm) est injectée. Dix antennes de 10 cm de CSM sont nécessaires pour produire suffisamment de VE pour mettre en place une expérience de n = 5 dans un modèle murin.
      ATTENTION : L’injection de la veine de la queue de souris est habituellement limitée à 200 μl de volume. L’injection doit aller lentement et s’arrêter si vous voyez une bosse ou une résistance, ce qui suggère que l’aiguille est hors de la veine. Si les souris présentent des signes cliniques indésirables tels que des courbements et des tremblements, il pourrait s’agir d’une réaction de choc à une injection à volume élevé, à une injection rapide ou à une toxicité / anaphylaxie.

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Résultats

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Les MV et les Exos provenant d’UCMS humains cultivés sont isolés après le flux de travail expérimental (Figure 1). Les résultats de la NTA démontrent que la taille des Exos des CSM humaines varie de 40 nm à 335 nm avec une taille de pic d’environ 100 nm, et la taille des MV varie de 50 nm à 445 nm avec une taille de pic de 150 nm (Figure 2). La caractérisation morphologique des Exos dérivés du MSC présente une forme de coupe typique (Figure ...

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Discussion

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Les VE émergent pour jouer un rôle important dans diverses activités biologiques, y compris la présentation de l’antigène, le transport du matériel génétique, la modification du microenvironnement cellulaire et autres. En outre, leur large application apporte de nouvelles approches et opportunités pour le diagnostic et le traitement des maladies21. La mise en œuvre des applications thérapeutiques des VE repose sur une isolation et une caractérisation réussies. Cependant, en raison du manque de mét...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000974, 81930025 et 82170988) et de la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2019M663986 et BX20190380). Nous sommes reconnaissants de l’aide du Centre national de démonstration de l’enseignement expérimental pour la médecine de base (AMFU) et du Laboratoire central d’analyse et d’essais du Centre d’innovation médicale militaire de l’Université médicale de l’armée de l’air.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 % povidone iode (bétadine)Weizhenyuan10053956954292Désinfection des plaies
Solution d’étalonnageParticle Metrix110-0020Calibrer l’instrument NTA
CarprofenSigma53716-49-7Médecine analgésique
Imageur de la veine caudaleKEW Life ScienceKW-XXYImageur de veine caudale
CentrifugeuseEppendorf5418RCentrifugation
Sérum bovin mortelCorning35-081-CVCulture d’UCMSCs
Formvar/à maille carrée revêtue de carboneEssai PBL Science  ;24916-25Microscope électronique à transmission
Coussin chauffantZhongke Life ScienceZ8G5JBMzSoins post-traitement des animaux
d’héparineStemCell7980Injection systémique
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22Anesthésie animale
Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture de UCMSCs
Analyseur de suivi des nanoparticulesParticle MetrixZetaView PMX120Analyse du suivi des nanoparticules
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend EVs
Pénicilline/StreptomycineProcell Life SciencePB180120Culture d’UCMSCs
Acide phosphotungstiqueSolarbio12501-23-4Microscope
PipetteEppendorf3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker KitSigma-AldrichMINI26Marquage EVs
Biopsie cutanée punchAcuderm69038-10-50Logiciels pour les défauts cutanés
ZetaViewParticle MetrixVersion 8.05.14 SP7  ;
Equipement thermostatiqueGrantv-0001-0005Bain d’eau
Microscope électronique à transmissionHITACHIHT7800Microscope électronique
à transmission UCMSCsBai’ao  ;UKK220201Commercialement UCMSCs
UltracentrifugeuseBeckmanXPN-100Centrifugation
Système de purification d’eau filtrée ultrapureMilli-QIQ 7000Préparation de l’eau ultrapure
Solution Minimum électronique à transmission

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619(2020).
  2. Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
  3. Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025(2019).
  4. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  5. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  6. Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996(2021).
  7. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  8. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22(2006).
  10. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  11. Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
  12. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  13. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  16. Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
  17. Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
  18. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074(2021).
  19. Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830(2020).
  20. He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708(2019).
  21. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835(2019).
  24. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  26. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).
  27. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  28. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  29. Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
  30. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
  31. Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
  32. Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274(2019).
  33. Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213(2021).

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Mots-clés

Mesenchymal Stem CellsExtracellular VesiclesDifferential CentrifugationMicrovesicle IsolationExosome CharacterizationNanoparticle TrackingFluorescence MicroscopyPKH26 LabelingSystemic InjectionTissue Regeneration

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