Dans le présent protocole, la fonction de barrière endothéliale de la glande sous-maxillaire (SMG) a été évaluée en injectant différents traceurs fluorescents pondérés moléculairement dans les veines angulaires de modèles animaux testés in vivo sous un microscope à balayage laser à deux photons.
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Article de méthode
In vivo Détection de perméabilité vasculaire dans la glande sous-maxillaire de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La salive joue un rôle important dans la santé bucco-dentaire et globale. La fonction de barrière endothéliale intacte des vaisseaux sanguins permet la sécrétion de salive, tandis que le dysfonctionnement de la barrière endothéliale est lié à de nombreux troubles sécrétoires des glandes salivaires. Le présent protocole décrit une méthode de détection de perméabilité paracellulaire in vivo pour évaluer la fonction des jonctions serrées endothéliales (TJ) dans les glandes sous-maxillaires de souris (SMG). Tout d’abord, des dextranes marqués par fluorescence avec différents poids moléculaires (4 kDa, 40 kDa ou 70 kDa) ont été injectés dans les veines angulaires de souris. Par la suite, le SMG unilatéral a été disséqué et fixé dans le support personnalisé sous un microscope à balayage laser à deux photons, puis des images ont été capturées pour les vaisseaux sanguins, les acini et les canaux. En utilisant cette méthode, la fuite dynamique en temps réel des traceurs de différentes tailles des vaisseaux sanguins dans les côtés basaux de l’acine et même à travers l’épithélium acineux dans les canaux a été surveillée pour évaluer l’altération de la fonction de barrière endothéliale dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques.
Introduction
Diverses glandes salivaires produisent de la salive, qui agit principalement comme première ligne de défense contre les infections et aide à la digestion, jouant ainsi un rôle essentiel dans la santé bucco-dentaire et globale1. L’approvisionnement en sang est crucial pour la sécrétion des glandes salivaires car il fournit constamment de l’eau, des électrolytes et des molécules qui forment la salive primaire. La fonction barrière endothéliale, régulée par le complexe de la jonction serrée (TJ), limite strictement et délicatement la perméation des capillaires, qui sont hautement perméables à l’eau, aux solutés, aux protéines et même aux cellules se déplaçant des vaisseaux sanguins circulants dans les tissus des glandes salivaires 2,3. Nous avons précédemment constaté que l’ouverture des TJ endothéliaux en réponse à un stimulus cholinergique facilite la sécrétion de salive, alors que l’altération de la fonction de barrière endothéliale est liée à l’hyposécrétion et à l’infiltration lymphocytaire dans les glandes sous-maxillaires (SMG) dans le syndrome de Sjögren4. Ces données suggèrent que la contribution de la fonction de barrière endothéliale doit être suffisamment prise en compte en ce qui concerne une variété de maladies des glandes salivaires.
Un microscope à balayage laser à deux photons est un outil puissant pour observer la dynamique des cellules dans les tissus intacts in vivo. L’un des avantages de cette technique est que la lumière proche infrarouge (NIR) a une pénétration tissulaire plus profonde que la lumière visible ou ultraviolette lorsque les échantillons sont excités par le NIR et ne provoque pas de dommages évidents aux tissus par la lumière dans des conditions appropriées 5,6. En effet, les glandes salivaires sont un tissu très homogène et superficiel, dans lequel les cellules acineuses de surface ne sont qu’à environ 30 μm de la surface de la glande 7,8. Il a été démontré que la microscopie confocale intravitale peut étudier la sécrétion exocrine et le cytosquelette d’actine dans les glandes salivaires de souris vivantes à une résolution subcellulaire8. Néanmoins, la microscopie à balayage laser à deux photons présente non seulement l’avantage de la microscopie confocale conventionnelle, mais peut également être utilisée pour détecter plus clairement les tissus et les images plus profonds. Ici, les dextrans marqués par fluorescence, qui sont fréquemment utilisés comme traceurs de perméabilité paracellulaire et ont l’avantage de différentes tailles, peuvent être utilisés pour tester l’ampleur du pore TJ9. Dans la présente étude, une technique de microscopie intravitale à balayage laser à deux photons en temps réel est établie pour l’évaluation in situ de la fonction de barrière endothéliale chez les SMG de souris. Chaque étape de travail pour la détection in vivo de la perméabilité vasculaire chez les SMG de souris est décrite dans le protocole actuel. Voici un exemple de détection de la fonction de barrière endothéliale dans le modèle de ligature du canal SMG de souris.
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale du Centre des sciences de la santé de l’Université de Pékin et étaient conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication des NIH n ° 85-23, révisée en 1996). Des souris mâles de type sauvage (WT) âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux de laboratoire ont été soigneusement traités pour minimiser leur douleur et leur inconfort.
1. Procédures sur les animaux
- Préparer et administrer les anesthésiques et les traceurs.
- Maintenir des conditions stériles tout au long de l’étude et stériliser les instruments par autoclavage. Divisez les souris en deux groupes.
REMARQUE: Le groupe témoin n’a pas été traité et l’autre groupe avec une ligature unilatérale du canal SMG pendant 1 jour a servi de groupe expérimental. Lors du regroupement, des souris ayant un poids corporel et un âge similaires doivent être sélectionnées pour réduire l’influence du poids et de l’âge sur la perméabilité vasculaire. - Choisissez des traceurs appropriés tels que le dextrane marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (poids moléculaire : 4 kDa; FD4) et le dextrane marqué à la rhodamine B (poids moléculaire : 70 kDa; RD70) (voir le tableau des matériaux) avec des spectres d’excitation/émission distincts pour minimiser l’interférence entre les signaux de fluorescence (en utilisant le filtre FITC ou le filtre de rhodamine B, respectivement) pour le test de perméabilité.
NOTE: Les longueurs d’onde d’excitation de FD4 et RD70 sont respectivement de 488 nm et 594 nm, et les longueurs d’onde d’émission sélectionnées sont respectivement 511-564 nm et 617-669 nm. - Diluer les traceurs dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (1x PBS) en bouillons de 100 mg/mL et conserver les aliquotes à l’abri de la lumière à −20 °C.
REMARQUE: Le dextran avec un poids moléculaire tel que 4 kDa fuira rapidement du sang dans les SMG de souris même sans conditions pathologiques10. - Injecter par voie intrapéritonéale le tribromoéthanol (la dose pour une souris de 25 g était d’environ 600 μL) pour anesthésier les souris. Fournir l’analgésie recommandée par le comité local d’éthique animale.
REMARQUE: Après l’induction de l’anesthésie, utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Prenez bien soin des animaux11. Attendez que la souris tolère la stimulation mécanique, par exemple un pincement des orteils sans réponse motrice. - Injecter un mélange de deux traceurs de perméabilité paracellulaire de poids moléculaire différents (FD4 et RD70) dans la veine angulaire (0,5 mg/g de poids corporel). Injectez à chaque souris un mélange de solution traceur de 100 μL, avec 50 μL de chaque colorant mélangé dans un rapport de 1:1.
- Après l’anesthésie, tenez doucement la tête et le cou de la souris pour faire dépasser légèrement un côté du globe oculaire. Insérez une seringue à insuline contenant des traceurs fluorescents (veillez à ne pas introduire d’air dans la seringue) le long du coin de l’œil perpendiculairement à l’œil.
REMARQUE: Si la veine angulaire est insérée correctement, la solution de colorant sera facilement injectée dans la veine et il n’y aura pas de résistance pendant l’injection. De plus, l’injection de veines de queue chez la souris pourrait également être un candidat pour les molécules traçantes intraveineuses.
- Après l’anesthésie, tenez doucement la tête et le cou de la souris pour faire dépasser légèrement un côté du globe oculaire. Insérez une seringue à insuline contenant des traceurs fluorescents (veillez à ne pas introduire d’air dans la seringue) le long du coin de l’œil perpendiculairement à l’œil.
- Maintenir des conditions stériles tout au long de l’étude et stériliser les instruments par autoclavage. Divisez les souris en deux groupes.
- Effectuez l’isolation SMG en suivant les étapes ci-dessous.
REMARQUE : Utilisez des outils stériles, y compris des ciseaux à tissus et des nickels de séparation, pour la chirurgie.- Séparez soigneusement une glande unilatérale afin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins et les nerfs environnants au microscope stéréoscopique.
- Après l’injection de traceurs de perméabilité paracellulaire, placez rapidement les souris sur le carton et placez-les en décubitus dorsal avec leurs membres et leur tête scotchés. Appliquez une crème dépilatoire sur la peau du cou pour enlever les poils de la souris. Utilisez de l’éthanol à 75% pour désinfecter la peau avant la chirurgie.
- Ensuite, sous un stéréomicroscope, coupez l’épiderme du cou avec des ciseaux tissulaires généraux pour exposer les deux côtés des SMG (la glande droite a été traitée dans cette expérience). Ensuite, utilisez un nickel de séparation tissulaire émoussé (voir le tableau des matériaux) pour séparer doucement la capsule de la surface de la glande, en prenant soin de ne pas endommager le tissu glandulaire et les vaisseaux sanguins.
- Séparez la capsule de la surface de la glande sans endommager la structure glandulaire. En outre, assurez-vous que l’ensemble du processus de contention de la souris et de séparation des glandes est accompli dans les 10 minutes.
- Séparez soigneusement une glande unilatérale afin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins et les nerfs environnants au microscope stéréoscopique.
2. Installation de microscope à deux photons
- Connectez le support personnalisé au dispositif à pression négative et vérifiez si l’effet de pression négative est correctement obtenu à l’avance.
NOTE: Le support a la forme d’une loupe miniature avec un morceau plat de verre rond au centre (diamètre: 4,32 mm, Figure 1). Le dispositif à pression négative a été conçu en interne de telle sorte que le support est connecté à un tube en caoutchouc, qui est relié à une bouteille de drainage, et le flacon est fixé au régulateur de pression négative par un tube en caoutchouc court. De cette façon, le régulateur de pression négative peut ajuster la pression pour s’assurer que le tissu est aspiré dans le support.- Reliez un côté du support au dispositif à pression négative. Pour vérifier si le dispositif à pression négative est intact et approprié, retournez le support, ajoutez une goutte d’eau et réglez la valeur de pression négative à 20 unités. Si l’eau est complètement et rapidement aspirée, le dispositif à pression négative est installé avec succès avec le support.
- Placez doucement le SMG exposé de la souris sur le support personnalisé et aspirez le tissu par aspiration en pression négative aussi loin que possible du corps de la souris pour réduire les artefacts de mouvement causés par la respiration et d’autres conditions.
- Imagez le matériau de support attaché à la glande sous un objectif d’immersion dans l’eau 25x/NA 1.0 (spécial pour NIR).
REMARQUE : Utilisez un microscope à deux photons verticaux (voir Tableau des matériaux) dans cette expérience. Les vaisseaux sanguins doivent être visibles immédiatement avec une fluorescence évidente après l’injection du traceur.
3. Imagerie des vaisseaux et détection de la perméabilité
- Commencez l’imagerie peu de temps après que la vue de la glande a été choisie.
REMARQUE : En règle générale, des séries chronologiques de 45 à 50 images en 20 s ou plus sont généralement capturées selon le plan expérimental. - Acquérir des images séquentielles le long de l’axe Z, espacées de 2 μm, de la surface de la glande jusqu’à 70-140 μm dans le tissu pour générer une construction tridimensionnelle (3D).
- Acquérir une imagerie accélérée des vaisseaux pour mesurer la perméabilité vasculaire dans le SMG.
REMARQUE: Définissez les conditions du menu du programme comme suit après avoir exécuté le logiciel de microscope (voir Tableau des matériaux).- Dans la boîte de dialogue Explorer, cliquez sur Ajouter un nouveau dossier et modifiez le nom du fichier.
- Revenez à la colonne Acquisition . Dans XY, le format est 512 x 512 et la vitesse est de 400 Hz. Activez Bidirectional X .
- Définissez le facteur de zoom sur 0,75 et 1,5 pour le zoom.
- Pour acquérir des images accélérées, sélectionnez xyt sous Mode d’acquisition. Réglez la durée sur 20 s, 30 min ou plus selon le besoin expérimental.
- Pour effectuer la construction 3D, définissez le mode d’acquisition sur xyz. La taille Z-Step peut être définie en fonction de la situation réelle.
- Après avoir défini les conditions, cliquez sur Live pour observer l’imagerie vasculaire de deux canaux et canaux superposés dans le cadre de formation de photos et choisissez les zones d’intérêt.
- Cliquez sur Démarrer pour commencer l’imagerie.
REMARQUE: La souris ne doit pas être laissée sans surveillance pendant le processus d’imagerie sous anesthésie.
4. Analyse des données
- Pour évaluer la perméabilité des vaisseaux, utilisez le logiciel Image J pour calculer le rapport d’intensité de fluorescence de FD4 et RD70 entre les vaisseaux extérieurs et intérieurs et les désigner comme intensité extra- et intravasculaire4.
NOTE: L’altération de la perméabilité vasculaire par le traçage du transport des dextranes reflète le changement de la fonction de barrière endothéliale. De plus, observez la morphologie et la densité vasculaires en calculant le diamètre et le nombre de changements de vaisseaux.- Exécutez le logiciel Image J (voir le tableau des matériaux).
- Cliquez sur Fichier et sélectionnez Ouvrir pour ouvrir les images des vaisseaux sanguins capturées au microscope à deux photons.
- Sélectionnez Image et définissez Type sur 16 bits pour convertir le format d’image.
- Sélectionnez Analyser et sélectionnez Zone, Moyenne, IntDen sous Définir les mesures. Cliquez sur OK pour confirmer.
- Sous Analyser, sélectionnez Outils, ouvrez ROI Manager, puis sélectionnez Afficher tout et Étiquettes.
- Mesurer la valeur de l’intensité de fluorescence intravasculaire : cliquez sur l’outil lasso de l’interface principale pour esquisser le contour du vaisseau sanguin. Cliquez sur Ajouter dans ROI Manager. Suivez cette étape pour continuer à sélectionner plusieurs navires. Sélectionnez tous les objets du ROI Manager et cliquez sur Mesurer.
- Mesurer la valeur d’intensité de fluorescence totale : définissez le contour de l’image entière, cliquez sur Mesurer, et le résultat est la valeur d’intensité de fluorescence totale de l’image.
- Calculer la valeur d’intensité de fluorescence extravasculaire. Copiez les données dans Excel pour le calcul. Rapport d’intensité de fluorescence extravasculaire = (1 − valeur d’intensité de fluorescence intravasculaire/valeur d’intensité de fluorescence totale) × 100%.
5. Applications en aval
- Au cours de l’expérience, calculez le débit sanguin en mesurant la distance qu’un globule rouge (représenté par un point noir au microscope à deux photons)4 subit dans une durée donnée.
- Pour visualiser le mouvement des cellules sanguines à travers les cellules endothéliales, marquez les cellules sanguines par fluorescence. Ensuite, injectez les cellules marquées par fluorescence avec FD4 ou RD70 via la veine de la queue de la souris. Après avoir circulé pendant 5 min, tracez les cellules intéressées pendant un certain temps.
REMARQUE : Un total de 2 lymphocytes marqués à 2 x 106 CFSE (ester de carboxyfluorescéine succinimidyl, un colorant fluorescent perméable à la membrane) dérivés de la rate de souris donneuses ont été transférés chez des receveurs par injection veineuse de la queue, et l’infiltration de lymphocytes dans les SMG a été étudiée dans des modèles animaux expérimentaux4.
6. Soins et rétablissement des animaux
- Prenez bien soin des animaux tout au long de l’expérience.
REMARQUE : Assurez-vous que l’animal qui a subi une intervention chirurgicale n’est pas retourné en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétabli pendant l’expérience. - Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience.
REMARQUE: Observez l’état respiratoire des souris en continu et gardez-les au chaud en les plaçant sur le coussin chauffant de l’animal. Fournir un logement de récupération de la douleur postopératoire et une analgésie, tel que recommandé par le comité local d’éthique animale.
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Résultats
Conformément au protocole, le SMG unilatéral a été attaché à un support sur mesure, et la glande a été maintenue aussi loin que possible du corps de la souris pour empêcher la respiration de provoquer des artefacts de mouvement. Le flux rapide des globules rouges (points noirs) dans les vaisseaux sanguins a été observé au microscope. Après avoir trouvé le champ tissulaire sous une lentille oculaire, il faut passer à manipuler le logiciel du microscope. Dans le groupe témoin, les deux traceurs existaient dans les vaisseau...
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Discussion
Le maintien et la régulation de la fonction barrière endothéliale sont essentiels à l’homéostasie vasculaire. Les cellules endothéliales et leurs jonctions intercellulaires jouent un rôle essentiel dans le maintien et le contrôle de l’intégrité vasculaire12. La force de cisaillement du flux sanguin, les facteurs de croissance et les facteurs inflammatoires peuvent provoquer des changements dans la perméabilité vasculaire et, ainsi, participer à l’apparition et au développement de maladies systémiq...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 et 81974151) et la Fondation des sciences naturelles de Beijing (subvention 7202082).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope à 2 photons (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Allemagne | ||
| 4 kDa dextran marqué FITC | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Séparation des tissus émoussés nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Crème dépilatoire | Veet | ||
| Seringue stérile jetable | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Seringue à insuline | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1,5 mL |
| tamponné au phosphate saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Ciseaux à tissus | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoéthanol | JITIAN Bio | JT0781 |
Références
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Réimpressions et autorisations
