Une nouvelle méthode de préparation d’échantillons est démontrée pour l’analyse de macrocolonies bactériennes à base d’agar par spectrométrie de masse par imagerie par désorption/ionisation laser assistée par matrice.
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Article de méthode
Étude de la coopération microbienne par imagerie par spectrométrie de masse Analyse de colonies bactériennes cultivées sur gélose et dans les tissus pendant l’infection
Dans cet article
Résumé
Résumé
Comprendre les conséquences métaboliques des interactions microbiennes qui se produisent pendant l’infection présente un défi unique dans le domaine de l’imagerie biomédicale. La spectrométrie de masse par imageur de désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) représente une modalité d’imagerie in situ sans marquage capable de générer des cartes spatiales pour une grande variété de métabolites. Bien que des échantillons de tissus à coupe mince soient maintenant analysés systématiquement au moyen de cette technologie, les analyses par spectrométrie de masse par imagerie de substrats non traditionnels, tels que les colonies bactériennes couramment cultivées sur gélose dans la recherche en microbiologie, restent difficiles en raison de la teneur élevée en eau et de la topographie inégale de ces échantillons. Cet article illustre un flux de travail de préparation d’échantillons permettant des analyses par spectrométrie de masse par imagerie de ces types d’échantillons. Ce processus est illustré par la co-culture bactérienne de macrocolonies de deux pathogènes gastro-intestinaux: Clostridioides difficile et Enterococcus faecalis. L’étude des interactions microbiennes dans cet environnement de gélose bien défini complète également les études tissulaires visant à comprendre la coopération métabolique microbienne entre ces deux organismes pathogènes dans des modèles murins d’infection. Les analyses par spectrométrie de masse par imagerie des métabolites des acides aminés arginine et ornithine sont présentées comme des données représentatives. Cette méthode est largement applicable à d’autres analytes, pathogènes microbiens ou maladies, et aux types de tissus où une mesure spatiale de la biochimie cellulaire ou tissulaire est souhaitée.
Introduction
Le microbiome humain est un écosystème hautement dynamique impliquant des interactions moléculaires de bactéries, de virus, d’archées et d’autres eucaryotes microbiens. Bien que les relations microbiennes aient été intensément étudiées ces dernières années, il reste encore beaucoup à comprendre sur les processus microbiens au niveau chimique 1,2. Cela est dû en partie à l’indisponibilité d’outils capables de mesurer avec précision des environnements microbiens complexes. Les progrès réalisés dans le domaine de la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) au cours de la dernière décennie ont permis une cartographie spatiale in situ et sans marquage de nombreux métabolites, lipides et protéines dans les substrats biologiques 3,4. La désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est devenue la technique d’ionisation la plus couramment utilisée en spectrométrie de masse par imagerie, impliquant l’utilisation d’un laser UV pour enlever du matériau de la surface d’une section mince de tissu pour la mesure par spectrométrie de masse4. Ce processus est facilité par l’application d’une matrice chimique appliquée de manière homogène à la surface de l’échantillon, ce qui permet d’effectuer des mesures séquentielles selon un motif raster sur toute la surface de l’échantillon. Des cartes thermiques des intensités ioniques de l’analyte sont ensuite générées après l’acquisition des données. Les progrès récents dans les sources d’ionisation et les techniques d’échantillonnage ont permis l’analyse de substrats non traditionnels tels que les spécimens cellulaires bactériens5 et 6,7,8 mammifères cultivés sur gélose nutritive. L’information spatiale moléculaire fournie par l’IMS peut fournir un aperçu unique de la communication biochimique des interactions microbe-microbe et hôte-microbe pendant l’infection 9,10,11,12,13,14.
Lors de l’infection à Clostridioides difficile (ICD), C. difficile est exposé à un environnement microbien en évolution rapide dans le tractus gastro-intestinal, où les interactions polymicrobiennes sont susceptibles d’avoir une incidence sur les résultats de l’infection15,16. Étonnamment, on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires des interactions entre C. difficile et le microbiote résident au cours de l’infection. Par exemple, les entérocoques sont une classe d’agents pathogènes commensales opportunistes dans le microbiome intestinal et ont été associés à une sensibilité accrue et à une gravité accrue de l’ICD 17,18,19,20. Cependant, on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires des interactions entre ces agents pathogènes. Pour visualiser la communication des petites molécules entre ces membres du microbiome intestinal, des macrocolonies bactériennes ont été cultivées ici sur gélose pour simuler les interactions microbe-microbe et la formation de biofilm bactérien dans un environnement contrôlé. Cependant, l’obtention de distributions métaboliques représentatives lors de l’analyse par spectrométrie de masse par imagerie MALDI d’échantillons de culture bactérienne est difficile en raison de la teneur élevée en eau et de la topographie de surface inégale de ces échantillons. Ceci est dû en grande partie à la nature hautement hydrophile de la gélose et à la réponse non uniforme de la surface de la gélose lors de l’élimination de l’humidité.
La teneur élevée en eau de la gélose peut également rendre difficile l’obtention d’un revêtement matriciel MALDI homogène et peut interférer avec l’analyse MALDI ultérieure effectuée sous vide21. Par exemple, de nombreuses sources MALDI fonctionnent à des pressions de 0,1 à 10 Torr, ce qui constitue un vide suffisant pour éliminer l’humidité de la gélose et peut provoquer une déformation de l’échantillon. Ces changements morphologiques dans la gélose induits par l’environnement sous vide provoquent des bulles et des fissures dans la gélose séchée. Ces artefacts réduisent l’adhérence de la gélose à la lame et peuvent provoquer le démontage ou l’écaillage de l’échantillon dans le système de vide de l’instrument. L’épaisseur des échantillons de gélose peut atteindre 5 mm de la lame, ce qui peut créer un dégagement insuffisant de l’optique ionique à l’intérieur de l’instrument, provoquant une contamination et/ou des dommages à l’optique ionique de l’instrument. Ces effets cumulatifs peuvent entraîner des réductions du signal ionique reflétant la topographie de surface, plutôt que les interactions biochimiques microbiennes sous-jacentes. Les échantillons de gélose doivent être séchés de façon homogène et fortement collés à une lame de microscope avant d’être analysés sous vide.
Cet article démontre un flux de travail de préparation d’échantillons pour le séchage contrôlé de macrocolonies de culture bactérienne cultivées sur des milieux gélosés. Ce processus de séchage plus lent en plusieurs étapes (par rapport à ceux signalés précédemment) garantit que la gélose se déshydratera uniformément tout en minimisant les effets de bulles ou de fissuration des échantillons de gélose montés sur des lames de microscope. En utilisant cette méthode de séchage progressif, les échantillons adhèrent fortement à la lame de microscope et se prêtent à une application ultérieure de matrice et à une analyse MALDI. Ceci est illustré par des colonies bactériennes modèles de C. difficile cultivées sur des modèles de gélose et de tissus murins hébergeant des ICD avec et sans la présence d’un agent pathogène commensale et opportuniste, Enterococcus faecalis. Les analyses de spectrométrie de masse d’imagerie MALDI des modèles bactériens et tissulaires permettent la cartographie spatiale des profils de métabolites d’acides aminés, fournissant de nouvelles informations sur le métabolisme microbien bioénergétique et la communication.
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Protocole
REMARQUE : Les expériences sur les animaux ont été approuvées par les comités de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital pour enfants de Philadelphie et de la Perelman School of Medicine de l’Université de Pennsylvanie (protocoles IAC 18-001316 et 806279).
ATTENTION : Clostridium difficile (C. difficile) et Enterococcus faecalis (E. faecalis) sont des agents pathogènes BSLII et doivent être manipulés avec une extrême prudence. Utilisez des protocoles de décontamination appropriés au besoin.
1. Croissance des macrocolonies de culture bactérienne et préparation pour l’expédition de nuit
- Préparer des cultures de C. difficile et d’E. faecalis pendant la nuit et les cultiver individuellement à 37 °C dans une chambre anaérobie (85 % d’azote, 10 % d’hydrogène, 5 % de dioxyde de carbone) dans un bouillon d’infusion cerveau-cœur complété par 0,5 % d’extrait de levure et 0,1 % de l-cystéine (BHIS). Utilisez une gélose à 1,5 % pour tous les échantillons plaqués.
- Normaliser le milieu de culture bactérien à la densité optique à 600 nm (OD600). Plaquer 5 μL de chaque macrocolonie sur des plaques de gélose BHIS + l-cystéine et développer en anaérobiose pendant 7 jours à 37 °C. Pour les macrocolonies d’espèces mixtes, mélanger les milieux de culture bactériens dans un rapport de 1:1 avant le placage.
- Préparez des lames de microscope revêtues d’oxyde d’indium-étain (ITO) à l’aide d’un ohmmètre pour identifier le côté de la lame avec le revêtement conducteur. Utilisez un scribe à pointe de diamant pour graver et étiqueter le côté recouvert d’ITO de la lame de microscope.
- Extrayez toute la culture de la plaque de croissance de gélose, puis montez sur une lame de microscope revêtue d’ITO tout en veillant à ce que les bulles d’air ne soient pas piégées entre la gélose et la lame.
REMARQUE: La teneur en eau dans le milieu gélosé devrait permettre à la culture d’adhérer naturellement à la surface de la lame de microscope. Une vidéo illustrant ce processus est fournie dans la documentation supplémentaire de Yang et al.22. - Placez les colonies dans des boîtes de diapositives de microscope pour les protéger. Entreposer les boîtes à glissière en 8 po x 8 dans des sacs de transport d’échantillons présentant un risque biologique avec une poignée de pastilles déshydratantes et un sceau pour l’expédition de nuit en vue d’un traitement et d’une analyse ultérieurs.
REMARQUE : Il est important de maintenir un environnement sec pour les cultures bactériennes lorsqu’elles sont expédiées dans des conditions ambiantes afin de ralentir la croissance et le métabolisme des bactéries et de maintenir la fixation des échantillons bactériens jusqu’à l’analyse. Cette méthode d’expédition a été optimisée grâce à des expériences approfondies et est préférée à l’expédition des colonies congelées dans de la glace sèche. Les changements importants de température avant le séchage ont tendance à provoquer le démontage et le barbotage sous l’échantillon de gélose montée.
2. Séchage ambiant des macrocolonies bactériennes de C. difficile + E. faecalis
- Retirez du matériau d’emballage les colonies bactériennes d’agarose montées sur des lames de microscope revêtues d’ITO. Placer les échantillons dans une boîte sèche avec dessiccant pendant 48-72 h à température ambiante.
REMARQUE: Il s’agit d’un processus de séchage doux et lent qui minimise le bouillonnement, la fissuration ou le détachement du produit gélosé de la surface de la lame de microscope. - Éliminez adéquatement tous les matériaux d’emballage contaminés et décontaminez l’espace de travail avec un désinfectant bactéricide/sporicide approprié.
- Inspecter visuellement les colonies pour déceler toute déformation à la surface de la gélose (p. ex., bouillonnement, fissuration, démontage).
REMARQUE : La hauteur de la surface de l’agarose doit diminuer visiblement et reposer à plat sur la glissière.
3. Séchage sous vide et thermomédié des macrocolonies bactériennes de C. difficile + E. faecalis
REMARQUE : Un appareil de séchage sous vide sur mesure (figure 1) a été construit pour faciliter l’élimination de l’excès d’humidité des échantillons de gélose. Cet appareil utilise une pompe à vide à palettes rotatives connectée en ligne à un biofiltre HEPA, un piège à froid et une chambre en acier inoxydable, où les échantillons bactériens sont placés. Un transformateur à tension variable est connecté à un filament de fil isolé, ce qui permet à l’utilisateur de chauffer la chambre pour accélérer le processus de séchage.
- Fermez la conduite de vide de la chambre d’échantillonnage et allumez l’interrupteur d’alimentation de la pompe à palettes rotatives pour permettre à la pompe à vide de se réchauffer et d’atteindre une pression de vide appropriée.
- Allumez le transformateur à tension variable pour chauffer le filament de fil enroulé autour de la chambre. Réglez l’alimentation variable jusqu’à ce que la température interne de la chambre à vide atteigne ~50 °C. Pendant que la pompe se réchauffe, placez une boue de glace sèche et d’éthanol à 100% dans le condenseur du piège à froid.
REMARQUE: Le piège à froid condense les vapeurs ou les spores de l’échantillon et évite la contamination du système de pompe à palettes rotatives et de l’huile de la pompe à vide. - Ouvrez la chambre à vide à l’aide d’une clé pour desserrer les pinces à double griffe de 16 mm. Insérez les échantillons d’agarose dans la chambre et scellez hermétiquement la chambre avec les pinces à bride à double griffe de 16 mm.
- Ouvrez la vanne de la pompe pour évacuer la chambre. Laisser sécher les échantillons pendant 60 à 120 minutes (p. ex., à ~150 mTorr).
REMARQUE: Ce temps de séchage est suffisant pour éliminer la majeure partie de l’humidité dans les petites sections de gélose. Une détermination empirique du temps de séchage optimal pour l’élimination de l’humidité et la diminution de la hauteur de gélose peuvent être nécessaires en fonction de la configuration et des échantillons individuels. Des temps de séchage beaucoup plus longs peuvent rendre la gélose séchée fragile et sujette à la fissuration. - Lorsque vous avez terminé, évacuez lentement la chambre à vide à la pression ambiante en fermant la vanne de la pompe à palettes et en ouvrant la vanne externe à l’air ambiant. Ouvrez la chambre en utilisant le protocole mentionné précédemment et retirez l’échantillon d’agarose séchée de la chambre.
- Conserver l’échantillon dans une boîte sèche avec dessiccant jusqu’à l’application de la matrice.
REMARQUE : La figure 2 montre des images de la surface de la gélose avant et après le séchage.
4. Application de matrice MALDI par pulvérisation robotisée
REMARQUE: Une fois que les échantillons d’agarose ont été soigneusement séchés et que la hauteur des sections de culture a sensiblement diminué, utilisez un pulvérisateur à matrice robotisée pour appliquer de manière homogène une fine couche d’un composé chimique de la matrice MALDI. Cette procédure doit être effectuée dans une hotte chimique et avec un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de laboratoire et une blouse de laboratoire.
- Sélectionnez la matrice MALDI appropriée. Pour suivre ce protocole, utilisez la matrice MALDI 1,5-diaminonaphtalène (DAN) pour sa désorption favorable et son ionisation des acides aminés en mode ion négatif.
- Préparer 10 mL d’une solution matricielle DAN MALDI à 10 mg/mL dans 90/10 (v/v)acétonitrile/eau. Utilisez des solvants de qualité HPLC, soniquez pendant 30 minutes et filtrez la solution à travers des filtres à seringue en nylon de 0,2 μm avant l’introduction dans la pompe à seringue robotisée du pulvérisateur. De plus, préparez des solutions de lavage pour vous assurer que la ligne du pulvérisateur est propre entre chaque utilisation.
NOTE: Les solutions de lavage sont choisies pour augmenter la solubilité de la matrice et d’autres contaminants dans la ligne de pulvérisation et faciliter leur élimination du système. Les solutions de lavage utilisées ici sont 90/10 (v/v) acétonitrile/eau, 50/50 (v/v) eau/méthanol, 99/1 (v/v) acétonitrile/acide acétique et 95/5 (v/v) eau/hydroxyde d’ammonium. - Fixez l’échantillon au plateau du pulvérisateur et chargez les solutions préparées dans la conduite du pulvérisateur (Figure 3). À l’aide du logiciel informatique, spécifier les paramètres nécessaires pour permettre un revêtement uniforme du composé matriciel : température de la buse à 30 °C, huit passages, débit de 0,1 mL/min, diagramme CC, temps de séchage de 0 s, 10 psi.
REMARQUE : Il est généralement admis que la plupart des agents pathogènes seront inactivés par l’application de la matrice MALDI, qui est généralement un petit acide organique ou une base. - Une fois la séquence de pulvérisation terminée, retirer l’échantillon du plateau du pulvérisateur et le conserver dans une armoire de dessiccation jusqu’à l’analyse.
5. Préparation des macrocolonies bactériennes pour l’acquisition de données de spectrométrie de masse par imagerie MALDI
REMARQUE : Toutes les analyses par spectrométrie de masse imageuse ont été effectuées à l’aide d’un spectromètre de masse par résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR). Cet instrument est équipé d’un système laser Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm).
- Insérez l’échantillon revêtu de matrice dans l’adaptateur de lames de microscope à plaque cible MALDI et écrivez au moins trois marqueurs fiduciaires qui englobent la zone d’échantillonnage à l’aide de marqueurs permanents (Figure 4). Utilisez un scanner à plat pour acquérir une image optique de la lame de microscope, y compris les marqueurs fiduciaires.
NOTE: Les marqueurs fiduciaires permettront l’enregistrement de l’image optique à la vue de la caméra MALDI observée dans l’instrument. - Définir une méthode d’instrument MS optimisée pour la plage de masse, la sensibilité et la résolution souhaitées, qui comprend l’étalonnage de masse, les réglages laser MALDI, les paramètres d’optique ionique et les conditions des cellules ICR. Pour cette méthode, sélectionner une fenêtre de masse de 100 Da de m/z 100 à 200 pour l’enrichissement du signal en phase gazeuse en mode ion négatif en utilisant une approche d’accumulation continue d’ions sélectionnés (CASI)23, qui englobe les valeurs m/z des métabolites d’intérêt.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images de l’instrument et utilisez l’assistant de configuration pour définir le nom et l’emplacement du fichier, la méthode d’acquisition MS, les régions d’intérêt à échantillonner et la résolution spatiale de l’image.
REMARQUE: Des résolutions spatiales de 100 à 300 μm sont généralement utilisées pour l’imagerie bactérienne des macrocolonies. - Une fois tous les paramètres définis, démarrez la séquence d’acquisition pour acquérir en série un spectre de masse à chaque pixel dans la ou les régions d’intérêt définies.
REMARQUE: Le temps d’acquisition de l’image dépend des paramètres de l’instrument, mais varie généralement de 2 à 6 h pour les images contenant 5 000 à 10 000 pixels.
6. Analyse des données de spectrométrie de masse par imagerie et identification des composés
- Après l’acquisition de l’image, enregistrez les données avec une extension de fichier « .mis », qui est un format de fichier spécifique au fournisseur pour les plates-formes de spectrométrie de masse d’imagerie. Ouvrez le fichier de données dans les progiciels flexImaging ou SCiLS ou exportez-le vers un format de données non propriétaire tel que .mzml et visualisez à l’aide d’un logiciel indépendant du fournisseur (par exemple, Cardinal24 ou MSIreader25,26).
REMARQUE : Un spectre de masse moyen s’affiche à l’ouverture des données d’imagerie dans flexImaging, qui représente l’intensité moyenne de tous les ions détectés dans les régions échantillonnées. Les pics d’intérêt peuvent être provisoirement identifiés sur la base de mesures de masse précises. En règle générale, des précisions de masse supérieures à 5 parties par million (ppm) sont suffisantes pour l’identification des métabolites sur les spectromètres de masse FTICR. - À l’aide du logiciel référencé, définissez des fenêtres de masse pour les pics d’intérêt afin de générer des cartes thermiques en fausses couleurs des distributions d’ions dans les régions échantillonnées.
- Sur l’affichage du spectre de masse moyenne, effectuez un zoom avant sur le pic d’intérêt et sélectionnez une fenêtre de masse appropriée qui englobe la zone du profil de crête.
- Faites un clic droit sur la fenêtre de masse en surbrillance et sélectionnez Ajouter un filtre de masse.... Étiqueter la valeur m/z sélectionnée en utilisant l’identification provisoire du métabolite suspect, déterminée par la mesure de masse précise à haute résolution.
- Sélectionnez le seuil d’intensité pour ajuster la plage dynamique de l’image de l’analyte affichée par la carte thermique en fausses couleurs. Ajustez davantage les paramètres de filtrage de masse afin que la fenêtre de masse englobe la zone du profil de crête, puis ajoutez le filtre de masse.
REMARQUE : La normalisation de l’intensité peut être effectuée de manière appropriée pour améliorer la quantification relative entre les régions mesurées. Les expériences présentées ici ont utilisé l’acquisition de données CASI (voir infra), ce qui peut rendre inexactes les méthodes de normalisation du nombre total d’ions (TIC) et du quadratique moyen (RMS). En tant que tel, toutes les images ioniques présentées ici sont affichées sans normalisation.
7. Préparation et expédition de tissus cæcaux de souris non infectés par des témoins et infectés par C. difficile
- Inoculer des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 à 8 semaines avec des antibiotiques (0,5 mg/mL de céfopérazone ou 0,5 mg/mL de céfopérazone + 1 mg/mL de vancomycine) dans de l’eau potable ad libitum pendant 5 jours, suivi d’une période de récupération de 2 jours et d’une infection subséquente.
- Euthanasier les animaux par asphixie au CO2 et récolter immédiatement l’organe de caecum de souris. Incorporer dans un mélange à 20% de composé à température de coupe optimale (OCT) dans de l’eau distillée.
- Placer les échantillons sur de la glace sèche, puis les emballer et les expédier pour analyse; conserver à -80 °C jusqu’à l’analyse.
8. Cryosectionnement de tissus cæcaux de souris infectés par le verus difficile témoin non infecté par C. difficile
- Nettoyez tout l’équipement de cryosectionnage en les rinçant à 100% d’éthanol et laissez sécher avant de placer les échantillons dans la chambre du cryostat. Préparez des lames de microscope revêtues d’ITO à l’aide d’un ohmmètre pour identifier le côté de la lame avec le revêtement conducteur. Utilisez un scribe à pointe de diamant pour graver et étiqueter le côté recouvert d’ITO de la lame de microscope.
REMARQUE : L’équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de laboratoire, une blouse de laboratoire et des manchons de cryostat, doit être porté. - Effectuer une cryosectionnement sur un cryomicrotome de recherche. Transférer les tissus céca de souris intégrés dans les OCT d’un congélateur à -80 °C vers la chambre cryomicrotome (température de la chambre à 30 °C, température de l’objet -28 °C) sur glace sèche. Montez les échantillons de tissus à comparer à l’aide de la spectrométrie de masse par imagerie (p. ex. témoin non infecté vs infecté par C. difficile) sur la même lame de microscope pour assurer une préparation identique des échantillons des deux types de tissus et permettre des comparaisons précises des métabolites.
- À l’intérieur de la chambre du cryomicrotome, montez le tissu incorporé dans les OCT sur un mandrin d’échantillon à l’aide d’une solution OCT supplémentaire. Une fois que la solution OCT s’est solidifiée, fixer le mandrin à la tête de l’échantillon. Commencer la cryosection par incréments de 10 à 50 μm pour atteindre la profondeur / le plan tissulaire souhaité de l’organe.
- Une fois qu’une section transversale optimale du tissu est atteinte, commencez à collecter des sections à 12 μm d’épaisseur. Manipulez délicatement la tranche à l’aide de pinceaux d’artiste et placez-la sur une lame de microscope recouverte de téflon.
- Roulez la lame de microscope recouverte d’ITO sur le dessus de la section de tissu pour ramasser le tissu de la lame recouverte de téflon. Décongelez la section de tissu sur la lame de microscope en appuyant la paume à l’arrière de la lame recouverte d’ITO. Continuez à décongeler jusqu’à ce que la section de tissu passe d’une texture translucide à une texture opaque/mate.
- Transférer les lames de microscope montées sur papier sur de la glace sèche dans une boîte sèche avec dessiccant pour le stockage pour l’analyse le jour même, ou stocker à -80 ° C pour un stockage à plus long terme.
9. Préparation de tissus cæcaux de souris non infectés par des témoins non infectés par C. difficile pour application matricielle et spectrométrie de masse par imagerie MALDI
- Effectuer l’application de la matrice MALDI en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4 (température de la buse 30 ° C, huit passages, débit de 0,1 ml / min, diagramme CC, temps de séchage 0 s, 10 psi).
- Effectuer la spectrométrie de masse par imagerie MALDI en utilisant les mêmes protocoles que ceux décrits aux étapes 5 et 6.
- Analysez les images ioniques provenant de plusieurs répétitions biologiques et comparez les résultats pour la signification via des comparaisons de diagrammes en boîte d’intensité à l’aide du logiciel statistique SCiLS référencé ci-dessus.
REMARQUE : Les tests et comparaisons statistiques appropriés dépendent de l’application et peuvent inclure une segmentation spatiale, des modèles de classification et une analyse comparative pour déterminer les caractéristiques spectrales discriminantes et corrélées. Les analyses comparatives peuvent inclure l’attribution de valeurs p à des caractéristiques significatives, la génération d’analyses en composantes principales pour les comparaisons tissulaires et la visualisation de diagrammes en boîte pour identifier les variations. Il est également utile de visualiser le tissu à l’aide de la microscopie à fond clair de la section de tissu colorée par hématoxyline et éosine (H & E) après spectrométrie de masse par imagerie. Cela permet d’identifier clairement les caractéristiques morphologiques dans le tissu et peut être analysé en consultation avec un pathologiste qualifié.
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Résultats
Nous avons effectué la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI des métabolites de colonies bactériennes modèles et de souris cocolonisées avec E. faecalis et C. difficile pour étudier le rôle des acides aminés dans les interactions microbe-microbe. Les macrocolonies bactériennes cultivées sur gélose servent de modèle bien défini pour analyser les changements biochimiques distincts dans la formation de biofilms bactériens. Il est important d’assurer un processus de séchage contrôlé pour les macrocolonies...
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Discussion
Lors de la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI, il est important d’avoir une surface d’échantillon plane pour fournir un diamètre focal constant du laser MALDI incident sur le substrat de l’échantillon. Les écarts dans la hauteur de l’échantillon peuvent provoquer un déplacement du faisceau laser MALDI, provoquant des modifications du diamètre et de l’intensité du faisceau, ce qui peut affecter l’efficacité de l’ionisation MALDI. Ces modifications de l’efficacité de l’ionisation peuvent entraîner des différences d’in...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) des National Institutes of Health (NIH) sous le prix GM138660. J.T.S. a été soutenu par la bourse d’été de la famille Charles et Monica Burkett de l’Université de Floride. J.P.Z. a été soutenu par les subventions K22AI7220 (NIAID) et R35GM138369 (NIGMS) des NIH. A.B.S. a été soutenu par la subvention de formation en biologie cellulaire et moléculaire de l’Université de Pennsylvanie (T32GM07229).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,2 &mu ; m Titan3 filtres à seringue en nylon | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphtalène MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject seringues luer lock | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 ; | |
| Vacuomètre à convection série 275i | la société Kurt J. Lesker KJL275807LL | ||
| spectromètre de masse 7T solariX FTICR équipé d’un système laser Smartbeam II Nd :YAG MALDI (2 kHz, 355 nm) ; | Bruker Daltonics | ||
| Solution d’acide acétique, adaptée à la HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acétonitrile, adaptée à la HPLC, grade de gradient, &ge ; 99,9 % | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Solution d’hydroxyde d’ammonium, 28 % NH3 dans H2O, &ge ; 99,99 % de base de métaux traces | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Sacs autoclavables pour matières contaminées : 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Sacs de transport d’échantillons pour matières dangereuses (8 x 8 po) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Cerveau cœur infusion | bouillon BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 souris mâles ; | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II scanner de photos et de documents | Canon | ||
| CM 3050S cryomicrotome de recherche | Leica Biosystems | ||
| Meuble dessiccateur | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Scribe à pointe de diamant, Microscopie électronique Sciences ; | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Granulés de dessiccant en drierite | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexLogiciel d’imagerie | Bruker Daltonics | ||
| ftmsLogiciel de contrôle | Bruker Daltonics | ||
| Piège à vide en verre | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| Pulvérisateur robotisé HTX M5 TM | HTX Technologies | ||
| Lames de microscope recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) | Technologies | CG-81IN-S115 | |
| Filtre HEPA en ligne vers pompe à vide | LABCONCO | 7386500 | |
| Méthanol, qualité HPLC | Fisher Chemical | ; 67-56-1 | |
| Adaptateur de diapositive MTP II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Température de coupe optimale (OCT) composé | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, désinfectant et nettoyant | CONTEC | CR85335 ; | |
| Lames imprimées en PTFE (téflon), Microscopie électronique Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Pompe à vide à palettes rotatives RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Lames de microtome jetables à profil haut | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Tube à vide transparent | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 huile de pompe | à vide Edwards | H11025011 | |
| Transformateur de tension variable | Powerstat | ||
| Water, adapté pour HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Fiole de Dewar à large ouverture | Sigma Aldrich | Z120790 |
Références
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
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