Etude des fonctions et activités du co-transporteur neuronal K-CL KCC2 par transfert Western

Résumé

Le présent protocole met en évidence l’application de la technique de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du cotransporteur neuronal K-Cl KCC2. Le protocole décrit l’étude de la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007 par transfert Western. En outre, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’activité de KCC2 sont brièvement mises en évidence dans ce texte.

Résumé

Les cotransporteurs de chlorure de potassium 2 (KCC2) font partie de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure cationique (CCC), présents exclusivement dans le neurone et sont essentiels au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl^- et par conséquent à l’inhibition fonctionnelle du GABAergique. L’échec de la régulation correcte de KCC2 est délétère et a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie. Des progrès considérables ont été accomplis dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédité pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Ici, le protocole souligne comment étudier la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases - Thr906 et Thr1007 - en utilisant la technique de transfert western. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire. Quelques-unes de ces techniques supplémentaires seront brièvement discutées dans ce manuscrit.

Introduction

Le cotransporteur de chlorure de potassium 2 (KCC2) est un membre de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure de cations (CCC), présents exclusivement dans le neurone et est essentiel au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl^- et par conséquent à l’inhibition GABAergique fonctionnelle 1,2,3,4. Le maintien d’une faible concentration intraneuronale de Cl- ([Cl-]_i) à ^4-6 mM par KCC2 facilite l’hyperpolarisation de l’acide γ-aminobutyrique (GABA)/glycine et l’inhibition synaptique dans le cerveau et la moelle épinière⁵. L’échec de la régulation correcte de KCC2 a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie⁴. De plus, une diminution de l’extrusion Cl⁻ médiée par KCC2 et une altération des courants hyperpolarisants médiés par le GABA_A et/ou les récepteurs de glycine ont été impliqués dans l’épilepsie, la douleur neuropathique et la spasticité ^6,7. Le KCC2 neuronal est modulé négativement par phosphorylation de résidus régulateurs clés dans son domaine intracellulaire C-terminal par le complexe de signalisation kinase proline/alanine-rich (SPAK)/sensible au stress oxydatif (OSR)^lié à la proline/SPS1 sans lysine (WNK)-STE20/SPS1, qui facilite le maintien de l’activité dépolarisée du GABA dans les neurones immatures ^2,8,9 . Le WNK-SPAK/OSR1 phosphoryle les résidus de thréonine 906 et 1007 (Thr906/Thr1007) et régule par la suite à la baisse l’expression du gène de l’ARNm de KCC2, entraînant une détérioration conséquente de sa fonction physiologique ^8,10. Plus important encore, cependant, il est déjà un fait que le complexe kinase WNK-SPAK/OSR1 est connu pour phosphoryler et inhiber l’expression de KCC2 1,2,4,11,12, et que l’inhibition des voies de signalisation du complexe kinase pour phosphoryler Thr906/Thr1007 a été liée à l’expression accrue du gène de l’ARNm KCC2 ^13,14,15 . Il est important de noter que la régulation de l’expression neuronale KCC2 et Na+-K⁺-2Cl^- cotransporteurs 1 (NKCC1) via la phosphorylation des protéines fonctionne de manière concomitante et inverse 1,4,16.

Des progrès constants et considérables ont été accomplis en ce qui concerne la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédités pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Le protocole présenté ici met en évidence l’application des techniques de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du co-transporteur neuronal K⁺-Cl^- KCC2 en étudiant la phosphorylation du cotransporteur sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007.

Le transfert Western est une méthode utilisée pour détecter des protéines spécifiques d’intérêt à partir d’un échantillon de tissu ou de cellule. Cette méthode sépare d’abord les protéines par taille par électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées électrophoristiquement sur un support solide (généralement une membrane) avant que la protéine cible ne soit marquée à l’aide d’un anticorps spécifique. Les anticorps sont conjugués à différents marqueurs ou anticorps conjugués au fluorophore qui sont détectés à l’aide de méthodes colorimétriques, de chimiluminescence ou de fluorescence. Cela permet de détecter une protéine cible spécifique à partir d’un mélange de protéines. Cette technique a été utilisée pour caractériser les sites phosphospécifiques des KCC¹ et a été utilisée pour identifier les inhibiteurs de kinases qui inhibent la phosphorylation KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. En suivant ce protocole, on peut détecter spécifiquement KCC2 total et phosphorylé à partir de lysats cellulaires / tissulaires. En principe, la détection d’anticorps conjugués aux protéines par cette technique est très instrumentale car elle permet d’améliorer la compréhension des activités coopératives sur les sites phosphographiques de KCC2, ce qui met en lumière les mécanismes moléculaires impliqués dans leurs régulations physiologiques. L’analyse quantitative de l’expression totale des protéines est représentative de la fonction et de l’activité de KCC2. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire.

Protocole

REMARQUE : Le protocole décrit la méthode de transfert Western pour détecter des protéines d’intérêt spécifiques.

1. Culture cellulaire et transfection

1. Réchauffer tous les réactifs dans le bain de billes (37 °C) avant la procédure de culture cellulaire. Préparer le milieu de culture, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de L-glutamine de 2 mM, 100 fois plus d’acides aminés non essentiels, 100 mM de pyruvate de sodium et 100 unités/ml de pénicilline-streptomycine.
2. Décongeler de manière stable les cellules embryonnaires rénales humaines KCC2b du rat KCC2b (HEK293^rnKCC2b)¹⁸ complètement dans le bain de billes (37 °C). Transférer les cellules du tube cryovial dans un tube centrifuge contenant 5 mL de fluide frais. Faites tourner la cellule à 1200 ×g pendant 3-5 min.
3. Utilisez une pipette d’aspiration (fixée à une pompe à vide) pour aspirer le surnageant et ajoutez 10 ml de fluide frais pour remettre les cellules en suspension. Transférer la suspension cellulaire dans une assiette à plat de 10 cm.
4. Placer la capsule dans l’incubateur et laisser pousser pendant 48 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO₂ . Surveiller la période d’incubation pour assurer une croissance cellulaire saine. Divisez davantage les cellules lorsqu’elles ont atteint plus de 90% de confluence après la période d’incubation.
5. Aspirer les vieux milieux hors du plat de cellules et rincer doucement les cellules avec 2 mL de solution saline tampon phosphate (PBS). Ajouter 2 mL de trypsine et incuber pendant environ 1-2 minutes à température ambiante.
6. Utilisez 2 mL de média complet pour laver délicatement les cellules trypsinisées dans le plat. Ajouter 9 ml de produits frais aux nouveaux plats et ajouter 1 ml de solution de l’ancien plat à chacun des nouveaux. Transférer les antennes à cellules divisées dans l’incubateur pendant 48 h pour atteindre ≥ confluence de 90%.
7. Traiter les cellules avec soit du diméthylsulfoxyde (DMSO) comme témoin, 8 μM de staurosporine, ou 0,5 mM N-éthylmaléimide (NEM) pendant 15 minutes avant de récolter les cellules dans le tampon de lyse.

2. Préparation des lysats cellulaires et chargement des échantillons

1. Aspirer les médias sur le plat de culture (à partir des procédures de transfection). Placez la culture cellulaire sur de la glace et lavez les cellules avec du PBS glacé.
2. Aspirer le PBS, puis ajouter 1,0 mL de tampon de lyse glacée contenant 50 mM de tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d’acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique (EGTA), 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 50 mM de fluorure de sodium, 5 mM de pyrophosphate de sodium, 10 mM de sodium-β-glycérophosphate, 1 mM d’orthovanadate de sodium, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M de saccharose, 1 mM de benzamine, 0,1 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol et 2 mM de phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF) dans la boîte.
   REMARQUE : Le volume de tampon de lyse pendant la récolte des cellules varie selon la taille des plats, par exemple, 1 mL de tampon de lyse convient par 1 x 10⁷ cellules/boîte de 100 mm/150 cm 2 flacons, tandis que 0,5 mL convient par 5 x 10⁶ cellules/boîte de 60 mm/75 cm² flacons.
3. Utilisez un grattoir de cellules en plastique froid pour gratter les cellules du fond de la boîte, puis utilisez doucement une pipette pour transférer la suspension de cellules dans un tube de microcentrifugation déjà sur la glace. Agiter constamment le tube pendant 30 min à 4 °C.
4. Faites tourner les lysats cellulaires dans une centrifugeuse froide (4 °C) à 16 000 x g pendant 20 min, retirez doucement le tube de la centrifugeuse et placez-le sur de la glace. Recueillir le surnageant dans un tube frais prérefroidi et jeter le granulé.
   REMARQUE: Il peut être nécessaire de faire varier la force et le temps de centrifugation en fonction du type de cellule. Cependant, les directives générales encouragent la centrifugation à 16 000 x g pendant 20 min. Cependant, cela doit être déterminé pour chaque expérience. Par exemple, les cellules délicates comme les leucocytes ont besoin d’une vitesse de centrifugation très légère.

3. Préparation d’immunoprécipitants à partir de lysats cellulaires

1. Pipeter 300 μL de protéine-G-sépharose dans un tube microcentrifugeux. Faire tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jeter le surnageant.
2. Ajouter 500 μL de PBS et bien vorter la solution. Faire tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jeter le surnageant. Répétez cette étape.
3. Mélanger 1 mg d’anticorps anti-KCC2 Thr906 et anti-KCC2 Thr1007 avec 200 μL de billes de protéine G-sépharose et compléter le volume à 500 μL avec PBS. Agiter sur une plate-forme vibrante ou une roue tournante pendant 2 h à 4 °C. Lavez 2x avec PBS.
4. Effectuer la quantification des protéines sur les lysats de cellules entières et ajouter 1 mg du lysat cellulaire aux billes lavées. Incuber doucement dans un rotateur de bout en bout pendant 2 h à 4 °C. Faites tourner les billes et lavez-les 3x avec du PBS contenant 150 mM de chlorure de sodium (NaCl).
5. Lavez les immunoprécipitants (billes) 3x avec 200 μL de PBS. Remettez en suspension la pastille finale dans 100 μL de 1x tampon d’échantillon de sulfate de dodécyle de lithium (LDS).
6. Agiter les tubes dans un agitateur à rotor à température ambiante pendant 5 min et les incuber dans un bloc chauffant à 75 °C pendant 10 min. Centrifuger l’échantillon de chargement à 11 000 x g pendant 2 min et utiliser le surnageant pour le chargement du gel.

4. Exécution du transfert Western

1. Assembler l’appareil de coulée et verser le gel de séparation à 8 % fraîchement préparé (voir le tableau 1 pour la recette/préparation) pour couler le gel en laissant environ 2 cm d’espace à partir du haut du verre de coulée. Ajouter 200 μL d’isopropanol absolu à l’installation et laisser reposer à température ambiante pendant 60 min.
   REMARQUE : La recette du gel de polyacrylamide pour l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) dépend de la taille de la protéine d’intérêt (tableau 2). Par conséquent, notez la taille de la protéine avant de déterminer le pourcentage de gel souhaité.
2. Utilisez une pipette pour enlever l’isopropanol et rincez soigneusement le gel avec environ 200 μL d’eau distillée. Ajouter du gel empilable à 6 % fraîchement préparé (voir le tableau 1 pour la recette/préparation) pour remplir l’espace d’environ 2 cm sur la configuration de coulée. Ajuster délicatement dans le peigne du puits et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min.
3. Fixez le gel coulé dans le réservoir d’électrophorèse.
4. Dissoudre 30,3 g de Tris base, 144,1 g de glycine et 10 g de SDS dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer un tampon de transfert 10x. Préparer 1x tampon courant en ajoutant 10 ml de SDS à 10 % et 100 mL de tampon de transfert 10x à 890 mL d’eau distillée.
5. Versez 1x tampon courant dans le réservoir. Charger 5 μL de marqueur de poids moléculaire dans le premier puits et une quantité égale de protéines dans chaque puits du gel SDS-PAGE (entre 18 et 30 μL, selon la taille du peigne utilisé). Remplissez les puits vides avec 1x LDS et faites fonctionner le gel pendant environ 90-120 minutes à 120 V.
6. Dissoudre 58,2 g de Tris base et 29,3 g de glycine dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer 10x tampon de transfert. Activer la membrane de nitrocellulose avec 1x tampon de transfert contenant 20% de méthanol. Rincez le gel et la membrane avec le tampon de transfert et étalez-les délicatement sur la pile de préparation.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH des tampons de fonctionnement et de transfert car ils doivent être au pH optimal requis. Aussi, il est conseillé de préparer ces tampons et de les stocker à température ambiante avant l’expérience pour gagner du temps.
7. Disposez le sandwich à transférer dans cet ordre: électrode négative (cadre/extrémité noir) - mousse sandwich - papier filtre - gel FDS-PAGE rincé - membrane nitrocellulose rincée - papier filtre - mousse sandwich - électrode positive (cadre rouge). Empiler le sandwich assemblé dans le réservoir de transfert et fonctionner à 90 V pendant 90 min ou 30 V pendant 360 min.

5. Coloration des anticorps et développement de l’image

1. Retirez la membrane et laissez-la sécher. Bloquer la membrane pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un tampon de blocage fabriqué à partir de lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,1 % 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Incuber les membranes avec des dilutions appropriées d’anticorps primaires 8,15,19 et de bêta-actine (contrôle de charge) dans un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C. Lavez la membrane en trois lavages de 1x TBS-T pendant 5 min chacun.
   REMARQUE : L’incubation de la membrane séparée avec des contrôles de charge tels que les anticorps bêta-actine, alpha-tubuline ou glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase vise à normaliser les autres résultats du Western blot lors de la quantification ultérieure. La dilution recommandée pour chaque anticorps primaire est disponible dans le manuel du fabricant.
3. Incuber la membrane lavée avec un anticorps secondaire dilué 5000 fois dans un tampon bloquant pendant 60 min à température ambiante. Encore une fois, lavez la membrane 3x dans 1x TBS-T pendant 5 minutes chacune.
   REMARQUE : Il est fortement recommandé que l’anticorps secondaire soit élevé contre l’espèce chez laquelle l’anticorps primaire est élevé. Par exemple, si l’anticorps primaire de KCC2 total est anti-KCC2 de souris, alors l’anticorps secondaire pour l’anti-souris doit être utilisé.
4. Placez la membrane lavée sur la carte d’imagerie. Mélanger des volumes égaux de chaque réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) et étaler doucement la solution mélangée sur la membrane pour développer des signaux.

6. Acquisition d’images à l’aide d’un système d’imagerie et quantification des données

1. Transférez la carte d’imagerie dans le compartiment approprié du système d’imagerie pour l’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie sur l’ordinateur pour le traitement de l’image.
2. Dans la barre d’outils, cliquez sur Nouveau protocole et choisissez Single Channel (Canal unique). Cliquez sur Sélectionner sous la boîte de dialogue Imagerie sur gel/application, faites défiler jusqu’à Blot et sélectionnez Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Cliquez ensuite sur Configuration de l’accumulation de signaux pour définir la durée et le nombre d’images à acquérir.
3. Cliquez sur Position Gel sous la configuration du protocole et ajustez le gel dans le système d’imagerie si nécessaire. Cliquez sur Exécuter le protocole pour acquérir les images.
4. Cliquez avec le bouton droit sur l’une des images acquises sous la zone du catalogue d’images pour enregistrer les images sur l’ordinateur. Accédez à l’image souhaitée et cliquez sur Sélectionner une image et continuer dans la boîte de dialogue Exécuter.
5. Cliquez sur l’icône Transformation d’image pour ajuster le contraste et la saturation en pixels de l’image . Cliquez sur l’icône Capture d’écran dans la barre d’outils générale pour enregistrer l’image sur l’ordinateur en fonction du format d’image souhaité.
6. Mesurez les densités de bandes à l’aide du logiciel ImageJ et analysez-les à l’aide d’outils statistiques appropriés.

Résultats

Ici, le résultat représentatif présenté à la figure 1 a étudié l’impact de la staurosporine et de la NEM sur la phosphorylation médiée par WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 et NKCC1 dans les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable KCC2b (HEK^rnKCC2b)¹⁸ en utilisant la technique de transfert Western. Des détails complets sur les résultats représentatifs sont discutés dans Zhang et ^al.15. Semblable à NEM, la staurosporine es...

Discussion

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour mesurer les activités de SLC12 des CCC qui sont exprimées dans les neurones, y compris KCC2. Bon nombre de ces techniques se sont avérées améliorer les connaissances scientifiques sur l’analyse de la pertinence fonctionnelle de ces transporteurs et de leurs schémas structure-fonction dans différentes mutations liées à la maladie. De manière critique, il y a des avantages et des mises en garde aux différentes méthodes²¹. Cependant, le protocole expliqué...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
40 % d’acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Utilisé pour fabriquer du gel de séparation et d’empilage pour SDS-PAGE  ;
Ammonium par sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Utilisé pour fabriquer du gel de séparation et d’empilage pour SDS-PAGE  ;
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
anti-souris	Technologie de signalisation cellulaire	66002	Utilisé comme anticorps secondaire pour le western blot
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Université de Dundee	S763B	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
anti-lapin	Technologie de signalisation cellulaire	C29F4	Utilisé comme anticorps secondaire pour le western blot
anti-mouton	abcam	ab6900	Utilisé comme anticorps secondaire pour le western blot
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Utilisé comme anticorps primaire pour le
western blotanti-&beta ;-Tubuline III	Sigma-Aldrich	T8578	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
Benzamine	Merck UK	135828	Utilisé comme composant du tampon de lyse
Bêta-mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M3148	Utilisé comme composant du tampon de charge et du tampon de lyse
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Utilisé pour la quantification de la protéine de lysat
Appareil de coulée	Atto  ;	WSE-1165W	Utilisé pour exécuter l’électrophorèse de la page SDS
Centrifugeuse	Eppendorf	5804	Utilisé dans la préparation des lysats
Centrifugeuse	VWR	MicroStar 17R	Utilisée pour la filature d’échantillons
sulfoxyde de diméthyle (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Utilisé pour l’expérience de culture cellulaire
Lait écrémé séché	Marvel	N/A	Utilisé pour faire du blocage tampon
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Utilisé pour la culture cellulaire
réactif ECL	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Utilisé pour développer l’image pour le western blot
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Utilisé comme composant du tampon de lyse
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Utilisé comme composant de la lyse tampon
Électrophorèse Alimentation	BioRad	PowerPAC HC	Pour alimenter l’électrophorèse de la page SDS
Éthanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Utilisé pour la préparation d’équipements et d’environnements stérilisés
Sérum de veau fœtal -  ; inactivé thermiquement	Merck Life Sciences UK	F9665	Utilisé pour la culture cellulaire
Fumehood	Walker	A7277	Utilisé pour la culture cellulaire
Gel Blot - Whatman	GE Healthcare  ;	10426981	Utilisé dans le western blot pour faire du sandwich de transfert
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Utilisé pour fabriquer des tampons
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Utilisé pour tracer des graphiques et analyser des données pour le western blot
HCl	Acros Organics	10647282	Utilisé pour fabriquer du gel de séparation et d’empilage pour SDS-PAGE  ;
Bloc chauffant	Grant	QBT1	Utilisé pour chauffer les échantillons de chargement de WB
Cellules HEK293	Merck UK	12022001-1VL	Lignée cellulaire pour l’expérience de culture
ImageJ Software	Wayne Rasband et ses collaborateurs ; NIH, États-Unis  ;	ImageJ 1.53e	Utilisé pour mesurer les intensités de bande à partir d’images de western blot
Système d’imagerie	BioRad	ChemiDoc MP	Utilisé pour prendre des images de western blot
Incubateur	LEEC	LEEC precision 190D	Utilisé pour la culture cellulaire
Isopropanol	Honeywell	24137	Utilisé dans le gel de coulée pour l’électrophorèse
Solution de L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	Utilisé pour la culture cellulaire
Dodécylsulfate de lithium (LDS)	Novex	NP0008	Utilisé comme tampon de chargement pour le western blot
MEM Acide aminé non essentiel  ;	Merck Life Sciences UK	M7145	Utilisé pour la culture cellulaire
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5418	Utilisé pour la préparation de lysats pour le
lecteur de microplaques	WB BioRad	iMark	Utilisé pour la lecture de la concentration en protéines de lysat
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Utilisé pour modifier les images de western blot
Marqueur	de poids moléculaireBioRad	1610373	Utilisé pour le western blot
N-éthylmaléimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Utilisé pour l’expérience de culture cellulaire
Membrane nitrocellulosique	Fisher Scientific	45004091	Utilisé pour le western blot
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140122	Utilisé pour la culture cellulaire
PH-mètre	Mettler Toledo	Seven compact s210	Utilisé pour surveiller le pH des solutions tampons
Phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Utilisé comme composant du tampon de lyse
Tampon phosphate Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Utilisé pour la culture cellulaire
PKC&delta ; pThr505	Technologie de signalisation cellulaire	9374	Utilisé comme anticorps primaire pour le western blot
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Utilisé pour l’immunoprécipitation
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S7653	Utilisé comme composant du tampon de lavage
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich S7653		Utilisé pour préparer le tampon TBS-T
Dodécylsulfate de sodium	Sigma-Aldrich	L5750	Utilisé pour fabriquer du gel de séparation et d’empilage pour SDS-PAGE  ;
orthovanadate de sodium	Sigma-Aldrich	S6508	Utilisé comme composant du tampon de lyse
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	S8636	Utilisé pour la culture cellulaire
sodium-&bêta ;-glycérophosphate	Merck UK	G9422	Utilisé comme composant du tampon de lyse
Staurosporine (de Streptomyces sp.)	Fournitures de laboratoire scientifique, Royaume-Uni	S4400-1MG	Utilisé pour l’expérience de culture cellulaire
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Utilisé comme composant du tampon de lyse
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Utilisé pour fabriquer du gel de séparation et d’empilement pour SDS-PAGE  ;
Chambre de transfert	BioRad	1658005EDU	Utilisé en western blot pour transférer des protéines sur la membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Utilisé pour fabriquer du gel de séparation et d’empilage pour SDS-PAGE  ;
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Utilisé comme composant du tampon de lyse
Solution trypsine-EDTA	Merck Life Sciences UK	T4049	Utilisé pour la culture cellulaire
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Utilisé comme marque tampon TBS-T
Pompe à vide	Charles Austen	Dymax 5	Utilisé pour la culture cellulaire
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Utilisé dans la préparation d’échantillons
Mélangeur Vortex	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  ; K-550-GE	Utilisé pour mélanger l’échantillon résolu
Bain d’eau	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Utilisé pour incuber des solutions