Le protocole actuel offre une méthode efficace et flexible pour isoler l’ARN des fractions nucléaires et cytoplasmiques à l’aide de cellules en culture, puis valider à l’aide de la qPCR. Cela sert efficacement de remplacement pour d’autres kits de préparation d’ARN.
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Article de méthode
Préparation d’ARN longs cytoplasmiques et nucléaires à partir de cellules primaires et en culture
Dans cet article
Résumé
Résumé
La séparation des composants intracellulaires est un outil clé en biologie cellulaire depuis de nombreuses années et a permis de fournir des informations utiles sur la façon dont leur emplacement peut avoir un impact sur leur fonction. En particulier, la séparation de l’ARN nucléaire et cytoplasmique est devenue importante dans le contexte des cellules cancéreuses et de la recherche de nouvelles cibles pour les médicaments. L’achat de trousses pour l’extraction d’ARN cytoplasmique nucléaire peut être coûteux lorsque de nombreux matériaux requis peuvent être trouvés dans un laboratoire typique. En utilisant la méthode actuelle, qui peut remplacer des kits plus coûteux ou d’autres processus fastidieux, seuls un tampon de lyse maison, une centrifugeuse de paillasse et des colonnes de purification d’isolement d’ARN sont nécessaires pour isoler l’ARN nucléaire et cytoplasmique. Le tampon de lyse est utilisé pour lyser doucement la membrane externe de la cellule sans affecter l’intégrité de l’enveloppe nucléaire, ce qui permet de libérer ses composants intracellulaires. Ensuite, les noyaux peuvent être isolés par une simple étape de centrifugation puisqu’ils possèdent une densité plus élevée que la solution de lyse. La centrifugation est utilisée pour séparer ces zones en fonction de leurs différences de densité afin d’isoler les éléments subcellulaires du noyau de ceux du cytoplasme. Une fois que la centrifugation a isolé les différents composants, un kit de nettoyage de l’ARN est utilisé pour purifier la teneur en ARN, et la qPCR est réalisée pour valider la qualité de la séparation, quantifiée par la quantité d’ARN nucléaire et cytoplasmique dans les différentes fractions. Des niveaux statistiquement significatifs de séparation ont été atteints, illustrant l’efficacité du protocole. En outre, ce système peut être adapté pour l’isolement de différents types d’ARN (total, petit ARN, etc.), ce qui permet une étude ciblée des interactions cytoplasme-noyau et aide à comprendre les différences dans la fonction de l’ARN qui résident dans le noyau et le cytoplasme.
Introduction
Le fractionnement cellulaire en composants subcellulaires permet d’isoler et d’étudier des domaines biochimiques définis et aide à déterminer la localisation de processus cellulaires spécifiques et comment cela peut affecter leur fonction1. L’isolement de l’ARN à partir de différents emplacements intracellulaires peut permettre d’améliorer la précision de l’analyse génétique et biochimique des événements au niveau de la transcription et d’autres interactions entre le noyau et le cytoplasme, ce qui constitue l’objectif principal du protocole actuel2. Ce protocole a été développé pour assurer l’isolement des ARN cytoplasmiques et nucléaires afin de déterminer leurs rôles respectifs dans l’exportation nucléaire et de comprendre comment la localisation subcellulaire des ARN dans le noyau et le cytoplasme peut avoir un impact sur leur fonction dans les processus cellulaires. En utilisant des matériaux provenant d’un laboratoire typique, il a été possible de réaliser un fractionnement nucléaire et cytoplasmique plus efficace et moins coûteux que les protocoles précédemment établis sans compromettre la qualité des résultats3.
De plus, l’échange de molécules entre le cytoplasme et le noyau peut être étudié directement en séparant ces régions. Plus précisément, la compréhension du transcriptome est essentielle pour comprendre le développement et la maladie. Cependant, les ARN peuvent être à des niveaux de maturation différents à un moment donné et peuvent compliquer l’analyse en aval. Ce protocole permet d’isoler l’ARN des fractions subcellulaires nucléaires et cytoplasmiques, ce qui peut aider à l’étude de l’ARN et permettre une meilleure compréhension d’un ARN d’intérêt particulier, comme la localisation d’ARN non codants ou l’analyse des jonctions d’épissage dans le noyau.
Ce protocole a été optimisé pour isoler les ARN longs cytoplasmiques et nucléaires, y compris les ARNm, les ARNr et les ARN longs non codants (ARNnc), en raison de la sélectivité de la taille de la colonne de purification de l’ARN utilisée, qui peut être modifiée pour isoler d’autres ARN d’intérêt. Auparavant, la fonction des ARN longs, tels que les ARNm et les ARNnc, dépendait fortement de leur localisation respective dans la cellule 4,5. Par conséquent, l’étude de l’exportation du noyau vers les domaines subcellulaires est devenue plus ciblée sur la compréhension du rôle que l’exportation d’ARN ou d’autres composants cellulaires peut avoir sur la cellule. Les ARNnc en sont un excellent exemple, car leur traduction et leurs effets ultérieurs reposent en grande partie sur la proximité et les interactions avec d’autres formes d’ARN6. De plus, l’échange d’éléments cellulaires entre les régions nucléaires et cytoplasmiques est lié à des mécanismes de résistance à divers traitements contre le cancer7. L’isolement des compartiments intracellulaires a permis le développement d’inhibiteurs d’exportation nucléaire, ce qui a atténué les effets des mécanismes de résistance à différentes thérapies8.
Après la séparation de l’ARN nucléaire et cytoplasmique, des étapes sont effectuées pour purifier l’ARN d’intérêt. Étant donné que les kits de purification de l’ARN se trouvent couramment dans les laboratoires et fonctionnent pour purifier et isoler les ARN longs, ils servent bien l’objectif de ce protocole. Pour la purification de l’ARN, la génération de rapports 260:280 supérieurs à 1,8 est essentielle pour assurer la qualité des échantillons pour le séquençage de l’ARN ou d’autres procédures similaires nécessitant des niveaux élevés de pureté et d’isolement. Des valeurs irrégulières de 260:280 indiquent une contamination par le phénol, démontrant un mauvais isolement et donnant des résultats inexacts9.
Une fois que la purification de l’ARN est terminée et que les valeurs 260:280 sont confirmées comme étant supérieures à une plage acceptable, la qPCR a été utilisée pour valider les résultats d’isolement des fractions nucléaires et cytoplasmiques. Ce faisant, des amorces spécifiques à la région d’intérêt ont été utilisées pour démontrer les niveaux de fractionnement nucléaire et cytoplasmique. Dans ce protocole, MALAT1 et TUG1 ont été utilisés comme marqueurs nucléaires et cytoplasmiques, respectivement10. Ensemble, ils permettent de démontrer des niveaux élevés de fractionnement nucléaire avec MALAT1, tandis que le fractionnement cytoplasmique devrait être faible. Inversement, lorsque TUG1 est utilisé, les niveaux de fractionnement cytoplasmique devraient être plus élevés que les niveaux de fractionnement nucléaire.
En utilisant ce protocole, il a été possible d’isoler les ARN en fonction de leur position d’action dans la cellule. En raison de l’accès généralisé à de nombreux matériaux et de l’utilisation de tampons de lyse et de techniques de centrifugation basées sur la densité au cours de cette expérience, l’applicabilité à d’autres types d’ARN et à d’autres composants cellulaires est répandue. Cela peut fournir des informations importantes en mettant en lumière des événements d’expression spécifiques à un lieu qui seraient autrement impossibles à distinguer sans séparation.
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Protocole
Des cellules K562 sont utilisées pour la présente étude. Ce protocole a été optimisé pour fonctionner pour 1 x 10 6-5 x 106 millions de cellules. Cependant, la procédure peut être mise à l’échelle pour de plus grandes quantités de cellules en augmentant les volumes de manière appropriée.
1. Préparation du tampon de lyse 0,25x
- Préparez un tampon de lyse 0,25x en mélangeant les composants suivants fournis dans le tableau 1A.
REMARQUE : Les échantillons nécessitent environ 300 μL de tampon de lyse 0,25x. Volume recommandé = nombre d’échantillons x 300 μL.
2. Séparation des fractions nucléaire et cytoplasmique
- Ensemencer les cellules à l’aide de tubes de 1,5 mL par centrifugation pendant 5 min à 2000 x g (température ambiante). Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette d’aspiration.
REMARQUE: Les cellules K562 ont été utilisées pendant ce protocole. Cependant, le protocole peut être adapté à différentes lignées cellulaires. - Remettez la pastille en suspension dans 300 μL de tampon de lyse 0,25x glacé.
REMARQUE: Garder sur la glace pendant 2 minutes et tourner le tube toutes les 45 s pour assurer une bonne lyse des cellules. - Faire tourner les tubes à la vitesse maximale (12 000 x g) à 4 °C pendant 2 min.
- Après la centrifugation, retirez délicatement le surnageant et placez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ce sera la fraction cytoplasmique. Environ 300 μL de la fraction cytoplasmique seront atteints.
- La pastille restante sera la fraction nucléaire. Ajouter 500 μL de PBS glacé à la pastille et centrifuger à 2 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
REMARQUE: Au cours de cette étape, l’excès d’ADN est retiré.
3. Nettoyage de l’ARN à l’aide d’un kit de purification de l’ARN
REMARQUE : Ce protocole a été réalisé à l’aide d’une trousse de purification de l’ARN disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Séparez les échantillons d’ARN cytoplasmique et les échantillons cytoplasmiques nucléaires (car les étapes de fractionnement varient d’un individu à l’autre).
- Pour séparer la fraction cytoplasmique, ajouter brièvement 1 050 μL de tampon de lyse RLT 3,5x (voir le tableau des matériaux) et le vortex. Ensuite, ajoutez 750 μL d’éthanol à 90% et chargez-le sur la colonne à partir du kit de nettoyage de l’ARN.
REMARQUE: La solution doit être bien mélangée avant d’être chargée sur la colonne. - Pour séparer la fraction nucléaire, ajoutez 600 μL de tampon de lyse 3,5x et de vortex. Ensuite, ajoutez 600 μL d’éthanol à 70%.
- Pour séparer la fraction cytoplasmique, ajouter brièvement 1 050 μL de tampon de lyse RLT 3,5x (voir le tableau des matériaux) et le vortex. Ensuite, ajoutez 750 μL d’éthanol à 90% et chargez-le sur la colonne à partir du kit de nettoyage de l’ARN.
- Charger les fractions cytoplasmiques et nucléaires sur les colonnes d’ARN (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Pour le reste de l’étape 3, les échantillons cytoplasmiques et nucléaires suivent la même procédure. Cependant, assurez-vous que ces échantillons restent indépendants les uns des autres.- Charger les fractions cytoplasmiques et nucléaires sur les colonnes d’ARN et faire tourner pendant 30 s à 8 000 x g à température ambiante. Jetez l’excès de débit.
- Ajouter 350 μL de tampon de lavage à partir d’un kit de purification disponible dans le commerce (tampon RW1, voir le tableau des matériaux), essorer à nouveau et éliminer le flux.
- Ajouter la solution de DNAse (1U/uL) pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez 350 μL de tampon de lavage, essorez à nouveau et jetez le flux à travers.
- Ajouter 500 μL de tampon de lavage doux (RPE, voir le tableau des matériaux), tourner à nouveau et éliminer l’écoulement. Ajouter 500 μL de tampon de lavage doux, tourner à nouveau, mais seulement pendant 2 min.
- Déplacez la colonne vers un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL et ajoutez 30 μL d’eau à la colonne de rotation. Laissez la colonne reposer pendant 1 min avant de tourner.
4. Validation de la séparation nucléo-cytoplasmique
- Effectuer la synthèse de l’ADNc
- Une fois que les compartiments subcellulaires de l’ARN ont été extraits et purifiés, confirmer la séparation des compartiments à l’aide de la qPCR. Pour ce faire, il faut d’abord convertir l’ARN en ADNc à l’aide d’un kit disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Préparer le mastermix de transcriptase inverse. Ajouter un ARN modèle. Incuber les réactions dans un thermocycleur.
REMARQUE : Pour les hexamères aléatoires, les paramètres de cyclage utilisés sont fournis dans le tableau 2A. Utiliser immédiatement la réaction de transcriptase inverse ou conserver à -20 °C (tableau 1B).
- Effectuer la réaction en chaîne quantitative de la polymérase (qPCR) et l’analyse.
- Diluer la synthèse de l’ADNc avec de l’eau DEPC (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une concentration finale de 20 ng/mL.
- À l’aide d’un mélange maître PCR, préparer la réaction pour chaque échantillon en suivant les instructions manuelles énumérées ci-dessous.
- Acquérir les sondes commerciales nécessaires pour détecter le fractionnement cytoplasmique et nucléaire. Utiliser MALAT1 comme marqueur nucléaire et TUG1 comme marqueur cytoplasmique (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Les séquences pour MALAT1 et TUG1 sont fournies dans le tableau 3. - Calculez le volume de chaque composant en multipliant chaque composant par 3 pour chacune des répliques techniques pour l’échantillon individuel.
- Pour chaque échantillon nucléaire et cytoplasmique, obtenir les mélanges suivants pour chacun : (a) Fraction nucléaire avec MALAT1, (b) Fraction cytoplasmique avec MALAT1, (c) Fraction nucléaire avec TUG1, et (d) Fraction cytoplasmique avec TUG1 (Tableau 1C).
- Vortex brièvement pour mélanger les solutions et transférer 20 μL du mélange dans chaque puits d’une plaque de réaction optique (voir le tableau des matériaux).
- Couvrir la plaque avec un film adhésif transparent utilisé pour la qPCR (voir le tableau des matériaux) et centrifuger brièvement la plaque pour éliminer les bulles d’air, puis faire tourner l’échantillon à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
- À l’aide d’un logiciel de conception et d’analyse (voir le tableau des matériaux), sélectionnez la courbe standard pour les paramètres de cyclage (tableau 2B).
- À l’aide du logiciel qPCR, sélectionnez Configurer l’exécution (Figure supplémentaire 1).
- Dans la page Propriétés du fichier de données, sélectionnez Paramètres de méthode et de cycle d’entrée dans le tableau 2B (Figure supplémentaire 2).
- Après avoir entré les paramètres du cycle, sélectionnez l’onglet Plaque et entrez les échantillons à exécuter (Figure supplémentaire 3). Sélectionnez Démarrer l’exécution.
REMARQUE : Les étapes décrites ont été effectuées dans une machine qPCR à l’aide d’un mélange maître disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Effectuer une analyse des données
- Une fois l’exécution terminée, créez une feuille de calcul de données avec le nom de l’échantillon, le nom de la cible et le cycle de quantification (Cq) (tableau supplémentaire 1).
- Commencez par les échantillons MALAT1 pour calculer la fraction nucléaire. Soustraire la fraction cytoplasmique MALAT1 de la fraction nucléaire MALAT1 (tableau 4).
- Ensuite, calculez le ΔCq (2^(-value)) (Tableau 5).
- Continuez avec les échantillons MALAT1 pour calculer la fraction cytoplasmique, soustrayez la fraction nucléaire MALAT1 de la fraction cytoplasmique MALAT1, puis calculez la ΔCq (2^(-value)) (Tableau 6).
NOTE: En regardant le ΔCq, on observe que la fraction nucléaire MALAT1 (surbrillance verte) a un marqueur MALAT1 plus grand que le cytoplasme (surbrillance rouge), mais maintenant une confirmation est nécessaire pour s’assurer que la fraction cytoplasmique est principalement du cytoplasme et que la fraction nucléaire ne contient pas de contamination cytoplasmique. - Avec les échantillons TUG1, effectuez le même calcul que ci-dessus (étapes 4.3.2-4.3.4) (tableau 7).
NOTE: En regardant le ΔCq, on observe que la fraction cytoplasmique TUG1 (surbrillance verte) a un marqueur TUG1 plus grand que la fraction nucléaire (surbrillance rouge), confirmant ainsi une bonne séparation des fractions cytoplasmiques et nucléaires (Tableau 8, Figure 1).
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Résultats
Pour s’assurer que l’isolement nucléaire et cytoplasmique avait été réalisé, une qPCR a été effectuée pour valider les résultats. Ce faisant, des amorces spécifiques à la région d’intérêt ont été utilisées pour démontrer les niveaux de fractionnement nucléaire et cytoplasmique. Dans cette étude, MALAT1 et TUG1 ont été utilisés comme amorces nucléaires et cytoplasmiques, respectivement. Ensemble, ils permettent de démontrer des niveaux élevés de fractionnement nucléaire avec MALAT1 comme témoin positif pour les éléments n...
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Discussion
Tout au long du protocole, certaines mesures ont été prises pour optimiser les éléments afin qu’ils soient les plus efficaces pour la lignée cellulaire d’intérêt. Bien que les étapes du protocole soient relativement simples, une analyse et des ajustements mineurs au cours des aspects critiques du protocole peuvent être nécessaires. L’étape la plus critique du protocole consiste à modifier la concentration du tampon de lyse à une concentration appropriée basée sur la lignée cellulaire d’intérêt et la cible cellulaire. Éta...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Soutenu par des subventions de l’American Society of Hematology, de la Robert Wood Johnson Foundation, de la Doris Duke Charitable Foundation, de la Edward P. Evans Foundation et du National Cancer Institute (1K08CA230319).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | Le système Agilent TapeStation est une solution d’électrophorèse automatisée pour le contrôle de la qualité des échantillons d’ADN et d’ARN. |
| 0,5 % Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Utilisé dans la fabrication du tampon de lyse |
| 50 mM Tris-Cl pH 8,0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Utilisé dans la fabrication du tampon de lyse |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilisé pour la confirmation de la fraction nucléaire. |
| Plaque de réaction optique MicroAmp à 96 puits avec code-barres | Thermo-Fischer | 4326659 | La plaque de réaction optique à 96 puits MicroAmp d’Applied Biosystems avec code-barres est optimisée pour offrir une précision et une uniformité de température inégalées pour une amplification PCR rapide et efficace. Cette plaque, fabriquée à partir d’une seule pièce rigide de polypropylène dans un format de 96 puits, est compatible avec les systèmes de PCR en temps réel à 96 puits et les thermocycleurs d’Applied Biosystems. |
| Le film | adhésif optique MicroAmp d'4311971Applied Biosystems réduit le risque de contamination de puits à puits et d’évaporation de l’échantillon lorsqu’il est appliqué sur une microplaque pendant la qPCR | ||
| PBS | Gibco | 20012-023 | La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est une solution saline équilibrée qui est utilisée pour une variété d’applications de culture cellulaire, telles que le lavage des cellules avant dissociation, le transport de cellules ou d’échantillons de tissus, la dilution de cellules pour le comptage et la préparation de réactifs. |
| d’ARN | Qiagen | 74106 | permettent un nettoyage efficace de l’ARN des réactions enzymatiques et un nettoyage de l’ARN purifié par différentes méthodes. Inclut les tampons RW1, RLT, RW1 mentionnés dans tout le protocole. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | utilisé pendant le protocole. Comprend un logiciel de conception et d’analyse pour l’analyse d’échantillons de fractionnement |
| Tampon RLT | Qiagen | 79216 | Tampon de lyse à partir d’ARN Kit de nettoyage |
| Tampon RPE | Qiagen | 1018013 | Tampon à partir d’ARN Kit de nettoyage |
| RW1 Tampon | Qiagen | 1053394 | Tampon à partir du kit de nettoyage d’ARN Tests d’expression |
| génique Taqman | Thermo-Fischer | 4331182 | Les tests d’expression génique TaqMan d’Applied Biosystems représentent la plus grande collection de tests préconçus de l’industrie, avec plus de 2,8 millions de tests sur 32 espèces eucaryotes et de nombreux microbes. Les tests d’expression génique TaqMan vous permettent d’obtenir des résultats rapidement sans perdre de temps à optimiser les amorces SYBR Green et sans passer de temps supplémentaire à exécuter et à analyser les courbes de fusion. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix est la solution de réactif idéale lorsque vous avez besoin d’un master mix pour plusieurs applications d’ADN nucléase 5'. Les réactifs d’Applied Biosystems ont été validés avec les tests TaqMan et les systèmes en temps réel d’Applied Biosystems pour garantir des performances sensibles, précises et fiables à chaque fois. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | utilisé pour la confirmation de la fraction cytoplasmique. |
| Eau traitée au DEPC UltraPure | Thermo-Fischer | 750024 | L’eau traitée au DEPC UltraPure peut être utilisée avec de l’ARN. Il est préparé par incubation avec 0,1 % de diéthylpyrocarbonate (DEPC), puis est autoclavé pour éliminer le DEPC. Filtré stérile. |
Références
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Réimpressions et autorisations
