Préparation d’ARN longs cytoplasmiques et nucléaires à partir de cellules primaires et en culture

Résumé

Le protocole actuel offre une méthode efficace et flexible pour isoler l’ARN des fractions nucléaires et cytoplasmiques à l’aide de cellules en culture, puis valider à l’aide de la qPCR. Cela sert efficacement de remplacement pour d’autres kits de préparation d’ARN.

Résumé

La séparation des composants intracellulaires est un outil clé en biologie cellulaire depuis de nombreuses années et a permis de fournir des informations utiles sur la façon dont leur emplacement peut avoir un impact sur leur fonction. En particulier, la séparation de l’ARN nucléaire et cytoplasmique est devenue importante dans le contexte des cellules cancéreuses et de la recherche de nouvelles cibles pour les médicaments. L’achat de trousses pour l’extraction d’ARN cytoplasmique nucléaire peut être coûteux lorsque de nombreux matériaux requis peuvent être trouvés dans un laboratoire typique. En utilisant la méthode actuelle, qui peut remplacer des kits plus coûteux ou d’autres processus fastidieux, seuls un tampon de lyse maison, une centrifugeuse de paillasse et des colonnes de purification d’isolement d’ARN sont nécessaires pour isoler l’ARN nucléaire et cytoplasmique. Le tampon de lyse est utilisé pour lyser doucement la membrane externe de la cellule sans affecter l’intégrité de l’enveloppe nucléaire, ce qui permet de libérer ses composants intracellulaires. Ensuite, les noyaux peuvent être isolés par une simple étape de centrifugation puisqu’ils possèdent une densité plus élevée que la solution de lyse. La centrifugation est utilisée pour séparer ces zones en fonction de leurs différences de densité afin d’isoler les éléments subcellulaires du noyau de ceux du cytoplasme. Une fois que la centrifugation a isolé les différents composants, un kit de nettoyage de l’ARN est utilisé pour purifier la teneur en ARN, et la qPCR est réalisée pour valider la qualité de la séparation, quantifiée par la quantité d’ARN nucléaire et cytoplasmique dans les différentes fractions. Des niveaux statistiquement significatifs de séparation ont été atteints, illustrant l’efficacité du protocole. En outre, ce système peut être adapté pour l’isolement de différents types d’ARN (total, petit ARN, etc.), ce qui permet une étude ciblée des interactions cytoplasme-noyau et aide à comprendre les différences dans la fonction de l’ARN qui résident dans le noyau et le cytoplasme.

Introduction

Le fractionnement cellulaire en composants subcellulaires permet d’isoler et d’étudier des domaines biochimiques définis et aide à déterminer la localisation de processus cellulaires spécifiques et comment cela peut affecter leur fonction¹. L’isolement de l’ARN à partir de différents emplacements intracellulaires peut permettre d’améliorer la précision de l’analyse génétique et biochimique des événements au niveau de la transcription et d’autres interactions entre le noyau et le cytoplasme, ce qui constitue l’objectif principal du protocole actuel². Ce protocole a été développé pour assurer l’isolement des ARN cytoplasmi....

Protocole

Des cellules K562 sont utilisées pour la présente étude. Ce protocole a été optimisé pour fonctionner pour 1 x 10 6-5 x 10⁶ millions de cellules. Cependant, la procédure peut être mise à l’échelle pour de plus grandes quantités de cellules en augmentant les volumes de manière appropriée.

1. Préparation du tampon de lyse 0,25x

1. Préparez un tampon de lyse 0,25x en mélangeant les composants suivants fournis dans le tableau 1A.
   REMARQUE : Les échantillons nécessitent environ 300 μL de tampon de lyse 0,25x. Volume recommandé = nombre d’échantillons x 300 μL.

Résultats

Pour s’assurer que l’isolement nucléaire et cytoplasmique avait été réalisé, une qPCR a été effectuée pour valider les résultats. Ce faisant, des amorces spécifiques à la région d’intérêt ont été utilisées pour démontrer les niveaux de fractionnement nucléaire et cytoplasmique. Dans cette étude, MALAT1 et TUG1 ont été utilisés comme amorces nucléaires et cytoplasmiques, respectivement. Ensemble, ils permettent de démontrer des niveaux élevés de fractionnement nucléaire avec MALAT1 comme témoin positif pour les éléments n.......

Discussion

Tout au long du protocole, certaines mesures ont été prises pour optimiser les éléments afin qu’ils soient les plus efficaces pour la lignée cellulaire d’intérêt. Bien que les étapes du protocole soient relativement simples, une analyse et des ajustements mineurs au cours des aspects critiques du protocole peuvent être nécessaires. L’étape la plus critique du protocole consiste à modifier la concentration du tampon de lyse à une concentration appropriée basée sur la lignée cellulaire d’intérêt et la cible cellulaire. Éta.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	Le système Agilent TapeStation est une solution d’électrophorèse automatisée pour le contrôle de la qualité des échantillons d’ADN et d’ARN.
0,5 % Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Utilisé dans la fabrication du tampon de lyse
50 mM Tris-Cl pH 8,0	Thermo-Fischer	15568025	Utilisé dans la fabrication du tampon de lyse
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilisé pour la confirmation de la fraction nucléaire.
Plaque de réaction optique MicroAmp à 96 puits avec code-barres	Thermo-Fischer	4326659	La plaque de réaction optique à 96 puits MicroAmp d’Applied Biosystems avec code-barres est optimisée pour offrir une précision et une uniformité de température inégalées pour une amplification PCR rapide et efficace. Cette plaque, fabriquée à partir d’une seule pièce rigide de polypropylène dans un format de 96 puits, est compatible avec les systèmes de PCR en temps réel à 96 puits et les thermocycleurs d’Applied Biosystems.
Le film	adhésif optique MicroAmp d'4311971Applied Biosystems réduit le risque de contamination de puits à puits et d’évaporation de l’échantillon lorsqu’il est appliqué sur une microplaque pendant la qPCR
PBS	Gibco	20012-023	La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est une solution saline équilibrée qui est utilisée pour une variété d’applications de culture cellulaire, telles que le lavage des cellules avant dissociation, le transport de cellules ou d’échantillons de tissus, la dilution de cellules pour le comptage et la préparation de réactifs.
d’ARN	Qiagen	74106	permettent un nettoyage efficace de l’ARN des réactions enzymatiques et un nettoyage de l’ARN purifié par différentes méthodes. Inclut les tampons RW1, RLT, RW1 mentionnés dans tout le protocole.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	utilisé pendant le protocole. Comprend un logiciel de conception et d’analyse pour l’analyse d’échantillons de fractionnement
Tampon RLT	Qiagen	79216	Tampon de lyse à partir d’ARN Kit de nettoyage
Tampon RPE	Qiagen	1018013	Tampon à partir d’ARN Kit de nettoyage
RW1 Tampon	Qiagen	1053394	Tampon à partir du kit de nettoyage d’ARN Tests d’expression
génique Taqman	Thermo-Fischer	4331182	Les tests d’expression génique TaqMan d’Applied Biosystems représentent la plus grande collection de tests préconçus de l’industrie, avec plus de 2,8 millions de tests sur 32 espèces eucaryotes et de nombreux microbes. Les tests d’expression génique TaqMan vous permettent d’obtenir des résultats rapidement sans perdre de temps à optimiser les amorces SYBR Green et sans passer de temps supplémentaire à exécuter et à analyser les courbes de fusion.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix est la solution de réactif idéale lorsque vous avez besoin d’un master mix pour plusieurs applications d’ADN nucléase 5'. Les réactifs d’Applied Biosystems ont été validés avec les tests TaqMan et les systèmes en temps réel d’Applied Biosystems pour garantir des performances sensibles, précises et fiables à chaque fois.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	utilisé pour la confirmation de la fraction cytoplasmique.
Eau traitée au DEPC UltraPure	Thermo-Fischer	750024	L’eau traitée au DEPC UltraPure peut être utilisée avec de l’ARN. Il est préparé par incubation avec 0,1 % de diéthylpyrocarbonate (DEPC), puis est autoclavé pour éliminer le DEPC. Filtré stérile.

Les kits de nettoyage Logiciel qPCR